专利名称：安莎霉素发酵产量提高方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物工程技术领域的方法，具体是一种安莎霉素发酵产量提 高方法。
背景技术：
安莎霉素(Ansamitocin)是珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)产 生的美登素衍生物，其母核为19-C的大环内酰胺环，C-3连接不同长度的碳链，主要活性 成份安莎霉素AP-3 (AP-3)，其侧链为异丁酰基，在低浓度下可抑制非白血性白血病细胞系 及人类固体肿瘤。由于肠胃副效应及神经毒性，其研究还停留在临床二阶段。然而，由于 Ansamitocin可在临床一期中作为抗体毒素结合物及免疫结合物，有重要的应用潜力。安莎霉素的生物合成途径共包括48个基因(分散在两个基因簇)，其中asm2，8， 18，29，31，34，39和asm40为调节基因；asm22_24和asm43_47负责安莎霉素起始单位的合 成，asml3-17负责延伸单位methoxymalonyl-ACP的合成。研究表明，敲除或过表达asm2均 能提高安莎霉素活性成份AP-3的产量，另外，过表达asm39也能有效地提高AP-3产量。敲 除结构基因asml4，15，19和asm24等检测不到产物AP-3。在安莎霉素发酵方面，Bandi等 报道了利用响应面法(RSM)优化野生型和asm2突变株的发酵培养基，最大AP-3产率分别 为 5mg/ (L. d)和 8. 7mg/ (L. d)。目前，已报道的野生型珍贵橙色束丝放线菌产Ansamitocin主要为液体发酵，产 量在 12mg/L-60mg/L 之间。金属离子对微生物的生长发酵具有巨大的影响，参与生物体内许多酶活力的调 节，例如镁离子是糖代谢过程中许多关键酶的辅因子。经过对现有技术的检索发现，目前考虑提高AP-3的产量的方法主要集中在氮源 和碳源，例如通过PB设计、响应面法及中心组合法优化的氮源有蛋白胨和酵母粉，碳源有 蔗糖和糊精。氮源是用来构成菌体蛋白质、核酸等含氮物质，以及抗生素等含氮代谢产物。 但是该技术成本高，培养基组分复杂，成分不确定，重复性差，且给研究机理带来了困难，对 后续分离提取带来了很大的困难。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种安莎霉素发酵产量提高方法，通 过在培养基中添加镁离子使安莎霉素的发酵产量获得显著提高。本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括以下步骤第一步、首先配置种子培养基，采用甘油融化接种于种子培养基并进行培养操作， 获得一级种子，经二次培养得到二级种子；所述的种子培养基的组分及重量百分比为酵母提取物0.4%、麦芽糖1%、葡萄 糖0. 4%，加入98. 2%蒸馏水并搅拌后调节PH值为7. 45。所述的甘油融化接种是指按0.5% -1.0%接种量，采用-70°c保存的甘油管经融化后融化接种于种子培养基。所述的培养操作是指在25-32°C环境下培养24_60h。所述的二次培养是指取一级种子按1. 0-3. 0%的接种量接种于种子培养基并进 行培养操作。第二步、配置发酵培养基，并将二级种子进行摇瓶培养；所述的配置发酵培养基是指配取组分及质量百分比分别为酵母提取物1%、玉 米粉滤液2%、葡萄糖0. 5%、甘油4%、磷酸氢二钾0. 05%、七水和硫酸亚铁0. 0002%以及 碳酸钙0. 5%，加入91. 498%蒸馏水并搅拌后调节pH值为7. 45。所述的摇瓶培养是指将二级种子按1. 0-3. 0%接种量接种于含有发酵培养基的 发酵摇瓶中。第三步、将浓度为IM的硫酸镁水溶液添加至发酵摇瓶中进行发酵处理，然后将发 酵摇瓶经摇床培养后实现发酵生产。所述的发酵处理是指发酵后的发酵摇瓶中镁离子浓度为0. l_20mM。所述的摇床培养是指将发酵摇瓶转入摇床并在25-32°C，150-300rpm条件下培 养5-12天。本发明与现有技术相比，发酵水平高，已明显超过原工艺的水平；操作简单且成本 低，便于大规模生产。
图1为实施例中以玉米粉滤液为碳源的效果示意图。图2为实施例中以荞麦粉滤液为碳源的效果示意图。图3为实施例中以玉米粉滤液为碳源的效果比较图。图4为实施例中以荞麦粉滤液为碳源的效果比较图。
具体实施例方式下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。实施例1采用的菌种珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum ATCC31565)，该菌 种通过美国马里兰洲洛克菲勒的美国标准生物品收藏中心(ATCC)购得。种子培养种子培养基成份为酵母提取物质0. 4%、麦芽糖1%、葡萄糖0. 4%。甘 油管接种于一级种子培养基，25-32°C培养24-60h，按1. 0_3. 0 %接种量接种于二级种子培 养基，25-32 °C 培养 24-60h。发酵培养发酵培养基为酵母提取物1%、玉米粉滤液2%、葡萄糖0. 5%、甘油 4%、磷酸氢二钾0. 05%、七水和硫酸亚铁0. 0002%、碳酸钙0. 5 %，然后配置IM的硫酸 镁水溶液并添加至上述发酵液中进行发酵，投入到摇瓶中的镁离子浓度为0. l-20mM。按 1.0-3.0%接种量接种于发酵摇瓶中，150-300r/min，25-32°C旋转式摇床进行发酵，培养 5-12d。
样品处理及检测方法发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取，然后经过浓缩，溶于甲 醇，过滤后低温保存或直接HPLC检测。如图1所示，结果表明当不同浓的镁离子添加后安莎霉素产量与对照相比均有较 大提高，当镁离子添加浓度为2mM时效果最好，最高可达65mg/L，与对照相比提高近4倍。实施例2采用的菌种同实施例1;种子培养同实施例1;发酵培养同实施例1，玉米粉滤液改为荞麦粉滤液，将一定量的镁离子溶液添加 初始料中进行发酵，投入到摇瓶中后的镁离子浓度为0. l-20mM。；样品处理及检测方法同实施例1。如图2所示，结果表明当不同浓度的镁离子添加后安莎霉素产量与对照相比均有 较大提高，当镁离子添加浓度为2mM时效果最好，最高可达85mg/L，与对照相比提高近3倍。实施例3采用的菌种同实施例1 ；种子培养同实施例1;发酵培养同实施例1，分别在0，24，48，7211添加21111镁离子。样品处理及检测方法同实施例1。如图3所示，结果表明在第Oh添加镁离子效果最显著。实施例4采用的菌种同实施例1 ；种子培养同实施例1;发酵培养同实施例1，玉米粉滤液改为荞麦粉滤液分别在0，24，48，72h添加2mM
镁离子；样品处理及检测方法同实施例1。如图4所示，结果表明在第Oh添加镁离子效果最显著。从上述实施例可见，玉米粉滤液为碳源的发酵液中添加2mM镁离子后，效价提高 了近4倍，最高可达60mg/L，荞麦粉滤液为碳源的发酵液中添加2mM镁离子后与对照相比 提高近3倍，最高可达85mg/L。综上所述，通过将荞麦粉滤液作为碳源，AP-3产量由原来的 15mg/L提高到30mg/L，提高了一倍；进一步添加IM的硫酸镁水溶液后能够有效提高发酵效 价。
权利要求
一种安莎霉素发酵产量提高方法，其特征在于，包括以下步骤第一步、首先配置种子培养基，采用甘油融化接种于种子培养基并进行培养操作，获得一级种子，经二次培养得到二级种子；第二步、配置发酵培养基，并将二级种子进行摇瓶培养；第三步、将浓度为1M的硫酸镁水溶液添加至发酵摇瓶中进行发酵处理，然后将发酵摇瓶经摇床培养后实现发酵生产。
2.根据权利要求1所述的安莎霉素发酵产量提高方法，其特征是，所述的种子培养基 的组分及重量百分比为酵母提取物0.4%、麦芽糖1 %、葡萄糖0. 4 %，加入98. 2 %蒸馏水 并搅拌后调节PH值为7. 45。
3.根据权利要求1所述的安莎霉素发酵产量提高方法，其特征是，所述的甘油融化接 种是指按0. 5% -1. 0%接种量，采用-70°C保存的甘油管经融化后融化接种于种子培养基。
4.根据权利要求1所述的安莎霉素发酵产量提高方法，其特征是，所述的培养操作是 指在25-32 °C环境下培养24-60h。
5.根据权利要求1所述的安莎霉素发酵产量提高方法，其特征是，所述的二次培养是 指取一级种子按1. 0-3. 0%的接种量接种于种子培养基并进行培养操作。
6.根据权利要求1所述的安莎霉素发酵产量提高方法，其特征是，所述的配置发酵培 养基是指配取组分及质量百分比分别为酵母提取物1 %、玉米粉滤液2 %、葡萄糖0.5%、 甘油4%、磷酸氢二钾0. 05%、七水和硫酸亚铁0. 0002%以及碳酸钙0. 5%，加入91. 498% 蒸馏水并搅拌后调节PH值为7. 45。
7.根据权利要求1所述的安莎霉素发酵产量提高方法，其特征是，所述的摇瓶培养是 指将二级种子按1. 0-3. 0%接种量接种于含有发酵培养基的发酵摇瓶中。
8.根据权利要求1所述的安莎霉素发酵产量提高方法，其特征是，所述的发酵处理是 指发酵后的发酵摇瓶中镁离子浓度为0. l-20mM。
9.根据权利要求1所述的安莎霉素发酵产量提高方法，其特征是，所述的摇床培养是 指将发酵摇瓶转入摇床并在25-32°C，150-300rpm条件下培养5_12天。
全文摘要
一种生物工程技术领域的安莎霉素发酵产量提高方法，通过采用甘油融化接种于种子培养基并进行培养操作，并经二次培养后得到二级种子，然后通过对二级种子进行摇瓶培养并将浓度为1M的硫酸镁水溶液添加至发酵摇瓶中进行发酵处理，然后将发酵摇瓶经摇床培养后实现发酵生产。本发明发酵水平高，操作简单且成本低，便于大规模生产。
文档编号C12P17/18GK101921817SQ201010274799
公开日2010年12月22日 申请日期2010年9月7日 优先权日2010年9月7日
发明者贾永亮, 钟建江 申请人:上海交通大学