专利名称：用于检测南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒是否侵染宿主的rt-pcr方法
用于检测南芥菜花叶病毒1菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒是否侵染宿主的RT—PCR方法技术领域
本发明涉及病毒物种检测技术，具体涉及南芥菜花叶病毒1菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒是否侵染宿主的快速检测技术。
背景技术：
南芥菜花叶病毒(ArabiS m。SaiC ViruS，ArMV)1菜豆黄花叶病毒(Bean yell。Wm。SaiC ViruS，BYMV)和百合无症病毒(Lily SymptomleSS ViruS，LSV)三种病毒是侵染百合和唐菖蒲的主要病原物，给种植者带来较大的经济损失。南芥菜花叶病毒寄主范围广泛，可以侵染约174属215种植物，自然侵染并危害多种花卉1瓜类1豆类和果树，引起花叶1黄化褪绿1矮化1皱缩甚至坏死等症状，为我国规定的进境植物检疫性有害生物。BYMV病毒寄主广泛，主要寄主为唐菖蒲等观赏植物和豆科植物。受BYMV侵染的唐菖蒲幼苗生长势减弱，叶片出现白色碎斑，花杂色，导致切花质量下降，种球产量减少，而受BYMV侵染的蚕豆，种传率4％一17％，田间发病率可高达67％一lOO％，造成59％一96％的产量损失。百合受LSV的侵染率高达73％，其单独侵染时一股无明显症状，在自然条件下常与其它病毒复合侵染，导致百合叶片严重花叶和整株矮化，影响百合的产量和商业价值。
工作人员利用实时RT—PCR检测技术对侵染百合和唐菖蒲的三种主要病原物(南芥菜花叶病毒1菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒)检测时，需要做三次检测实验，速度慢，因此需要改进。发明内容
本发明所要解决的是南芥菜花叶病毒1菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒是否侵染宿主的检测速度慢的技术问题。
解决上述问题采用如下技术方案用于检测南芥菜花叶病毒1菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒是否侵染宿主的RT—PCR方法，包括如下步骤
a1从寄主上抽提出待检测病毒的总RNA；
b1以RNA溶液作为模板，进行RT—PCR反应，得到PCR产物；在RT—PCR反应体系中包括引物；其中引物共三组，分别为ArMV引物1BYMV引物和LSV引物，分别具有如下序列
ArMV上游弓!物5’ 一CAAGTTTCTGACTATCCCACC一3’，
ArMV刀<．游弓!物5’ 一TTC(2AAATCCCACATTACCT一3’，
BYMV上游弓!物5’ 一AA(CCACCA(2AA(；ATGACA一3’，
BYMV下游弓!物5’ 一GACGGATACTCTAAATACGAACA一3’。
LSV上游弓!物5’ 一ATGAAGGTTGGCGTCGTA一3’，
LSV刀<．游弓!物5’ 一TATTCGGTTTCCTGGCTC一3’，[OO14] ArMV引物1BYMV引物1LSV引物分别根据南芥菜花叶病毒1菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒的高度保守衣壳蛋白基因序列设计，并且引物间不互作；
C、对PCR产物进行电泳；
d、观察电泳结果是否显示阳性；
e、根据观察结果是否显示阳性，判断寄主是否被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病 毒或百合无症病毒侵染，阳性表示寄主已经被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒或百合无 症病毒侵染，反之阴性表示寄主没有被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒或百合无症病毒 侵染。
进一步的，e步骤还包括将观察结果与南芥菜花叶病毒阳性对照、菜豆黄花叶病毒 阳性对照和百合无症病毒阳性对照进行对照的步骤；其中，
南芥菜花叶病毒阳性对照是以南芥菜花叶病毒的RNA为模板、经引物扩增得到的 具有691bp的扩增产物，具有如下序列
CAAGTTTCTGACTATCCCACCACTGGAATATGACCTGAGTACTACCAGTGCCTA
CAAAAGTGTGTCCCTTCTTTTGGGCCAAACTCTTGTTGATGGGACTCATAAAG
TGTATAATTATAATAATACACTTTTGAGTTACTATCTTGGTGTTGGTGGTGTGGT
CAAGGCAAAGTGCATATATGTAGCCCTTGTACTTATGGCATAGTCCTAAGAGTT
GTTAGTGAATGGAATGGGGTCACTAACAACTGGAATCAACTGTTTAAATACCC
CGGGTGTTATATCGATGAGGATGGGAATTTTGAAATTGAAATTCTTCCCCATATC
ATCGAACTCCACTGCGCTTACTGGATGGACAGGCAGCGAGCTCTTTCACGAGC
ACGTGAATTTCTATGCAATTTCGGGGCCAATTGCCCCGAGTGGAGAAACTGCT
AAGATGCCAGTGGTAGTGCAAATTGACGAAATTGCATTACCAGATCTTTCCGTC
CCGACTTTCCCTAATGATTATTTTCTTTGGGTGGACTTTTCTGCTTTCACTGTTG
ATACAGAAGAGTATGTAATAGGGTCGAGGTTTTTTGATATTTCCTCTACCACTA
GTACTGTCGCCCTGGGAGATAATCCTTTTGCCCACATGATAGCTTGTCATGGGC
TCCATTGCGGAGTTCTTGATCTTAAGGTAATGTGGGATTTGGAA
菜豆黄花叶病毒阳性对照是以菜豆黄花叶病毒的RNA为模板、经引物扩增得到的 具有592bp的扩增产物，具有如下序列
AACCCACCACAAGATGACATTTCAAATGTTATAGCAACACAAGCACAGTTTGA
AGCATGGTACAATGGTGTCAAACAAGCATATGAGGTTGAAGATTCAACAGATG
GGAATTATTCTGAATGGCCTTATGGTGTGGTGCATAGAGAATGGCACATCAGGA
GATTTACAAGGTGAATGGACAATGATGGATGGAGAGGAGCAGGTGACATACCC
TTTAAAACCTATCTTGGACAATGCATAAGCCAACATTCCGCCAAATAATGTCAC
ATTTCTCGGAAGTTGCGGAAGCACCTACATTGGAAAAGCGAGGAATGCAACA
GAGAGGTACATGCCACGGTATGGGCTTCAGAGGAACCTAACTGAATTATGGGC
TTGGCTAGATATGCTTTTGACTTCTACAAGCTGACTTCAAAAACTCCTGTACGT
GCTAGGGAAGCACACATCGCAAATGAAGGCGGCAGCAGTTAGGGGCAAGTCA
ACCCGATTATTTGGACTTGATGGCAATGTTGGAACAGACGAGGAGAACACAG
AGAGACACACAGCAGGAGATGTCAATCGTGATATGCACACCATGCTTGGTGTT
CGTATTTAG
百合无症病毒阳性对照是以百合无症病毒的RNA为模板、经引物扩增得到的具有 521bp的扩增产物，具有如下序列
ATGAAGGTTGGCGTCGTATCTAACAACATGGCAACCACTGAACAAATGGCCAA
GATAGCGTCAGACATTGCAGGGCTTGGGGTACCAACGGAGCACGTCGCATCA
GTAATATTGCAAATGGTCATCATGTGTGCTTGCGTGAGCAGTTCGGCGTTCCTT
GACCCTGAGGGCAGCATTGAGTTTGAGAATGGAGCGGTGCCCGTCGACTCCAT
CGCTGCGATCATGAAGAAGCACGCTGGACTGCGGAAAGTCTGCCGGCTCTATG
CCCCTATCGTGTGGAACAGCATGCTTGTGCGAAATCAACCACCAGCTGATTGG
CAAGCTATGCGCTTCCAATACAACACGCGGTTCGCAGCTTTCGACACCTTCGA
CTACGTGACTAACCAGGCGGCTATCCAACCTGTCGAGGGGATCATCAGGCGAC
CCACTTCTGCTGAGGTCATAGCCCACAACGCGCACAAGCAATTAGCCCTGGAT
AGGTCAAACCGCAATGAGCGTCTGGGGAGCCAGGAAACCGAATA。
进一步的，步骤d还包括将观察结果与阴性对照进行比较的步骤；阴性对照用于 检验试验操作有无问题，通常阴性对照应没有扩增；如果有扩增，说明操作过程受污染，需 要重做试验；阴性对照是以健康植物的RNA为模板、进行RT-PCR反应得到的产物。
进一步的，所述检测方法还包括将RT-PCR反应体系与空白对照进行对照的步骤， 空白对照用于检验操作有无问题，通常空白对照没有扩增；如果有扩增，说明试剂已收污 染，需重做试验；空白对照以蒸馏水为模板、进行RT-PCR反应制得的产物。
进一步的，所述RT-PCR反应扩增循环次数为30次。
进一步的，b步骤中，RNA溶液浓度不低于总RNA浓度的10—1倍。
本发明的有益效果本发明提供的多重RT-PCR检测方法能实现对寄主(百合、唐 菖蒲)是否被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒或百合无症病毒侵染的快速检测。根据南 芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒的高度保守衣壳蛋白基因序列设计，且相 互间不互作的特异引物能确保检测具有很高的敏感性和特异性。三种病毒的多重检测能实 现侵染百合和唐菖蒲的三种病毒的一次性同步检测，检测程序简便、快速高效。
图1是本发明一个实施例的多重RT-PCR检测结果示意图。
具体实施方式
本发明采用多重RT-PCR检测技术实现对多种病毒的检测。根据南芥菜花叶病毒、 菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒的RNA，设计特异性的引物，并借助引物，对从待检测病毒 中抽提出的总RNA进行RT-PCR反应，电泳PCR产物，根据电泳结果显示阳性与否，判断待检 测病毒中是否含有南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒或百合无症病毒，从而判断寄主是否 被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒或百合无症病毒侵染。
1、引物的设计
ArMV(南芥菜花叶病毒)的引物设计根据衣壳蛋白部分的特异保守序列，设计 ArMV引物；引物序列如下
ArMV 上游引物5 ‘ -CAAGTTTCTGACTATCCCACC-3 ‘，
ArMV 下游引物5' -TTCCAAATCCCACATTACCT-3 ‘。
BYMV(菜豆黄花叶病毒)的引物设计根据衣壳蛋白部分的特异保守序列，设计BYMV引物；引物序列如下
BYMV 上游引物5 ‘ -AACCCACCACAAGATGACA-3 ‘，
BYMV 下游引物5 ‘ -GACGGATACTCTAAATACGAACA-3 ‘。
LSV(百合无症病毒)的引物设计根据衣壳蛋白部分的特异保守序列，设计LSV 引物；引物序列如下
LSV 上游引物5 ‘ -ATGAAGGTTGGCGTCGTA-3 ‘，
LSV 下游引物5 ‘ -TATTCGGTTTCCTGGCTC-3 ‘。
ArMV引物、BYMV引物、LSV引物相互间不互作。
2、多重RT-PCR反应体系及程序
反应体系总体积为20 μ L。其中 IOXOne Step RNA PCR Buffer 2 μ L, MgCl2 (25mmol/L)4 μ L，dNTP Mixture(lOmmol/L)2 μ L,RNase Inhibitor (40U/μ L)0. 4 μ L， AMV ReverseTranscriptase XL(5U)0. 4μ L, AMV-Optimized Taq (5U) 0. 4 μ L, ArMV> BYMV 和LSV的上游引物(ΙΟμπιοΙ/L)，下游引物(10ymol/L)各为1.4yL, RNA模板为0. 2 μ L, RNaseFree dH20 0· 6 μ L0
反应程序42°C反转录1小时；94°C预变性30秒；94°C变性30秒，57 °C退火30秒， 72°C延伸1分钟，循环30次；72°C延伸10分钟。
3、阳性对照
分别以已知ArMV (南芥菜花叶病毒)、BYMV (菜豆黄花叶病毒)和LSV (百合无症 病毒)的总RNA作为模板，分别采用ArMV引物、BYMV引物、LSV引物，进行RT-PCR反应，扩 增循环30次，扩增得到长度为691bp的南芥菜花叶病毒阳性对照、长度为592bp的菜豆黄 花叶病毒阳性对照和长度为521bp百合无症病毒阳性对照。
4、空白对照和阴性对照
阴性对照是质量控制方法，就是用健康植物中抽提的RNA作为模板，进行RT-PCR 反应其余条件同待测、阳性对照、空白对照都一样。目的是检验试验操作有无问题，通常阴 性对照应没有扩增；如果有扩增，说明操作过程受污染，需要重做试验。
空白对照是质量控制的方法，是用蒸馏水做模板，进行RT-PCR反应，其余条件同 待测、阳性对照、阴性对照都一样。目的是检验操作有无问题，通常空白对照没有扩增；如果 有扩增，说明试剂已受污染，需重做试验。
设置评估RT-PCR反应是否处于正常状态的空白对照和阴性对照。
实施例1
采用多重RT-PCR对待检测标本A(唐菖蒲叶片)进行南芥菜花叶病毒、菜豆黄花 叶病毒和百合无症病毒侵染检测
对待检测标本A(唐菖蒲叶片)进行检测，具体包括如下步骤
步骤a、从待检测标本A (唐菖蒲叶片)上抽提出待检测病毒的总RNA ；
步骤b、将总RNA稀释成10—1倍RNA溶液；
步骤C、以10-1倍RNA溶液作为模板，进行RT-PCR反应，扩增循环30次，扩增得到 PCR产物；在RT-PCR反应体系中，引物共三组，分别为ArMV引物、BYMV引物和LSV引物，分 别具有如下序列
ArMV 上游引物5 ‘ -CAAGTTTCTGACTATCCCACC-3 ‘，
ArMV 下游引物5' -TTCCAAATCCCACATTACCT-3 ‘，
BYMV 上游引物5 ‘ -AACCCACCACAAGATGACA-3 ‘，
BYMV 下游引物5 ‘ -GACGGATACTCTAAATACGAACA-3 ‘。
LSV 上游引物5 ‘ -ATGAAGGTTGGCGTCGTA-3 ‘，
LSV 下游引物5 ‘ -TATTCGGTTTCCTGGCTC-3 ‘；
反应体系总体积为20 μ L。其中 IOXOne Step RNA PCR Buffer 2 μ L, MgCl2 (25mmol/L)4 μ L，dNTP Mixture(lOmmol/L)2 μ L,RNase Inhibitor(40U/μ L)0. 4 μ L， AMV ReverseTranscriptase XL(5U)0. 4 μ L,AMV-Optimized Taq (5U)0. 4 μ L，ArMV、BYMV 和 LSV 的上游引物(ΙΟμπιοΙ/L)，下游引物(10ymol/L)各为 1· 4 μ L，ArMV、BYMV 和 LSV 的 RNA 模板各为 0. 2 μ L, RNase Free dH20 0. 6 μ L ；
反应程序42°C反转录1小时；94°C预变性30秒；94°C变性30秒，57 °C退火30秒， 72°C延伸1分钟，循环30次；72°C延伸10分钟；
步骤d、对RT-PCR产物进行电泳；
步骤e、多重RT-PCR检测结果如图1所示，图中1 IOObp DNA Ladder Marker, 2 空白对照，3 阴性对照，4 =ArMV,BYMV和LSV多重RT-PCR检测结果(LSV、BYMV和ArMV扩增 片段大小分别为521bp、592bp和691bp)，5 =ArMV阳性对照的检测结果，6 =BYMV阳性对照的 检测结果，7 :LSV阳性对照的检测结果，8 :100bp DNA Ladder Marker ；即第4泳道三种病毒 的检测结果为阳性、第5泳道ArMV阳性对照、第6泳道BYMV阳性对照、第7泳道LSV阳性 对照的检测结果均为阳性，而空白对照和阴性对照的检测结果为阴性。
步骤f·、判断结果显示为阳性，故待检测病毒是否包含南芥菜花叶病毒、菜豆黄 花叶病毒或百合无症病毒，即待检测标本A (唐菖蒲叶片)被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶 病毒或百合无症病毒侵染。
对比例1
采用DAS-ELISA检测方法对待检测标本A (唐菖蒲叶片)进行南芥菜花叶病毒、菜 豆黄花叶病毒和百合无症病毒侵染检测
采用DAS-ELISA检测方法、分三次分别对待检测标本A (唐菖蒲叶片)进行南芥菜 花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒侵染检测，最终检测结果为待检测标本A (唐菖 蒲)同时被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒侵染，检测结果与实施例1检 测结果相同，但DAS-ELISA检测方法繁琐复杂。
采用与实施例1基本相同的检测方法对待检测标本B 0进行检测，同时用 DAS-ELISA检测方法校对，寄主、RNA溶液浓度、目的扩增片段大小、空白对照、阴性对照、检 测结果、侵染与否、DAS-ELISA检测结果、结论等参数如下表1所示。
表 权利要求
1.一种用于检测南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒是否侵染宿主的 RT-PCR方法，其特征在于，包括如下步骤a、从寄主上抽提出待检测病毒的总RNA；b、以RNA溶液作为模板，进行RT-PCR反应，扩增得到PCR产物；在RT-PCR反应体系中 包括引物；其中引物共三组，分别为ArMV引物、BYMV引物和LSV引物，分别具有如下序列ArMV 上游引物5 ‘ -CAAGTTTCTGACTATCCCACC-3 ‘， ArMV 下游引物5 ‘ -TTCCAAATCCCACATTACCT-3 ‘， BYMV 上游引物5 ‘ -AACCCACCACAAGATGACA-3 ‘， BYMV 下游引物5 ‘ -GACGGATACTCTAAATACGAACA-3 ‘， LSV 上游引物5 ‘ -ATGAAGGTTGGCGTCGTA-3 ‘， LSV 下游引物5 ‘ -TATTCGGTTTCCTGGCTC-3 ‘，ArMV引物、BYMV引物、LSV引物分别根据南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症 病毒的高度保守衣壳蛋白基因序列设计，并且引物间不互作； C、对PCR产物进行电泳；d、观察电泳结果是否显示阳性；e、根据观察结果是否显示阳性，判断寄主是否被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒或 百合无症病毒侵染，阳性表示寄主已经被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒或百合无症病 毒侵染，反之阴性表示寄主没有被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒或百合无症病毒侵染。
2.根据权利要求1所述的用于检测南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒 是否侵染宿主的RT-PCR方法，其特征在于，步骤d还包括将观察结果与南芥菜花叶病毒阳 性对照、菜豆黄花叶病毒阳性对照和百合无症病毒阳性对照进行比较的步骤。
3.根据权利要求2所述的用于检测南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒 是否侵染宿主的RT-PCR方法，其特征在于，南芥菜花叶病毒阳性对照是以南芥菜花叶病毒的RNA为模板、经引物扩增得到的具有 691bp的扩增产物，具有如下序列CAAGTTTCTGACTATCCCACCACTGGAATATGACCTGAGTACTACCAGTGCCTACAAAAGTGTGTCCCTTCTTTTGGGCCAAACTCTTGTTGATGGGACTCATAAAGTGTATAATTATAATAATACACTTTTGAGTTACTATCTTGGTGTTGGTGGTGTGGTCAAGGCAAAGTGCATATATGTAGCCCTTGTACTTATGGCATAGTCCTAAGAGTTGTTAGTGAATGGAATGGGGTCACTAACAACTGGAATCAACTGTTTAAATACCCCGGGTGTTATATCGATGAGGATGGGAATTTTGAAATTGAAATTCTTCCCCATATCATCGAACTCCACTGCGCTTACTGGATGGACAGGCAGCGAGCTCTTTCACGAGCACGTGAATTTCTATGCAATTTCGGGGCCAATTGCCCCGAGTGGAGAAACTGCTAAGATGCCAGTGGTAGTGCAAATTGACGAAATTGCATTACCAGATCTTTCCGTCCCGACTTTCCCTAATGATTATTTTCTTTGGGTGGACTTTTCTGCTTTCACTGTTGATACAGAAGAGTATGTAATAGGGTCGAGGTTTTTTGATATTTCCTCTACCACTAGTACTGTCGCCCTGGGAGATAATCCTTTTGCCCACATGATAGCTTGTCATGGGCTCCATTGCGGAGTTCTTGATCTTAAGGTAATGTGGGATTTGGAA 菜豆黄花叶病毒阳性对照是以菜豆黄花叶病毒的RNA为模板、经引物扩增得到的具有 592bp的扩增产物，具有如下序列AACCCACCACAAGATGACATTTCAAATGTTATAGCAACACAAGCACAGTTTGAAGCATGGTACAATGGTGTCAAACAAGCATATGAGGTTGAAGATTCAACAGATGGGAATTATTCTGAATGGCCTTATGGTGTGGTGCATAGAGAATGGCACATCAGGAGATTTACAAGGTGAATGGACAATGATGGATGGAGAGGAGCAGGTGACATACCCTTTAAAACCTATCTTGGACAATGCATAAGCCAACATTCCGCCAAATAATGTCACATTTCTCGGAAGTTGCGGAAGCACCTACATTGGAAAAGCGAGGAATGCAACAGAGAGGTACATGCCACGGTATGGGCTTCAGAGGAACCTAACTGAATTATGGGCTTGGCTAGATATGCTTTTGACTTCTACAAGCTGACTTCAAAAACTCCTGTACGTGCTAGGGAAGCACACATCGCAAATGAAGGCGGCAGCAGTTAGGGGCAAGTCAACCCGATTATTTGGACTTGATGGCAATGTTGGAACAGACGAGGAGAACACAGAGAGACACACAGCAGGAGATGTCAATCGTGATATGCACACCATGCTTGGTGTTCGTATTTAGj百合无症病毒阳性对照是以百合无症病毒的RNA为模板、经引物扩增得到的具有 521bp的增产物，具有如下序列ATGAAGGTTGGCGTCGTATCTAACAACATGGCAACCACTGAACAAATGGCCAAGATAGC GTCAGACATTGCAGGGCTTGGGGTACCAACGGAGCACGTCGCATCAGTAATATTGCAAA TGGTCATCATGTGTGCTTGCGTGAGCAGTTCGGCGTTCCTTGACCCTGAGGGCAGCATT GAGTTTGAGAATGGAGCGGTGCCCGTCGACTCCATCGCTGCGATCATGAAGAAGCACGC TGGACTGCGGAAAGTCTGCCGGCTCTATGCCCCTATCGTGTGGAACAGCATGCTTGTGC GAAATCAACCACCAGCTGATTGGCAAGCTATGCGCTTCCAATACAACACGCGGTTCGCA GCTTTCGACACCTTCGACTACGTGACTAACCAGGCGGCTATCCAACCTGTCGAGGGGAT CATCAGGCGACCCACTTCTGCTGAGGTCATAGCCCACAACGCGCACAAGCAATTAGCCC TGGATAGGTCAAACCGCAATGAGCGTCTGGGGAGCCAGGAAACCGAATA。
4.根据权利要求1、2、3任意一项所述的用于检测南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒 和百合无症病毒是否侵染宿主的RT-PCR方法，其特征在于，步骤d还包括将观察结果与阴 性对照进行比较的步骤；阴性对照用于检验试验操作有无问题，通常阴性对照应没有扩增； 如果有扩增，说明操作过程受污染，需要重做试验。
5.根据权利要求4所述的用于检测南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病 毒是否侵染宿主的RT-PCR方法，其特征在于，阴性对照是以健康植物的RNA为模板、进行 RT-PCR反应扩增得到的产物。
6.根据权利要求1、2、3任意一项所述的用于检测南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和 百合无症病毒是否侵染宿主的RT-PCR方法，其特征在于，所述检测方法还包括将RT-PCR反 应体系与空白对照进行比较的步骤，空白对照用于检验操作有无问题，通常空白对照没有 扩增；如果有扩增，说明试剂已受污染，需重做试验。
7.根据权利要求6所述的用于检测南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒 是否侵染宿主的RT-PCR方法，其特征在于，空白对照以蒸馏水为模板、进行RT-PCR反应扩 增得到的产物。
8.根据权利要求1、2、3任意一项所述的用于检测南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和 百合无症病毒是否侵染宿主的RT-PCR方法，其特征在于所述RT-PCR反应扩增循环次数为 30次。
9.根据权利要求1、2、3任意一项所述的用于检测南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和 百合无症病毒是否侵染宿主的RT-PCR方法，其特征在于b步骤中，RNA溶液浓度不低于总 RNA浓度的10-1倍。
10.南芥菜花叶病毒的引物，其特征在于，上游引物和下游引物分别具有如下序列 上游引物5 ‘ "CAAGTTTCTGACTATCCCACC-3 ‘，下游引物5 ‘ -TTCCAAATCCCACATTACCT-3 ‘。
全文摘要
本发明公开了一种用于南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒是否侵染宿主的RT-PCR方法，本发明根据南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒的RNA，设计出特异性的引物，并借助引物对待鉴定病毒的RNA模板进行RT-PCR反应，并将PCR产物电泳成像，根据PCR产物经电泳后显示结果阳性与否，来实现对宿主是否被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒或百合无症病毒侵染的快速检测。
文档编号C12Q1/70GK102031313SQ201010254348
公开日2011年4月27日 申请日期2010年8月16日 优先权日2010年8月16日
发明者李一农, 杨伟东, 郑耘, 陈富华, 陈枝楠 申请人:深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心