专利名称：柯萨奇病毒a16型rt-lamp核酸检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物检测技术应用领域，具体地说涉及柯萨奇病毒A16各种标本(粪便、肛拭、咽拭、疱疹液、脑脊液)核酸检测用引物及试剂盒。
背景技术：
柯萨奇病毒A16 ((Coxsackievirus A16，简称CA16)为单股正链RNA病毒，属于小 RNA 病毒科(Picoranviridae)。CA16 与肠道病毒 71 型(Enterovirus 71，EV71)同为儿童手足口病(hand-foot-mouth disease, HFMD)的两大主要病原。EV71感染除引起HFMD外还可引起较为严重的并发症，如无菌性脑炎、脑膜炎、肺水肿等，相对EV71而言，CA16感染引起的HFMD症状较温和，合并症的发生率也较低，由于其亚临床感染常常被忽略。但近年越来越多的报道指出，CA16感染可能与心肌炎、心包炎难治性休克等致死性并发症的发生有关，个别地区还有引起成人致死性肺炎的报道，世界上许多国家和地区也曾报道CAieK 致手足口病的流行，且每隔3-5年有一次大流行，日本、马来西亚、台湾、新加坡都有CA16引起手足口病暴发发流行的报道。日本1981-2007年手足口病的流行和新加坡2001-2007年手足口病的流行均是由CA16、CA16地方变异株和肠道病毒71型交替出现引起，因此，CA16 感染应受到重视。手足口病于2008年5月2日已被中国卫生部纳入传染病防治法规定的丙类传染病进行管理。目前，经典的检测肠病毒的方法多采用细胞分离培养、特异性抗体检测，该方法步骤烦琐，检测周期长，而且一些肠道病毒难以在细胞中进行增殖，容易出现漏检；基于CA16核酸扩增的分子生物学诊断技术如PCR、RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR(real-time fluorescent RT-PCR)等在病原微生物的检测以及疫病诊断方面发挥着重大作用，但这些方法或者需要精密控温设备和高级复杂的分析仪器，或者对操作人员的熟练度和专业水平要求比较高，且反应时间长，不利于现场样品的检测，不利于在基层推广，无法满足简单、快速、准确诊断的要求；而疫病的防控和治疗的关键在于对病原微生物的快速、准确、及早的检测并确诊。因此，建立一种快速、准确的新型诊断技术对于疫病的诊断就显得尤为重要。环介导等温扩增技术(LAMP)是由Notomi等于2000年报道的一种新型核酸扩增技术，它针对目的基因的6个区域设计4条引物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)在等温(60 65°C )的条件下高效、特异、快速的扩增目的基因。目前， LAMP技术已经被广泛应用病原微生物的诊断中，包括人类致病细菌和病毒，动植物病毒和寄生虫的检测。
发明内容
本发明目的在于提供一种用于柯萨奇病毒A16型RT-LAMP检测的引物组和试剂盒，以能够简单、快速、准确地检测样品中是否含柯萨奇病毒A16型，满足目前对手足口病现场检测的需要。本发明提供的用于检测柯萨奇病毒A16型的RT-LAMP引物组，包括四条引物，所述四条引物的核苷酸序列为F3 :AGGAGACAGCCATTGGGAA ；B3 :ACTGCAGTAATTGGGGGACT ；FIP :GTTCTGTGTACCCGTGGTGGG-TTTCTTTAGCCGTGCTGGTT ；BIP :TGCTCAATTACGGCGCAAATGC-GCTTGGCTACGACAAATGTG。本发明提供的柯萨奇病毒A16型的RT-LAMP检测试剂盒，包括上述RT-LAMP引物组。本发明提供的一种柯萨奇病毒A16型的RT-LAMP检测试剂盒，包括含有上述RT-LAMP引物组的RT-LAMP反应液，23 μ 1所述RT-LAMP反应液的配置为IOX buffer2. 5μ l,25mM MgCl2 6 μ 1, IOmM each dNTPs 3. 5μ1，5Μ Betaine 4 μ l,5U/y IAMV 逆转录酶 0· 5μ 1，8υ/μ 1 Bst DNA polymerase 1 μ 1, EDPC H2O 2· 5 μ 1，40 μ M 所述 FIP 1μ 1，40μΜ 所述 BIP 1口1，10口] 所述卩3 0. 5 μ 1，10 μ M 所述 Β3 0. 5μ1。上述试剂盒还可以包括10000XSTOR Green I染料。上述试剂盒的最佳检测反应条件是63°C恒温反应60min，80°C反应5min。操作时只需将RT-LAMP反应液和待检RNA混勻，63°C恒温反应60min即可完成逆转录和扩增过程， 80V反应5min使酶灭活，反应结束后结果判断可取扩增产物电泳检测，或者在扩增产物管内加入STOR Green I荧光染料，根据反应液颜色的变化来判定结果。与现有的CA16RT-PCR、Real-time RT-PCR相比，本发明 CA16 RT-LAMP 以待检样品 RNA为摸板，只需一步就可以完成在等温环境中的循环置换扩增反应，省略了单独的逆转录步骤和模板的变性、退火和延伸反应过程中温度变化的耗时，而且在恒温水浴锅中就能进行，不需要复杂的仪器，最后用电泳检测或加荧光染料后肉眼或紫外灯下就可以观察结果， 具有操作方法简单、检测快速、结果易于判断、成本低等特点。同时，本发明CA16RT-LAMP特异性好，灵敏度高。因此，本发明试剂盒及其CA16RT-LAMP检测技术能较好满足目前对手足口病现场检测的迫切需要，可用于疾病预防控制机构、医院、托幼机构的现场快速检测，易于在基层单位大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
图 1 是 CA16RT-LAMP、RT-PCR、Real-time RT-PCR 灵敏度实验的结果图；其中，图I-A是CA16RT-LAMP产物加染料后在可见光下观察的结果(上排Al)和紫外光下观察的结果(下排A2)，图中，1-8 分别为100TCID50标准品10°，10-1，10_2，10_3，10_4，10_5， 10、10_7梯度稀释后提取RNA的RT-LAMP产物，9 阴性对照；图 I-B 是 CA16RT-LAMP 产物电泳条带，图中，M :DL2000Marker (100，250，500，750， 1000，2000bp)，1-8 分别为 100TCID50 标准品 10。，10、IO"2, IO"3, IO"4, IO"5, IO"6,10_7 梯度稀释后提取RNA的RT-LAMP产物，9 阴性对照；图I-C是CA16RT-PCR灵敏度实验的结果图，图中，M :DL2000Marker，1_8 分别为 100TCID50 标准品 10°，ΚΓ1，1(Γ2，1(Γ3，1(Γ4，1(Γ5，1(Γ6，1(Γ7 梯度稀释后提取 RNA 的 RT-PCR 产物，9:阴性对照；图I-D是CA16RT-PCR Real-time灵敏度实验的结果图；图2是CA16RT-LAMP技术引物特异性实验的结果图；其中，
图2-A是LAMP产物加染料后在可见光下观察的结果(上排Al)和紫外光下观察的结果(下排A2)，图中，1-9 :CA16病毒，10-14 :EV71病毒，15-17 灭活的脊髓灰质炎病毒 Polio I、Polio II, PolioIII,18-19 轮状病毒，20-21 诺如病毒，22 阴性对照；图 2-B 是 LAMP 产物电泳条带，图中，M :DL2000Marker, 1-9 :CA16 病毒，10-14 EV71病毒，15-17 灭活的脊髓灰质炎病毒Polio I.Polio II、PolioIII，18-19 轮状病毒， 20-21 诺如病毒，22 阴性对照；图3是CA16RT-LAMP技术扩增产物特异性实验的结果图，图中，M :DL2000Marker, 1-9 分别是图2-B中9株CA16阳性RT-LAMP产物的酶切产物；图4是CA16RT-LAMP方法的可重复性检测实验的结果图；其中，图4-A是LAMP产物加染料后在可见光下观察的结果(上排Al)和在紫外光下观察的结果(下排々2)，图中，1，3，5，7:分别为0416阳性标准品的四次重复，2，4，6，8:分别为 1,3,5,7四次重复性实验的阴性对照；图4-B是LAMP产物电泳图，其中，M :DL2000Marker, 1,3,5,7 分别为CA16阳性标准品的四次重复，2，4，6，8 分别为1，3，5，7四次重复性实验的阴性对照。
具体实施例方式下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。LAMP引物的设计和合成根据GenBank公布的CA16 VPl基因序列，利用生物软件CLAST分析其相对保守区， 利用 LAMP 在线设计软件 PrimerExplorer V4 (http //primerexplorer. jp/e/)针对相对保守序列区设计了 4条引物，两条外引物FIP (F2+F1C)和BIP (B2+B1C)，两条内引物F3和B3， 分别与靶序列中6个结合区匹配，在利用Oligo 6软件和BLAST对引物进行评价。引物序列为F3 (正向内弓丨)5，-AGGAGACAGCCATTGGGAA-3，B3 (反向内弓丨)5，-ACTGCAGTAATTGGGGGACT-3，FIP(F1C+F2，正向外引)GTTCTGTGTACCCGTGGTGGG-TTTCTTTAGCCGTGCTGGTTBIP(B1C+B2，反向外引)TGCTCAATTACGGCGCAAATGC-GCTTGGCTACGACAAATGTGF2 :5， -TTTCTTTAGCCGTGCTGGTT-3，FlC :5’ -GTTCTGTGTACCCGTGGTGGG-3’B2 :5’ -GCTTGGCTACGACAAATGTG-3’BlC :5，-TGCTCAATTACGGCGCAAATGC-3，RNA 的提取病毒样品RNA 的抽提使用 High Pure viral RNA kit (Roche，Germany)，步骤按其操作说明书进行，病毒细胞培养物和疱疹液按上述方法直接提取；粪便样品、肛拭子和咽喉拭子需经过预处理，在抽提前需加Hank’ Balanced Salt Solution，其中，0. Ig粪便样品 (100 μ 1液态)加Iml Hank，s液，然后将悬液8000rpm离心5min,取200 μ 1上清液进行 RNA 抽提，用 50μ1 Elution Buffer 洗脱，于一 80°C保存。
CA16RT-LAMP扩增方法的津立1、CA16RT-LAMP 反应体系以待检样品RNA为模板，进行RT-LAMP反应。CA16RT-LAMP 反应体系
权利要求
1.一种用于检测柯萨奇病毒A16型的RT-LAMP引物组，其特征在于，包括四条引物，所述四条引物的核苷酸序列为F3 :AGGAGACAGCCATTGGGAA ；B3 :ACTGCAGTAATTGGGGGACT ；FIP :GTTCTGTGTACCCGTGGTGGG-TTTCTTTAGCCGTGCTGGTT ；BIP :TGCTCAATTACGGCGCAAATGC-GCTTGGCTACGACAAATGTG。
2.—种柯萨奇病毒A16型的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的 RT-LAMP引物组。
3.一种柯萨奇病毒A16型的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括含有权利要求1 所述RT-LAMP引物组的RT-LAMP反应液，23 μ 1所述RT-LAMP反应液的配置为10 Xbuffer 2. 5 μ l,25mM MgCl2 6 μ 1, IOmM each dNTPs 3. 5μ1，5Μ Betaine4 μ 1，5U/μ 1 AMV 逆转录酶 0· 5μ 1，8υ/μ 1 Bst DNA polymerase 1 μ 1, EDPC Η202· 5 μ 1，40 μ M 所述 FIP 1 μ 1, 40 μ M 所述 BIP 1μ1，10μΜΚ $Ρ3 0· 5 μ 1，10 μ M 所述 Β3 0·5μ1。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括10000XSTOR Green I染料。
5.如权利要求2-4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测反应条件是 63°C恒温反应 60min，80°C反应 5min。
全文摘要
本发明涉及生物检测技术应用领域，特别涉及一种柯萨奇病毒A16型RT-LAMP核酸检测试剂盒，所述试剂盒包括含四条RT-LAMP引物的RT-LAMP反应液，进一步还可包括10000X SYBR Green I染料。具有特异性好、灵敏度高、操作方法简单、检测快速、结果易于判断、成本低等特点，能较好满足目前对手足口病现场检测的迫切需要，可用于疾病预防控制机构、医院、托幼机构的现场快速检测，易于在基层单位大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
文档编号C12Q1/70GK102373293SQ201010253848
公开日2012年3月14日 申请日期2010年8月13日 优先权日2010年8月13日
发明者何雅青, 宗文萍, 胡贵方 申请人:何雅青, 宗文萍, 胡贵方