专利名称：胰岛素在制备促进颌骨组织愈合的药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及胰岛素的一种药用用途。具体而言，本发明涉及胰岛素可以作为促进动物颂骨组织愈合的药物。本发明首先将胰岛素作用于颂骨组织的体外培养细胞，促进了颂骨成骨细胞的增殖；其次，本发明将胰岛素局部给药作用于颂骨组织，胰岛素增强了大鼠拔牙窝颂骨组织愈合的能力。
背景技术：
胰岛素由51个氨基酸组成A，B两条肽链，A链含21个氨基酸，B链含30个氨基酸，两条肽链之间借两个二硫键联结，A链的第6与第11位氨基酸之间也有一个二硫键 [Lu H, Kraut D, Gerstenfeld L et al. Diabetes interferes with the bone formation by affecting the expression of transcription factors that regulate osteoblast differentiation. Endocrinology. 2003, 144(1) :346-52.Yuksel, E. ， ffeinfeld. A. B.， Cleek. R. et al. Increased free fat-graft survival with the long-term, local delivery of insulin, insulin-like growth factor—I, and basic fibroblast growth factor by PLGA/PEG microspheres. Plast. Reconstr.Surg 2000,105(5) :1712-1720.]。 人胰岛素分子量为5. 7KD，等电点为pH5. 6。在酸性环境(pH2. 5-3. 5)较稳定，在碱性溶液中易被破坏，可形成锌、钴等胰岛素结晶。又由于其分子中酸性氨基酸较多，可与碱性蛋白如鱼精蛋白等结合，形成分子量大、溶解量低的鱼精蛋白锌胰岛素。此种制剂注入皮下或肌肉吸收较慢，作用时间长，为长效胰岛素。从胰岛分泌的胰岛素，经门脉进入肝脏，40% -50% 在肝内分解，其余进入体循环分布于全身。从静脉注射胰岛素，90%在20min内从血液中消失，绝大部分被组织吸收或被肝脏灭活。胰岛素的生理作用主要为促进合成代谢，主要靶器官是肝脏、脂肪组织、骨骼肌[Krakauer JC, McKenna MJ, Buderer NF, et al. Bone loss and bone turnover in diabetes. Diabetes. 1995,44(7) :775-782. Bouillon R, Bex M, Van Herck E et al. Influence of age, sex, and insulin on osteoblast function osteoblast dysfunction in diabetes mellitus. Clin Endocrinol Metab. 1995,80 (4) 1194-1202. Rosen CJ, Ackert-Bicknell CL, Adamo ML et al. Congenic mice with low serum IGF-I have increased body fat,reduced bone mineral density,and an altered osteoblast differentiation program. Bone. 2004. 35 (5) 1046-1058.]。胰岛素使进食后吸收的葡萄糖大量转化成糖原贮存，抑制糖原异生。在对蛋白质代谢调节方面，胰岛素主要对蛋白质合成和贮存起作用，它通过与受体结合能促进氨基酸转运入细胞，并作用于核糖体，增加核糖核酸和脱氧核糖核酸生成，从而进一步增加蛋白质合成Devlin， H.J. Hoyland, J. F. Newall et al.Trabecular bone formation in the healing of the rodent molar tooth extraction socket. Bone Miner Res.1997,12(12) :2061-2067.]。姨岛素虽然是目前治疗糖尿病的主要药物，但是它分子量大，半衰期短，脂溶性差，不易透过生物膜，易被胃肠道的酶所降解，所以迄今为止胰岛素最为广泛的使用途径是以注射用药为主。采用胰岛素治疗可缓解糖尿病对口腔局部种植体愈合的不利影响，减轻种植体周围因糖尿病而发生的病理变化[Boney,C. Μ.，Moats_Staats，B. Μ· ,Stiles et al. Expression of insulin-like growth factor-1(IGF-I) and IGF-binding proteins during adipogenesis. Endocrinology. 1994,135 :1863-1868. Bouxsein ML, Rosen CJ, Turner CH et al. Generation of a new congenic mouse strain to test the relationships among serum insulin-like growth factor I,bone mineral density,and skeletal morphology in vivo. Bone Miner Res. 2002，17 (4) :570_579.]，增强种植体骨愈合能力成为糖尿病患者牙种植治疗的关键。糖尿病是一种常见的内分泌代谢病，是以胰岛素绝对或相对不足所致的血糖及尿糖增高为主要特征并导致糖、蛋白质和脂肪代谢障碍的全身慢性代谢异常综合症。目前中国糖尿病患者已经达到5000万，占世界糖尿病人群总数的1/5，患病率在印度之后居世界第二，并且以每天至少三千人的速度增加，每年增加超过一百二十万 。2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)是糖尿病的主要类型，占所有糖尿病患者的90%以上。随着经济的发展、社会老龄化，T2DM患病率逐年增高。从世界范围来看，T2DM已成为严重威胁人类健康的慢性病之一。中华医学会糖尿病学分会于2007年6月至2008年5月在全国的14 个省市进行的最新糖尿病的流行病学调查结果显示，城镇糖尿病的患病率已达11. 28%。骨整合的发生是牙科种植体成功的基础，然而高血糖会抑制成骨细胞的分化，还可以对骨基质及其成分产生有害作用，同时影响细胞外基质的粘连、生长、聚集导致糖尿病患者种植体周围出现骨形成障碍。控制血糖最常用最有效的药物就是胰岛素，其生理作用主要为促进合成代谢，胰岛素与细胞结合的程度取决于细胞上的受体数目和其亲和力。受体的数目在正常生理条件下是恒定的，但由于细胞生理状态不同(如生长速度，分化程度， 细胞周期等)和外界环境变化的影响，也会发生一定的改变。胰岛素、胰岛素样生长因子 1 (IGF-D、胰岛素样生长因子2 (IGF-2)及其相应受体IR，IGF-IR和胰岛素样生长因子2受体(IGF-2R)都是属于IGFs系统。研究表明，该系统可能对胚胎、神经、骨骼肌和骨骼的发育、细胞增殖和转化等具有极其重要的作用。颂骨组织是面部重要的骨组织。颂骨组织的而整合发生是牙科种植体成功的基础之一。为此，寻找一种更简便易行的药物促进和骨组织愈合具有重要的意义。目前，胰岛素用于牙囊组织已经用些报道，但是胰岛素直接给药颂骨组织的研究还没有。本发明另辟蹊径，胰岛素仅仅局部给药颂骨组织，发现了胰岛素可以有效的促进颂骨组织成骨细胞愈合。 这为胰岛素的应用开辟了一个新途径。胰岛素作用于糖尿病病人可能会产生胰岛素抵抗， 而局部用药于颂骨组织可以避免胰岛素抵抗的作用，从而促进2型糖尿病病人牙科种植体成功率。此外，由于胰岛素可以体循环分布于全身，从而促进促进合成代谢；本发明采用局部给药，降低了胰岛素给药给予正常人所带来的负面效果，提高了胰岛素在促进颂骨组织成骨细胞增殖的效率。
发明内容
本发明首先提供了胰岛素的一种药用用途。本发明所述胰岛素在制备促进颂骨组织成骨细胞增殖、促进颂骨组织愈合的药物中的用途，包括用细胞生物学实验检测胰岛素促进体外颂骨组织成骨细胞的增殖；胰岛素局部作用于活体动物的颂骨组织，促进颂骨组织的愈合。
本发明所指的胰岛素的药用用途针对的是动物颂骨组织。本发明所述的动物颂骨组织是指颂骨组织在体外培养的成骨细胞以及在动物活体的颂骨组织。本发明提高了胰岛素的效用。本发明采用胰岛素直接作用于颂骨组织，而不是通过静脉注射等其他途径。首先，本发明避免了胰岛素的长期注射而带来的副作用，并为2型糖尿病患者的颂骨组织愈合带来了很大的促进作用。其次，本发明采用局部给药，有效的提高了胰岛素在颂骨组织愈合过程中的效率。
图1各浓度胰岛素组在不同时间对成骨细胞增殖的作用(MTT法)，*与对照组相比P < 0. 05。其中LA为不含胰岛素的L-DMEM(含5. 5mM葡萄糖)，LB为含IOl胰岛素的 L-DMEM ；LC为含1(Γ6Μ胰岛素的L-DMEM ；LD为含1(Γ7Μ胰岛素的L-DMEM。图2各浓度胰岛素组在不同时间对成骨细胞增殖的作用(MTT法)*与对照组相比，P < 0. 05。其中其中HA为不含胰岛素的H-DMEM(含16. 5mM葡萄糖)，HB为含1(Γ5Μ胰岛素的H-DMEM ；HC为含1(Γ6Μ胰岛素的H-DMEM ；HD为含10〃Μ胰岛素的H-DMEM。图3两种大鼠血糖值比较，*ρ < 0. 05。Wistar大鼠与GK大鼠血糖测定经统计学分析存在显著差异，而且一直保持稳定状态。图4GK大鼠尾部血糖在不同时期快速测定结果。G2组在拔牙术前和术后快速测大鼠尾部血糖，血糖变化不明显，没有统计学差异。图5Α图为Wistar大鼠拔牙4周时χ线检查结果；B图为Wistar大鼠未拔牙侧4 周X线检查结果。图6IRmRNA在不同组间拔牙窝愈合7d_28d的变化，*p < 0. 05，**p < 0. 01与对照组比。WN组顶mRNA水平表现为持续下降；GN组则表现为IRmRNA水平在14d达到高峰后开始下降为先升高后降低的趋势Gl组也表现为先升高后降低趋势，21d时达到高峰，随后在28d时降到7d时水平G2组与WN组表现一致，在7-28d过程中持续下降。图7IGF-lRmRNA在不同组间拔牙窝愈合7d_28d的变化，*p < 0. 05，**p < 0. 01 与对照组比。GN、G1组的IGF-IR mRNA水平较低，而且在此过程中改变无明显统计学差异； G2组在7d，14d，21d明显高于其它两组，并在21d时达到峰值；WN组14d，21d显著高于GN、 Gl 组(ρ < 0. 01)。
具体实施例方式实施例1胰岛素对体外培养正常大鼠下颂骨成骨细胞增殖的影响本实施例以SPF级Wistar大鼠为材料，雌雄不限，体重180-220g，6_8周龄。实验方法与步骤1)酶消与组织块相结合的方法培养成年大鼠下颂骨成骨细胞。取Wistar大鼠，断颈处死后，在75%的酒精中浸泡5min ；在无菌超净台中使大鼠仰卧，用碘伏棉签消毒大鼠颈部及口腔，于颈部剪开大鼠皮肤，逐层剥离，暴露下颂骨；无菌取出带有肌肉和筋膜的下颂骨，置于75%酒精中洗5-10seC，5. 25% NaClO中浸泡lmin， PBS(含100IU/ml青霉素、100IU/ml链霉素)反复冲洗3次；拔除牙齿，彻底刮除肌肉、筋膜和牙周组织；将下颂骨用咬骨钳剪碎成约2mmX2mm的骨片，PBS缓冲液反复冲洗至骨碎块呈白色；将骨片置入小培养瓶中，加0. 125%胰蛋白酶在水浴振荡器中37C、150rpm消化 8min,消化6次后终止；收集第2至6次的消化液经200目不锈钢筛网过滤并离心，去除上清后用含20%胎牛血清的L-DMEM(DMEM培养基为DMEM粉13. 4g，加NaHC032g，双蒸去离子水1L，调PH值至7. 0，过滤除菌，分装4°C保存。内含100IU/ml青霉素、100IU/ml链霉素) 重悬细胞；将细胞接种于培养瓶中在37°C、5% CO2、饱和湿度条件下于恒温孵箱中静置培养 40min ；差速贴壁除去成纤维细胞，纯化成骨细胞后继续培养经酶消化后剩下的组织块，再次剪碎至ImmX 1mm，铺于培养瓶中倒置培养，4h后翻瓶。待细胞长满传代。传代时，差速贴壁40min反复纯化成骨细胞。酶消化法和组织块培养法的细胞均于4 换全液，以后每隔4 换半液或1/3换液。倒置显微镜下下严密观察细胞生长状况，待细胞长满瓶底80%后用0. 125%胰酶(含0. 02%EDTA)消化传代培养。 取生长良好的第4代细胞用于实验及细胞功能鉴定。2)颂骨组织成骨细胞鉴定将第4代成骨细胞接种在盖玻片上，培养3w后用95%乙醇固定15min，用Gomori 钙-钴法进行ALP染色。步骤如下固定好的盖玻片经蒸馏水漂洗后，置入孵育液(3% β-甘油磷酸钠5ml，2%戊巴比妥钠5ml，2%硝酸钙10ml，2%硫酸镁5ml，蒸馏水25ml。) 中；37°C孵育2h，自来水冲洗3次；2%硝酸钴中孵育lmin，自来水冲洗；自然干燥，封固。取第4代培养细胞接种于孔底铺有盖玻片的6孔板中，改用含10%新生牛血清的 L-DMEM培养液(其中含有50ug/ml维生素C和lOmmol/L β -甘油磷酸钠)中培养，每3d换液一次，于第21d，镜下见有较多不透明的矿化结节时取出盖玻片，按茜素红S染钙法进行染色。步骤如下培养皿用PBS洗2次，95%酒精原位固定IOmin 茜素红酒精配制，PH8. 3)染色5min ；50%酒精去除非特异性着色；自然干燥。将第4代成骨细胞接种在盖玻片上，培养3w后用95%乙醇固定15min，用Van Gieson法进行I型胶原染色，步骤如下铁苏木素滴染5min，PBS冲洗3次；自来水振荡返蓝IOmin ；苦味酸酸性品红染色5min ；95 %乙醇快速分化；乙醇脱水，二甲苯透明，树脂封片；光学显微镜下观察并摄像。3)细胞爬片的免疫组化染色制作细胞爬片将对照组和糖尿病组第5代细胞以2 X IOVml接种到玻片上，培养 5d后，固定细胞。PBS(0. OlM PBS含0.05%吐温)洗5min，放入湿盒；滴加0.3% Triton X-100，置于37°C孵箱孵育15min ；将爬片上的Triton X-100甩干，PBS振洗，5minX 3次；滴加3% H2O2 (0. Iml 30^H2O2与IOml纯100%甲醇充分混勻，现用现配，37°C孵箱孵育20min ； PBS振洗，5minX3次；滴加适量稀释的抗体，顶α 1与IGF-IRα 1均以1 100稀释，4°C 过夜。37°C复温lh，PBS振洗，5minX3次；滴加SP试剂盒中试剂一液，置于37°C孵箱孵育 IOmin ；PBS振洗，5minX3次；滴加SP试剂盒中试剂二液，置于37°C孵箱孵育IOmin ；PBS振洗，5minX 3次；滴加DAB显色液(Iml蒸馏水加入浓缩DAB液1滴，现用现配)，镜下控制显色；蒸馏水终止显色；苏木素复染anin，水洗，盐酸溶液(70%酒精配制)分化数秒，流动自来水返蓝20min ；乙醇脱水，二甲苯透明，树脂封片；染色强度的判断标准阴性-细胞核或胞质中无着色；弱阳性-细胞核或胞质中出现浅黄色染色颗粒；阳性细胞核或胞质中出现棕黄色染色颗粒；强阳性-细胞核或胞质中出现深棕色染色颗粒。
4)选择胰岛素适宜浓度每组设12个样本将密度为2 X IO4个/ml的细胞接种于96孔板中，细胞融合后换为无血清培养基，次日加入含5%胎牛血清。实验分组5.5mM葡萄糖(5.5mMG)L-DMEM(生理糖浓度)、16. 5mMG(高糖)浓度H-DMEM的培养液配制的不同浓度(0，10_5M，10_6M，10_7M) 胰岛素培养，依次编号为LA，LB, LC, LD ；HA, HB, HC, HD ；继续培养7d，隔日更换药物和培养基；在培养周期的最后4h，每孔加入20 μ 1的ΜΤΤ，继续孵育至结束；加入DMS0，于490nm用酶标仪测吸光度(OD)值。MTT法检测成骨细胞的增殖，确定药物最适浓度。实验结果与讨论1)成骨细胞鉴定碱性磷酸酶染色细胞生长21d后，已完全铺满整个盖玻片，ALP染色可见细胞质内有大量棕色颗粒或块状沉淀。矿化结节染色成骨细胞在维生素C，磷酸甘油钠存在条件下，可使胞外基质矿化，并形成多量矿化结节，经茜素红染色呈红色块状沉淀。I型胶原染色成熟的成骨细胞能合成I型胶原，是成骨细胞标志物之一，胶原染色可见大面积粉红色染色。IR和IGF-IR在成骨细胞上的表达。IR和IGF-IR在成骨细胞上均有表达，均勻分布于成骨细胞的胞浆中。2)糖浓度及胰岛素对于成骨细胞增殖的影响分别给予5. 5mM葡萄糖(5. 5mMG) L-DMEM (生理糖浓度)、16. 5mMG (高糖)浓度 H-DMEM的培养液配制的不同浓度(0，10_5M，10_6M，10_7M)胰岛素培养，依次编号为LA，LB, LC, LD ；HA, HB, HC, HD。成骨细胞在5. 5mMG、16. 5mMG两种培养基中培养，见成骨细胞的增殖在L-DMEM中表现更为活跃，高糖环境抑制成骨细胞的增殖。图1所示为在L-DMEM中不同浓度胰岛素对于成骨细胞增殖的影响，IiT6M与ICT7M浓度的胰岛素都促进成骨细胞的增殖。 图2显示在H-DMEM中胰岛素浓度不同对于成骨细胞增殖的影响，成骨细胞在ICT6M胰岛素浓度中增殖更为活跃。本实验在两种糖浓度下培养了颂骨组织成骨细胞，结果发现高糖环境抑制颂骨组织成骨细胞的增殖，而IO-6M浓度胰岛素可促进颂骨组织成骨细胞的增殖。高血糖改变葡萄糖介导的胰岛素的分泌，这被称为葡萄糖毒性。高浓度的葡萄糖能通过很多途径影响胰岛素，葡萄糖通过调节包括IGF-IR和IR基因在内的许多基因，并且是在转录和翻译两个水平上调节来影响胰岛素的作用；还可通过抑制蛋白激酶C介导的丝氨酸磷酸化和酪氨酸磷酸酶激活的结果来降低 IR 的活性[Berti L, Mosthaf L, Kroder G et al. Glucose-induced translocation of protein kinase C isoforms in rat-1 fibroblasts is paralleled by inhibition of the insulin receptor tyrosine kinase. J Biol Chem. 1994,269(5) 3381-6. Miiller HK, Kellerer M, Ermel B et al. Prevention by protein kinase C inhibitors of glucose-induced insulin-receptor tyrosine kinase resistance in rat fat cells.Diabetes. 1991,40(11) : 1440-1448.]。实施例2胰岛素凝胶对颂骨组织局部给药，促进GK大鼠拔牙窝愈合作用本实施例以Goto-Kakizaki (GK)大鼠为材料，Goto-Kakizaki (GK)大鼠是 1975 年Goto等人在日本仙台，从211个Wistar大鼠中经口服糖耐量实验(OGTT)选出1 8个轻度糖耐量减退鼠，经10代左右反复选择高血糖鼠交配，形成与人类2型糖尿病近似的自发性非肥胖2型糖尿病鼠种，简称GK大鼠。该鼠种主要表现为葡萄糖刺激的胰岛素分泌受损，β “细胞分泌受损，空腹高血糖，肝糖原生成增多，长期患病后，出现各种并发症。2型糖尿病可以分为胰岛素绝对不足和胰岛素相对不足，临床上需要补充外源性胰岛素进行治疗。1980年及1988年世界卫生组织WHO关于糖尿病的诊断标准如下有糖尿病症状，具备下列任何一项即可诊断为糖尿病a、空腹血糖> 7. 8mmol/l ；b、一日中任何时间血糖彡11. lmmol/1 ；c、空腹血糖(7. 8mmol/l，但口服75 %葡萄糖耐量试验二小时血糖 ^ 11. lmmol/1。在以往的少数研究中表明，糖尿病患者局部应用某些药物可以促进伤口愈合，这些药物包括蛋白酶抑制剂和血浆纤维素等。GK大鼠鼠种主要表现为葡萄糖刺激的胰岛素分泌受损，β “细胞分泌受损，空腹高血糖，肝糖原生成增多，长期患病后，出现各种并发症。局部应用胰岛素对糖尿病拔牙窝愈合的作用以及IR和IGF-IR两种受体在此过程中如何表达和变化尚未明确。本研究以Wistar大鼠为对照，拔除GK大鼠左侧下颂切牙后拔牙窝内局部给予胰岛素凝胶，观察拔牙窝愈合过程中胰岛素局部应用对IR和IGF-IR的影响及拔牙窝愈合情况，以达到实验目的。实验方法与过程Dffistar大鼠和GK大鼠下颂骨拔牙窝模型的建立随机分组=Wistar大鼠拔牙组(WN) ；GK大鼠拔牙组(GN)、GK大鼠注射壳聚糖凝胶组(Gl)、GK大鼠拔注射载有胰岛素的壳聚糖凝胶组(G2)，每组3只。称取体重，尾部血糖测量及标记，将大鼠大腿内侧腹腔注射戊巴比妥液(0. 5ml/100g体重)；固定、消毒、 铺巾。下颂左侧切牙分离牙龈，在牙槽骨唇侧做梯形切口，翻开唇舌侧粘骨膜瓣；去除少部分的唇侧骨板，减少唇侧的骨阻力；舌侧利用牙龈分离器将牙与牙槽骨轻轻分离使持针器能夹住大鼠下颂切牙即可；牙槽窝处理刮除牙槽窝内牙周组织，生理盐水适当冲洗后按照不同分组进行拔牙窝局部注射胰岛素凝胶；关闭创口 将拔牙后一侧的粘骨膜与对侧粘骨膜尽量对位严密缝合。术后同术前测量大鼠尾血血糖；待大鼠完全清醒后放回鼠笼；肌肉注射注射用青霉素钠20万单位溶液(0. lml/100g)；将阿莫西林胶囊溶于饮水瓶中三天(0.25mg/d)。SPSS13.0统计软件进行分析，实验数据用^士 s表示，组间差异比较采用 One-Way ANOVO分析LSD法，P < 0. 05认为差异具有显著性。2)胰岛素凝胶对颂骨组织局部给药，促进GK大鼠拔牙窝愈合作用分别配制β-甘油磷酸钠溶液与壳聚糖醋酸溶液后，冷却至室温后使用。将两种溶液冰浴后，吸取壳聚糖醋酸溶液到容器中，快速搅拌同时逐滴加入β “甘油磷酸钠溶液， 并持续搅拌，获得壳聚糖/ β “甘油磷酸钠水凝胶。再加入适量的胰岛素，制备对颂骨组织局部给药的胰岛素凝胶。①取材及固定将实验一中的大鼠分别于术后第7d，14d，21d，28d取材。分组情况同前一部分实验分组。下颂骨外固定分离下颂骨后，在正中联合处分开，清理干净附丽的肌肉、筋膜、牙周膜后，以下颂第一磨牙近中为界，将下颂骨分为前后两部分，前部迅速放入液氮组织中冻存，后部放入4%多聚甲醛中固定。影像学检查X线检查在正中联合处分开后拍片观察各组拔牙窝骨组织愈合及新骨形成情况。②病理学检查组织在多聚甲醛中室温下固定72小时后，取出放入15% EDTA(pH = 7. 4)液中脱钙处理，1个月左右待组织脱钙完全后进行脱水，石蜡包埋，以5毫米厚度均勻切片，烘片机烘片干燥后4°C冰箱中保存备用。脱水及包埋步骤梯度乙醇(70%乙醇6011^11，80%乙醇601^11，90%乙醇60111士11， 95% 乙醇 I30min，95% 乙醇 II30min，100% 乙醇 I20min，100% 乙醇 II20min)逐级脱水；二甲苯透明(二甲苯I和二甲苯II各15min) ；62°C浸蜡> 汕，常规石蜡包埋；将标本按水平方向做近远中向连续组织切片，片厚5um ；选有拔牙窝区域新骨生成的组织切片，置于载玻片上。石蜡组织切片脱蜡步骤二甲苯I和二甲苯II各脱蜡20min ；梯度乙醇(100% 乙醇anin，95%乙醇lmin，80%乙醇lmin，75%乙醇lmin，自来水冲洗5min，蒸馏水冲洗 2min)至水洗。组织切片进行三组实验切片常规二甲苯、梯度酒精脱蜡至水；水洗后苏木精染色3分钟，水洗后盐酸酒精内分化数秒；水洗后40°C水中返蓝浸泡30秒；水洗后0. 5% 伊红复染5分钟；70%酒精、85%酒精、95%酒精、无水乙醇脱水；二甲苯透明；中性树胶封固。免疫组织化学法检测顶和IGF-IR在大鼠下颂骨切牙拔牙窝中的表达。步骤如下石蜡切片常规脱蜡至水；阻断灭活内源性过氧化物酶3% H2&37°C孵育lOmin，PBS 冲洗3次X5min ；抗原修复0. 125%胰酶(pH = 7. 2)进行抗原修复20min，PBS冲洗3 次X5min ；正常血清工作液封闭，37°C孵育lOmin，倾去勿洗；滴加一抗(IR = 1 100 ； IGF-IR = 1 100)4°C冰箱孵育过夜，37°C复温lh，PBS冲洗3次X5min (用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照)；滴加生物素标记二抗，37°C孵育20min，PBS冲洗3次X5min;滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37°C孵育20min，PBS冲洗3次X 5min ；DAB反应染色，显色一般为室温:3min，在显微镜下观察显色情况，显色充分后自来水终止反应。自来水充分冲洗后，苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片。免疫组化结果判定阳性表达判断标准是观察围绕在新生骨小梁周围的成骨细胞上胞浆内是否有棕黄色物质沉积，将着色强度分为4级无色为阴性，淡黄色为弱阳性，棕黄色为阳性，棕褐色为强阳性。Goldner' s三色法染色方法脱蜡后的切片在Wieigert’ s铁苏木素液中染色 15min,蒸馏水漂洗1次，自来水冲洗2次；丽春红-酸性品红染色液中染色15min， 醋酸液漂洗2次；1 %磷钨酸-桔黄G8min，1 %醋酸液漂洗2次；亮绿液染色15min，1 %醋酸液漂洗2次；70%乙醇漂洗1次，无水乙醇I、II漂洗2次；二甲苯透明；中性树胶封固。③颂骨组织骨细胞的处理总RNA提取将组织在液氮中磨碎，每50-100mg组织加入lmlTrizol，用勻浆仪进行勻浆处理。样品体积不应超过Trizol体积10% ；将勻浆样品在室温(15-30°C )放置 5min，使核酸蛋白复合物完全分离；每使用ImlTrizol加入0. 2ml氯仿，剧烈振荡30s，室温放置;3min;2-8°C 10000 X g离心15min。样品分为3层；将上层水相移到新管中，用异丙醇沉淀水相中的RNA。每Iml Trizol加入0.6ml异丙醇，室温放置IOmin ;2-8°C IOOOOXg离心15min，移去上清；用75%乙醇洗涤RNA沉淀。2_8°C不超过7500X g离心5min，弃上清； 室温放置干燥RNA沉淀。加入30 μ 1 DEPC H2O溶解RNA。-70°C保存。RNA反转录为cDNA，之后进行荧光定量PCR监测实验，荧光定量PCR的反应体系由 2X SYBR Real-Time PCR mix、特异引物、Taq酶、cDNA模板、dd H2O组成。荧光标记是5， 端FAM，3 ’端TAMRA选用GAPDH为内参蛋白。弓丨物的具体设计如下
GAPDHForward 5' -GAAGGTGGAGGTCGGAGTC-3‘GAPDH Reverse 5' -GAAGATGGTGATGGGATTTC-3‘IR Forward 5' -AGGAGCCCAATGGTCTGA-3‘IR Reverse 5' -GAGACGCAGAGATGCAGC-3‘IGF-IR Forward 5' -CGATGTGTGAGA AGACCACCA-3‘SPSS13. 0统计软件进行分析，实验数据用^士 s表示，组间差异比较使用方差分析 (One-ffay AN0VA)、T 检验(One-Sample T Test、Paired-Sample T Test)。实验结果与讨论Dffistar大鼠和GK大鼠下颂骨拔牙窝模型的建立术后2士0. 5h内大鼠均清醒，清醒后能在鼠笼内自如活动并进食，从术后到7d， 14d,21d,28d, 12只Wistar大鼠状态良好；36只GK大鼠全部在术后立即清醒并状态良好， 直到取材(取材时间同Wistar组)。Wistar大鼠与GK大鼠体重比较，Wistar大鼠体重均重于GK大鼠，统计学分析两者有显著性差异P < 0. 05(表1)。表1两种大鼠在术前术后的体重比较(χ士 S)
_术前体重(g)_术后体重(g)_
7d (n-9) 14d (n=9) 21d (n=9) 28d(n=9) Wistar 220.45±7.78 233.5±9.65 245.5±12 265.35±8.38 286.5±4.58* GK 200.65±6.65 210.55±6.37 222.68±7.78 237.25±6.07 247.5±2.05*p < 0. 05与对照组相比于术前、术后30min取WN组及G2组大鼠尾部血糖进行测定，比较局部给予胰岛素后血糖变化。Wistar大鼠与GK大鼠血糖测定经统计学分析存在显著差异，而且一直保持稳定状态(图幻。G2组在拔牙术前和术后快速测大鼠尾部血糖，血糖变化不明显，没有统计学差异。在两种大鼠同样饮食喂养条件下，GN、GU G2组大鼠直到取材时仍保持在高血糖，明显高于WN组(图4).在大鼠饲养过程中检测血糖值Wiatar组和GK组有明显统计学差异，GK大鼠一直保持在高血糖状态，拔牙术前、术后对于拔牙窝注射载有胰岛素的壳聚糖凝胶系统的实验组(6 进行大鼠尾血血糖快速测定发现血糖变化不大，无统计学差异，说明胰岛素在壳聚糖凝胶系统内，未直接通过拔牙窝入血迅速调节血糖，饲养和饮食条件与 Wistar相同，直到取材时间点时GK大鼠均保持在高血糖状态，符合本实验要求。2)胰岛素凝胶对颂骨组织局部给药，促进GK大鼠拔牙窝愈合作用给药缓释系统含有浓度为10_6Μ-1(ΓΜ的胰岛素、重量百分比2. 5% -3. 0%的壳聚糖以及5.0% -6.0%的β-甘油磷酸钠，其中ρΗ值为6.9-7.2。大体检查术后7d大体观察四组大鼠下颂切牙创口均一期愈合，黏膜完整，色泽正常，同一观察期实验组和对照组创口表面愈合未见明显异常，愈合良好，未见感染；术后 28d观察创口已经基本愈合。X线检查结果X线观察在两种大鼠拔牙后观山在χ线片上可以看到有牙槽窝的界限，Wistar组牙槽窝内明显有新骨形成；GK组牙槽窝内整体未见明显新骨形成，骨纹理同Wistar组相比紊乱(图5)。
Wistar组拔牙7d时拔牙窝中充斥着血细胞和早期的肉芽组织，肉芽组织，其中包含血管，成纤维细胞及慢性炎症细胞；拔牙后28d，新生骨小梁明显，结构还比较紊乱，尚未改建。GK组拔牙后7d时，GN组炎症细胞与WN组相比，炎症细胞明显增多，成纤维细胞排列紊乱；Gl组炎症细胞在肉芽组织中浸润更多，图中箭头处为C/GP ；G2组炎症细胞与WN 组相比增多，但同Gl组相比有所减少，染色片中未见如Gl组C/GP结构，但图中箭头所示为异物巨细胞，表示其附近有C/GP。拔牙后28d，GN组中能见到立方形、多边形的成骨细胞增多，靠近骨组织处成骨细胞明显活跃，开始有新骨生成；Gl组中骨愈合不良，纤维性骨质为主，成纤维细胞、骨原细胞混杂，其间夹杂个别炎症细胞；G2组中出现不规则骨基质和少许的新生骨小梁，围绕新生骨小梁周围的成骨细胞明显活跃，立方形、多边形的成骨细胞多见。Goldner' s三色法结果由于HE染色不能完全区分骨矿化的阶段，一般采用 Goldner' S三色法，主要针对胶原纤维进行着色，而活跃的成骨细胞胞体呈立方形或矮柱形，胞质呈强嗜碱性。IR和IGF-IR的表达IR和IGF-IR受体均表达在成骨细胞的胞浆上，阳性表达的细胞可见胞浆内有棕黄色物质沉积。因为本切片是脱钙处理的石蜡切片，脱钙后的组织有细胞胞浆溶解所以出现少部分非特异染色，本实验阳性表达的判断标准是观察围绕在新生骨小梁周围的成骨细胞上胞浆内是否有棕黄色物质沉积。G2组28d时能见到少量新生骨组织上IR弱阳性表达，GN组28d则是IR阳性表达；WN组28d时新生的骨小梁周围的成骨细胞上IGF-IR阳性表达，同时间组的GN组28d未见有新生骨小梁，IGF-IR弱阳性表达。Real-time qPCR结果在大鼠拔牙窝7_28d愈合过程IRmRNA水平上，WN组IR mRNA水平表现为持续下降；GN组则表现为IRmRNA水平在14d达到高峰后开始下降为先升高后降低的趋势Gl组也表现为先升高后降低趋势，21d时达到高峰，随后在28d时降到7d 时水平G2组与WN组表现一致，在7-28d过程中持续下降(图6)。其中GN组的IRmRNA水平最高(ρ <0.01)，G1、G2组与WN组相近均低于GN组。在大鼠拔牙窝7_28d愈合过程 IGF-IRmRNA水平上，GN、G1组的IGF-IR mRNA水平较低，而且在此过程中改变无明显统计学差异；G2组在7d，14d，21d明显高于其它两组，并在21d时达到峰值；WN组14d，21d显著高于 GN、G1 组(ρ < 0. 01)(图 7)。本发明中发现在Wistar组拔牙7d时拔牙窝中充斥着血细胞和早期的肉芽组织， 其中包含血管，成纤维细胞及慢性炎症细胞；拔牙后28d，新生骨小梁明显，结构还比较紊乱，尚未改建。GK组28d除了 G2组的病理变化类似于WN组28d时变化外，其余组拔牙后 28d纤维性骨质为主，成纤维细胞、骨祖细胞混杂，其间夹杂个别炎症细胞。Goldner’ s三色法结果证实了 HE结果中观察到的所示新生骨小梁结构。因为本切片是脱钙处理后石蜡切片，脱钙组织有部分细胞胞浆溶解所以出现少部分非特异染色。免疫组化学观察IR和 IGF-IR受体均表达在成骨细胞的胞浆上，IR在G2组28d时能见到弱阳性表达，GN组28d时则是阳性表达；IGF-IR在WN组28d时新生的骨小梁周围的成骨细胞上阳性表达，GN组28d 时IGF-IR弱阳性表达。IGF-IR在成骨细胞上表达活跃的地方也是新生骨形成活跃的地方。 利用Real-time qPCR法分别检测了大鼠拔牙窝7_28d愈合过程IRmRNA和IGF-IRmRNA的水平及变化，发现对于IRmRNA而言，G2组变化趋势与WN组一致均为下降趋势，同时GN组的水平最高，且存在先升高后降低的趋势；在此过程中对于IGF-IRmRNA水平而言，G2组的水平显著高于其他GN，Gl两组，但是低于WN组其实GN、Gl组的IGF-IR mRNA水平较低，而且在此过程中改变无明显统计学差异。胰岛素缓释的凝胶系统局部注射于大鼠拔牙窝内， 未即刻改变大鼠血糖；胰岛素局部应用于拔牙窝改变了顶和IGF-IR水平，促进了糖尿病大鼠拔牙窝中新生骨形成。
权利要求
1.胰岛素在制备促进颌骨组织愈合的药物中的用途，所述药物局部施用于动物活体组幺口
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述动物活体组织是动物颂骨组织。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的动物颂骨组织是指颂骨组织在体外培养的成骨细胞以及在动物活体的颂骨组织。
4.根据权利要求1所述的胰岛素促进颂骨组织成骨细胞增殖的用途，其特征在于，所述药物是含有胰岛素的胰岛素局部给药凝胶系统。
5.根据权利要求4所述的胰岛素局部给药凝胶系统，其特征在于，所述的缓释系统含有浓度为10_6Μ-10_7Μ的胰岛素、重量百分比2.5% -3.0%的壳聚糖以及5.0% -6.0%的 β -甘油磷酸钠，PH值为6. 9-7. 2。
全文摘要
本发明公开了胰岛素在制备促进颌骨组织愈合的药物中的用途。在探索胰岛素的药用用途过程中，本发明采用了动物的颌骨组织作为实验材料，具体实验包括用细胞生物学实验检测胰岛素促进体外颌骨组织成骨细胞的增殖；胰岛素局部作用于动物活体的颌骨组织，促进颌骨组织的愈合。本发明不仅增加了胰岛素的药用用途，并且提高了胰岛素在颌骨组织愈合方面的效用。本发明采用胰岛素直接作用于颌骨组织，避免了胰岛素的长期注射而带来的副作用，为2型糖尿病患者的颌骨组织愈合带来了很大的促进作用，并且本发明采用局部给药，有效提高了胰岛素促进正常人颌骨组织愈合的效率。
文档编号C12N5/077GK102397534SQ20101027409
公开日2012年4月4日 申请日期2010年9月7日 优先权日2010年9月7日
发明者刘洪臣, 汪林, 王东胜 申请人:中国人民解放军总医院