专利名称：高启动强度宽宿主组成型表达质粒pMMPc及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是基因工程领域表达质粒及应用，尤其是关于高启动强度宽宿主范 围组成型表达质粒PMMPc及其在生物降解和生物修复领域的应用。
背景技术：
基因表达系统在生物降解和生物修复领域具有重要作用，是进行外源基因表达的 重要工具。现在常用的基因表达系统，比如tac启动子表达系统、Tn7启动子表达系统以及 一些光照诱导型或者温度诱导型启动子表达系统等，都有一个共同的缺陷，即启动子诱导 表达需要额外添加诱导因子，如IPTG、温度变化、光照变化等。这为生物降解和生物修复带 来了额外的操作，增加了成本，而且，在环境领域应用时增加了表达系统实施的难度，并可 能会给环境带来负面的影响(Di Gennaro et al. ,2008 ；Choi et al.，2005)。因而，有必 要开发新的不受上述限制的组成型表达质粒。芳烃类化合物是一类重要的致癌物质，在环境中广泛存在，不但对环境造成了严 重污染，而且严重威胁人类健康。利用微生物，通过生物降解和生物修复来消除环境污染已 经成为现在重要的研究课题。儿茶酚又称邻苯二酚，是许多芳烃类化合物代谢的中间产物。 儿茶酚双加氧酶能够作用于芳烃类化合物代谢的中间产物邻苯二酚，它催化苯环的邻位裂 解。这一特性使该酶在芳烃类化合物代谢中处于重要的地位，对消除芳烃类化合物的环境 污染具有重要的意义。参考文献Di Gennaro P,Ferrara S,Bestetti G,et al. Novel auto-inducing expression systems for the development of whole—cell biocatalysts. Appl Microbiol Biotechnol，2008，79 :617_625.Choi K H, Gaynor J B, White K G, et al. (2005)A Tn7_based broad-range bacterial cloning and expression system. Nat Methods, 2005, 2 :443-448.
发明内容
针对现有质粒的缺陷以及现阶段环境污染的现状，本发明的目的是提供一种高启 动强度宽宿主范围的组成型表达质粒，并使其应用于在革兰氏阴性菌中表达儿茶酚双加氧 酶。本发明所述高启动强度宽宿主范围组成型表达质粒，命名为pMMPc，由复制子 ReflOlO、筛选标记基因bla(氨苄抗性基因)、多克隆位点、基因间序列和高启动强度组成 型启动子Pc组成；其特征在于，所述质粒pMMPc的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示；其中， 所述高启动强度组成型启动子Pc的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。本发明所述的质粒pMMPc的构建方法是合成启动子Pc，共225bp。以上述合成的Pc片段为模板，设计引物如下
3
Pc. f (划线部分为 MluI 酶切位点)CATGACGCGTTGCCGATACAAGAACAAPc. r (划线部分为 EcoRI 酶切位点)GTCAGAATTCACGGGTTCGCTACCTGC然后配制反应体系ddH2034 μ l，dNTP Mixture (2. 5mM each)4 μ 1, IOXEasy Taq Buffer5 μ 1，Sense Primer (20 μ Μ) 0. 5 μ 1, Anti Primer (20 μ Μ) 0. 5 μ 1, life. DNA ( ^^ 启动子 Pc 片段)0. 5 μ 1，EasyTaq Ιμ 。体系配好以后进行聚合酶链式反应(PCR)，循环如下940C 4min ；之后 94°C 30s，55°C 30s, 72°C 30s，共 29 个循环；最后 72°C IOmin0分别用相应的核酸内切酶对扩增产物和宽宿主范围表达质粒pMMB66EH(核苷酸 序列如SEQ ID No.3所示)进行酶切，DNA连接酶连接，进行鉴定，获得阳性重组质粒，命名 为pMMPc ；所述质粒pMMPc的核苷酸序列，如SEQ ID No. 4所示。本发明所述质粒pMMPc在革兰氏阴性菌中表达儿茶酚双加氧酶的应用。其中， 所述儿茶酚双加氧酶的表达是以在质粒PMMPc启动子Pc后插入儿茶酚双加氧酶的基因 bphC(核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示)实现。儿茶酚双加氧酶基因bphC表达的酶为儿茶酚双加氧酶BphC，该酶的特性在于，它 可以迅速的催化化合物儿茶酚生成2-羟基粘糠酸半醛，2-羟基粘糠酸半醛是一种有黄颜 色的化合物，而儿茶酚是无色的。实验中通过核酸内切酶酶切、DNA连接、转化等分子操作， 将儿茶酚双加氧酶基因bphC插入到启动子Pc后边，然后将质粒转化不同的菌株。通过向 转化子平板喷涂儿茶酚水溶液，观察转化子的颜色变化来方便的检测转化子是否具有催化 化合物儿茶酚生成2-羟基粘糠酸半醛的能力，从而检测本发明质粒是否可以组成型表达 以及质粒的宿主适用范围，并通过儿茶酚双加氧酶活性的测定检测质粒的其它特性。上述质粒pMMPc的应用步骤为从假单胞菌B6-2 (CGMCC No. 3758)中提取基因组， 以此为模板，PCR扩增得到基因bphC。然后设计带有核酸内切酶酶切位点的引物，以bphC基 因为模板，再次扩增。之后用核酸内切酶对扩增产物和质粒PMMPc进行酶切，DNA连接酶连 接。经过鉴定，得到阳性重组质粒pMMPcbphC。以此为基础，将重组质粒以自然转化法和电 穿孔转化法转化不同的宿主，如革兰氏阴性菌。通过喷涂」L茶酚水溶液以及菌落PCR检测。 研究结果表明pMMPc优选适用于大肠杆菌Mach Tl ((Escherichia coli MachTl)购买自北 京全式金生物技术有限公司(TransGen Biotech, Co.))、施氏假单胞菌SDM(Pseudomonas stutzeri SDM，CCTCC No. M206010)和恶臭假单胞菌 CICC 23651 ((Pseudomonas putida CICC 23651)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)等。本发明进一步对Pc启动子启动强度进行了研究，比较了 Pc启动子和IPTG诱 导的tac启动子的启动强度。首先，将经过验证正确的含有构建质粒的转化子P. putida CICC23651/pMMbphC 和本发明构建的转化子 P. putida CICC 23651/pMMPcbphC 过夜培养。 然后，按接种量转接50ml/500ml LB三角瓶，摇床震荡培养。每两个小时取样，测定菌体 浓度(OD6J以及儿茶酚双加氧酶BphC的酶活。上述酶活测定方法为超声波破碎细菌，离心去除细胞碎片，取一定量粗酶液用 APbuffer (含10%丙酮的pH 7.5的PB缓冲液)稀释至3ml，加入50 μ 1的0. 2Μ的儿茶酚 溶液，振荡混勻。然后用UV-2500紫外分光光度计测定酶活的具体数据。将两个转化子不同时间的酶活除以对应时间的菌体浓度(OD6J得到单位浓度菌 体的酶活，进行数据比较，发现本发明的P. putida CICC 23651/pMMPcbphC转化子单位浓度
4菌体酶活的最大值比P. putida CICC 23651/pMMbphC转化子单位浓度菌体酶活的最大值高 大约6倍，而且诱导的速度快，在12小时达到诱导强度的最大值，而IPTG诱导的tac启动 子表达系统在14小时左右达到诱导强度的最大值(具体数据见图4)。该结果表明，本发明 构建的质粒pMMPc(Pc启动子)在不需要外加任何诱导物或进行任何额外诱导操作时即可 启动外源基因的表达，而且较宽宿主范围表达质粒pMMB66EH(IPTG诱导的tac启动子)具 有更高的启动效率，启动速度也快。本发明利用细菌III型整合子中的启动子Pc与宽宿主范围表达质粒pMMB66EH构 建了新的表达质粒pMMPc，由于启动子Pc具有不需要诱导(即组成型表达)、启动强度高、 启动速度快和适用范围广的特点(Xu et al.，2007)，将该启动子插入到质粒上，使得构建 的质粒具有该启动子的优点，即不需要诱导、启动强度高、启动速度快和适用范围广，正是 目前基因表达系统的很好的替代系统。为了检测本发明的质粒在生物降解和生物修复领域 的应用潜力，本发明以假单胞菌(P. putida)B6-2基因组为模板，聚合酶链式反应(PCR)克 隆儿茶酚双加氧酶的基因bphC，通过核酸内切酶酶切、DNA连接、转化等系列分子操作将其 插入到表达质粒PMMPc中启动子Pc的后面。通过检测bphC基因的酶活，并与IPTG诱导的 tac启动子bphC基因的酶活进行比较，发现在实际应用中质粒pMMPc在启动外源基因表达 时无需加入诱导物或进行任何额外的诱导操作即可快速高效的启动外源基因的表达，而且 其在假单胞菌中的表达强度比IPTG诱导的表达系统高大约6倍，且达到表达强度的最大值 所用的时间也缩短2个小时，即诱导的速度快(见图4)。通过自然转化法和电穿孔转化法 将构建质粒转化不同的革兰氏阴性细菌，发现本发明的质粒可以优选应用于大肠杆菌、施 氏假单胞菌和恶臭假单胞菌。以上特点表明本发明的质粒PMMPc具有组成型表达、启动效 率高、启动速度快、宿主范围广的特点，不需要外加任何诱导物或者进行任何额外的诱导操 作。本发明所提供的质粒的特点使其成为目前使用的基因诱导表达系统的很好的替代系 统，在生物降解和生物修复领域具有巨大的应用前景。所述的宿主，是指质粒转化的细菌细胞。所述的转化子，是指质粒转化到细菌中，接受质粒的细菌细胞叫做转化子。所述的活性检测，是指在启动子Pc后面连接外源基因，然后转化宿主细胞，通过 检测外源基因表达的酶的活性，来表征获得的启动子Pc片段是否具有功能活性。所述的组成型表达，是与诱导型表达相对应的一个概念，是指基因无需诱导即可 实现表达的一种基因表达方式。所述的诱导型表达，是指基因在通常情况下不表达或表达程度很低，但在诱导物 的作用下，该基因的转录和表达被启动或增强的一种基因表达方式。参考文献Xu H, Davies J, Miao V. (2007)Molecular characterization of class 3integrons from Delftia spp. J Bacteriol, 2007,189 :6276_6283.
图1为质粒pMMbphC图谱；该质粒的构建是为了与质粒pMMPcbphC进行比对，检测 质粒pMMbphC(IPTG诱导的Iac启动子)与质粒pMMPcbphC (Pc启动子)质粒特性的差别；图 中ReflOlO为复制子，bla为氨苄青霉素抗性基因，IacI为基因表达调控的抑制基因，bphC为儿茶酚双加氧酶的基因。图2为质粒pMMPc图谱，图中ReflOlO为复制子，bla为氨苄青霉素抗性基因，IacI 为基因表达调控的抑制基因，Pc为高启动强度组成型表达的启动子基因。图3为质粒pMMPcbphC图谱，图中ReflOlO为复制子，bla为氨苄青霉素抗性基因， IacI为基因表达调控的抑制基因，Pc为高启动强度组成型表达的启动子基因，bphC为儿茶 酚双加氧酶的基因。质粒pMMPcbphC的构建是为了通过基因bphC来检测质粒pMMPc的特性。图 4 为转化子 P. putida CICC 23651/pMMbphC 和 P. putida CICC 23651/ pMMPcbphC单位菌体浓度酶活数据曲线。
具体实施例方式下面结合具体的实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明，而 不用于限制本发明的范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法，如 Sambrook 等分子克隆实验室手册(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press， 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1pMMB66EH(来自于 GenBank，编号X15234)质粒提取质粒的少量提取使用TIANGEN TIANperp Mini Plasmid Kit质粒小体试剂盒(离 心柱型)完成。①柱平衡步骤向吸附柱CB3 (吸附柱放入收集管中)，加入500 μ 1的平衡液BL， 12, OOOrpm(-13400*g)离心lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。②取l-5ml过夜培养的细菌，加入离心管中，12，OOOrpm(_13400*g)离心lmin，尽 量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。③向留有菌体沉淀的离心管中加入250 μ 1溶液Pl (请先检查是否已加入 RNaseA)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。注意如果有未彻底混勻的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。④向离心管中加入250 μ 1溶液Ρ2，温和地上下翻转4-6次使菌体充分裂解。注意温和的混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有 基因组DNA片段。此时菌液变得清亮粘稠，所用时间不超过5min，以免质粒受到损坏。⑤向离心管中加入350 μ 1溶液P3，立即温和的上下翻转6-8次，充分混勻，此时将 出现白色絮状沉淀。12，OOOrpm(_13400*g)离心lOmin，此时在离心管底部形成沉淀。注意P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀， 可再次离心后取上清。⑥小心将上清倒入或移入吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸 出沉淀。室温放置l-2min，12，OOOrpm(_13400*g)离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将 吸附柱重新放回收集管中。⑦向吸附柱CB3中加入700μ 1漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇)， 12，OOOrpm(-13400*g)离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。⑧向吸附柱CB3中加入500 μ 1漂洗液Pff, 12，OOOrpm(_13400*g)离心30—60秒，倒掉收集管中的废液。⑨将吸附柱CB3重新放回收集管中，12，OOOrpm(_13400*g)离心2min，目的是将吸
附柱上残存的漂洗液除去。注意漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。为确保下 游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CB3开盖，置于室温或50°C温箱放置数分钟，以 彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。⑩将吸附柱CB3置于一个干净的离心管中，向吸附膜中间部位滴加50-100 μ 1洗 脱缓冲液ΕΒ，室温放置lmin，12，OOOrpm(_13400*g)离心2min将质粒溶液收集到离心管中。DNA凝胶电泳检测，通过试剂盒提取到了质粒pMMB66EH。实施例2假单胞菌(Pseudomonas putida) B6_2 (发明人保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心CGMCC No. 3758)基因组提取。基因组的少量提取使用Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega Corporation, Madison, WI, USA)完成。①取1. 5ml过夜培养的细菌，加入离心管中，12，OOOrpm(_13400*g)离心lmin，尽 量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。②加入600 μ 1核酸裂解液，轻轻混勻。③80°C，温育5min，然后冷却至室温。④加入3μ 1 RNA酶，混勻，37°C，温育15-60min，然后冷却至室温。⑤加入200 μ 1蛋白抽提液，旋涡混勻。冰浴5min。然后13，OOOrpm，离心3min。⑥将上清转移至新的印pendorf管中，加入600 μ 1异丙醇，混勻。13，OOOrpm，离 心3min，弃掉上清液。⑦向印pendorf管中加入600μ1室温的70%乙醇，轻轻震荡混勻。然后 13，OOOrpm，离心 3min。⑧弃上清，室温放置10-15min，使印pendorf管晾干。⑨加入100 μ 1溶解液65°C放置lh，或者4°C过夜溶解基因组DNA。DNA凝胶电泳检测，通过试剂盒提取到了假单胞菌B6-2的基因组。实施例31.聚合酶链式反应(PCR)克隆基因bphC引物设计如下bphC. f (划线部分为SmaI酶切位点)CGTACCCGGGTCGACGAAGGAGACAGTAATGAGCATCAbphC. r (划线部分为HindIII酶切位点)GATCAAGCTTCTAGATCATGCTTTGTTGCGCGCAG①反应体系的配制ddH2034 μ 1, dNTP Mixture (2. 5mM each)4 μ 1, IOXEasy Taq Buffer5 μ 1， Sense Primer (20 μ Μ) 0. 5 μ 1, Anti Primer (20 μ Μ) 0. 5 μ 1, life. DNA (P. putida Β6-2 SS^l )0. 5 μ 1，EasyTaq 1 μ 1。②聚合酶链式反应(PCR)循环具体步骤为94°C4min ；之后 94°C 30s,55°C 30s,72°C lmin，共 29 个循环；最后720C IOmin。DNA凝胶电泳检测，扩增出了基因bphC。2.聚合酶链式反应(PCR)克隆基因Pc(Pc基因片段由北京六合华大基因科技股份 有限公司合成)。引物设计如下Pc. f (划线部分为 MluI 酶切位点)CATGACGCGTTGCCGATACAAGAACAAPc. r (划线部分为 EcoRI 酶切位点)GTCAGAATTCACGGGTTCGCTACCTGC①反应体系的配制ddH20 34 μ l，dNTP Mixture (2. 5mM each)4 μ 1，IOXEasy Taq Buffer5 μ 1，Sense Primer (20 μ Μ) 0. 5 μ 1, Anti Primer (20 μ Μ) 0. 5 μ 1, life. DNA ( ^^ 启动子 Pc 片段)0. 5 μ 1，EasyTaq Ιμ 。②聚合酶链式反应(PCR)循环具体步骤为94°C4min ；之后 94°C 30s，55°C 30s，72°C 30s，共 29 个循环；最后 72°C IOmin。DNA凝胶电泳检测，扩增出了基因Pc。实施例4pMMbphC, pMMPc, pMMPcbphC 质粒的构建1. pMMbphC质粒的构建①提取pMMB66EH质粒，SmaI和HindII I双酶切(核酸内切酶SmaI 0.5μ1，核酸内 切酶 HindIII 0. 5 μ 1,10 XBuffer 1μ 1, DNA 8 μ 1，37°C，2 小时)，然后切胶回收大片段。②扩增基因bphC (bphC. f (SmaI) bphC. r (HindiII))，SmaI 和 HindiII 酶切 PCR 产物(酶切反应与①相同)，然后与上述酶切好的质粒连接(10XT4DNA Ligase Buffer 1μ 1，T4DNALigase 1 μ 1，质粒片段 1. 5 μ 1，基因 bphC 片段 6. 5 μ 1，16°C，过夜连接)。转 化大肠杆菌，通过常规方法筛选具有基因活性的转化子，得到了质粒PMMbphC，其核苷酸序 列如SEQ IDNo. 6所示。2. pMMPc质粒的构建①提取pMMB66EH质粒，MluI和EcoRI双酶切(核酸内切酶MluI 0. 5 μ 1，核酸内 切酶 EcoRI 0. 5 μ 1,10 XBuffer 1 μ 1，DNA8 μ 1，37°C，2 小时)，然后切胶回收大片段。②PCR 扩增 Pc 启动子，Pc. f (MluI) Pc. r (EcoRI)用MluI和EcoRI酶切处理pMMB66EH质粒和PCR扩增的Pc启动子(核酸内切 酶 MluI 0. 5 μ 1，核酸内切酶 EcoRI 0. 5μ 1, IOXBuffer 1 μ 1, DNA 8 μ 1，37°C，2 小时)， 连接(10XT4DNALigase Buffer 1 μ 1, T4DNALigase 1 μ 1，质粒片段 1· 5 μ 1，基因 Pc 片段 6. 5 μ 1，16°C，过夜连接)，转化大肠杆菌，用菌落PCR方法筛选转化子。通过常规方法筛选 具有基因活性的转化子，得到了质粒pMMPc，其核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。3. pMMPcbphC 质粒的构建①提取pMMPc质粒，Sma I和HindIII双酶切(核酸内切酶SmaI 0.5μ1，核酸内切 酶 HindIIIO. 5 μ 1，IOXBuffer 1 μ 1,DNA 8 μ 1，37°C，2 小时)。切胶回收纯化质粒 pMMPc。②扩增基因bphC (bphC. for (SmaI) bphC. rev (HindiII))，SmaI 和 HindiII 酶切 PCR产物和质粒pMMPc (核酸内切酶SmaI 0. 5 μ 1，核酸内切酶HindIII 0. 5 μ 1，IOXBuffer 1 μ 1,DNA 8μ 1，37°C，2 小时)，T4DNA 连接酶连接(10XT4DNA Ligase Buffer 1 μ 1,T4DNALigase lμl，质粒片段1.5μl，基因bphC片段6.5μl，16°C，过夜连接)。转化大肠杆 菌，筛选具有基因活性的转化子。通过常规方法筛选具有基因活性的转化子，得到了质粒 pMMPcbphC，其核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示。实施例5构建质粒宿主适用范围检测1.质粒pMMbphC，pMMPc, pMMPcbphC通过自然转化法转化大肠杆菌(大肠杆菌 Mach Tl ((Escherichia coli Mach Tl)购买自北京全式金生物技术有限公司(TransGen Biotech, Co.)))。①制备大肠杆菌感受态细胞。②将10 μ 1质粒加入100 μ 1感受态大肠杆菌细胞，混合均勻，冰浴30min。③37 °C水浴保温5min。④冰浴2min，加入400 μ 1 LB液体培养基，37°C培养lh。⑤取100 μ 1培养物，涂布抗性平板，培养过夜。经过常规方法验证，得到了Ε. coli Mach T1/pMMbphC，E. coli Mach Tl/pMMPc, E. coliMach TlpMMPcbphC 转化子。2.质粒pMMbphC，pMMPcbphC通过电穿孔转化法转化假单胞菌。(施氏假单胞 菌SDM(Pseudomonas stutzeri SDM，发明人保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCCNo. M206010)；恶臭假单胞菌 CICC 23651 ((Pseudomonas putida CICC23651)购自中国工业微 生物菌种保藏管理中心))①制备假单胞菌感受态。②向150μ 1感受态细胞中加入10μ l(50ng/y 1)DNA，转移到冰浴预冷的电转杯 中，冰上放置1 1. 5min。③电击25 μ F，200 Ω，时间常数为4. 5 5. 0ms，低于4. 2ms，则效率明显下降。④电击完毕后取出杯子并立即加入Iml恢复培养基，30°C孵育lh。⑤涂布抗性平板，30°C过夜培养。经过常规方法验证，得到了P. stutzeri SDM/pMMPcbphC, P. putidaCICC23651/ pMMbphC, P. putida CICC23651/pMMPc, P. putida CICC23651/pMMPcbphC 转化子。3.向转化子平板喷涂儿茶酚水溶液，通过转化子菌落颜色变化检测质粒是否可以 组成型表达以及它的适用范围。结果发现质粒pMMPc可以优选适用于菌株大肠杆菌、施氏假单胞菌、恶臭假单胞 菌。4.菌落PCR检测转化子挑取转化子菌落至LB摇管，过夜震荡培养，取Iml菌液，离心，弃上清，菌泥用 100 μ 1无菌水悬浮，沸水浴lOmin，然后离心，以上清作为模板，进行实施例3所述的聚合酶 链式反应，扩增出了 SOObp左右的条带，证明转化子中含有正确的构建质粒。实施例6构建质粒诱导强度检测将经过验证正确的含有构建质粒的转化子P. putida CICC 23651/pMMbphC和 P. putidaCICC 23651/pMMPcbphC 过夜培养。
按接种量转接50ml/500ml LB三角瓶，30°C摇床震荡培养。转化子P. putida CICC23651/pMMbphC 接种后 1. 5h 加入 IPTG 诱导，转化子 P. putida CICC 23651/pMMPcbphC 不加任何诱导物也不进行任何其他的诱导操作。每两个小时取样，测定菌体浓度(OD6tltl)以 及儿茶酚双加氧酶(BphC)的酶活。上述酶活测定方法超声波破碎细菌，离心去除细胞碎片，取一定量粗酶液用AP buffer (含10%丙酮的pH 7. 5PB缓冲液)稀释至3ml，加入50 μ 1的0. 2Μ的儿茶酚溶液， 振荡混勻。然后用UV-2500紫外分光光度计测定酶活的具体数据。将得到的数据除以对应时间的菌体浓度(OD6J，然后作图比较转化子P. putida CICC23651/pMMbphC 和 P. putida CICC 23651/pMMPcbphC 的数据，实验结果显示，本发明的 质粒不但可以组成型启动外源基因的表达，不需要添加任何诱导物也不需要进行任何额外 的诱导操作，而且诱导强度也比IPTG诱导的tac启动子表达系统高大约6倍，且诱导的速 度快，在12小时达到诱导强度的最大值，而IPTG诱导的tac启动子表达系统在14小时左 右达到诱导强度的最大值(具体数据见图4)。
权利要求
一种高启动强度宽宿主组成型表达质粒，命名为pMMPc，由复制子Ref1010、筛选标记基因bla(氨苄抗性基因)、多克隆位点、基因间序列和高启动强度组成型启动子Pc组成；其特征在于，所述质粒pMMPc的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；其中，所述高启动强度组成型启动子Pc的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.权利要求1中所述质粒pMMPc在革兰氏阴性菌中表达儿茶酚双加氧酶的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述儿茶酚双加氧酶的表达是以在质粒 pMMPc启动子Pc后插入儿茶酚双加氧酶的基因bphC实现。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述革兰氏阴性菌是大肠杆菌、施氏假单胞 菌或恶臭假单胞菌。
全文摘要
本发明公开了一种启动强度高启动速度快宿主范围宽的组成型表达质粒pMMPc及其在革兰氏阴性菌中表达儿茶酚双加氧酶的应用。本发明的质粒不但可以组成型启动外源基因的表达，不需要添加任何诱导物也不需要进行任何额外的诱导操作，而且诱导强度也比IPTG诱导的tac启动子表达系统高大约6倍，且诱导的速度快，表明该质粒在生物降解和生物修复领域具有巨大的应用潜力。
文档编号C12N9/02GK101955967SQ20101027756
公开日2011年1月26日 申请日期2010年9月9日 优先权日2010年9月9日
发明者徐友强, 许平, 陶飞, 马翠卿 申请人:山东大学