专利名称：一种提取微生物dna的试剂盒及其方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种提取微生物DNA的试剂盒，还涉及一 种提取微生物DNA的方法。
背景技术：
微生物是一切肉眼看不见或看不清的微小生物的总称，是包括细菌、病毒、真菌以 及一些小型的原生动物、显微藻类等在内的一大类生物群体。它们个体微小，结构简单，却 与人类生活关系密切，涵盖了有益有害的众多种类，广泛涉及健康、食品、医药、工业、农业、 环保等诸多领域。土壤微生物资源丰富，是陆地生态系统中重要的生命体，其对外界环境很敏感，抗 逆性较差，很容易受到各种不良外界环境的影响。因此，土壤微生物是常用的土壤生态系统 变化的预警及敏感指标。从土壤中获得微生物的传统方法是富集、培养、再分离，但是由于 自然生态环境中的绝大部分微生物还无法在实验室被成功培养，因此相当多的菌种由于无 法培养而不能被充分的开发和利用。同时，在此过程中也造成微生物多样性的丢失及种群 构成发生变化，这样就使得对土壤微生物群落结构、功能以及动态监测的研究受到了极大 的局限性和偏差。随着分子生物学和分子生态学技术的不断发展，不经过传统培养，直接从 土壤中提取微生物DNA，通过变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)、单链构象多态性(SSCP)或者 是限制性片段长度多态性(RFLP)等分子生物学方法来研究土壤微生物的多样性及种群情 况，已成为更能揭示土壤生态系统真实性的新途径。因此，从自然环境中提取微生物的基因 组DNA，不仅能检测不能培养的细菌，还能跟踪某些目标菌株或重组基因，从而揭示土壤微 生物生态系统中基因的多样性和监测土壤生态系统的变化。但是，土壤成分复杂，通常含有较多的可与微生物DNA共同提取出来的物质，如腐 殖酸、黄酸、酚类化合物、重金属离子等，这些物质可抑制PCR扩增中的Taq DNA聚合酶以 及酶切反应中的限制性内切酶的活性，影响下游实验；同时，微生物仅为土壤样品中极小的 一部分，微生物细胞常常紧密吸附于土壤颗粒表面，因此，从土壤样品中高效地获得微生物 DNA具有相当的难度。另外，不同土壤样品之间差异较大，使得不同类型的土壤会影响土壤 微生物DNA的提取效果，这对从环境样品中高效的提取DNA来说就更为困难。目前从土壤中提取微生物DNA的方法可分为直接法和间接法两类。直接法采用原 位裂解土壤微生物的方法，这种方法获得的基因组DNA都是粗提液，含有较多的杂质如腐 殖酸、黄酸等，会抑制下游实验，必需再经过纯化回收才能使用；而间接法则采用差速离心 回收菌体，然后再裂解菌体提取基因组DNA，但是这种提取方法需要专门的仪器，而且操作 步骤繁琐，耗时较多，也容易造成物种的丢失。针对土壤中微生物DNA提取的难点和特点， 一些大型生物公司研发出了提取土壤中微生物DNA的商业试剂盒，如Mo Bio UltraClean Soil DNAKit (MoBio Laboratories, Inc. , Solana Beach，Calif.)，虽然这种商业试剂盒使 用起来非常方便、快捷，但提取微生物DNA的效果并不理想。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种提取微生物DNA的试剂盒，采用该试剂盒 提取微生物DNA纯度高、通用性好、可靠性高、提取速度快。本发明的另一个目的在于提供一种提取微生物DNA的方法，该方法提取的微生物 DNA纯度高、通用性好、提取速度快，可直接用于下游实验。为实现上述目的，本发明提供一种提取微生物DNA的试剂盒，所述试剂盒包括裂解液I、裂解液II、抑制物去除液I，抑制物去除液II和结合液，所述裂解液I包 含 pH8. 0 50-200mM 的 Tris-HCl、ρΗ8· 0 50_150mM 的 EDTA、0. 5-3M 的 NaCl、0· 5-2% 的 CTAB 和0. 5-2%的PVP，所述裂解液II为使用终浓度为0. 5-2%的SDS，所述抑制物去除液I为 100-300mM的乙酸钾、乙酸钠或乙酸铵，所述抑制物去除液II为50_200mM的硫酸铝、硫酸铵 或硫酸铝铵，所述结合液包含3-6M的盐酸胍、pH7. 5 10-50mM的Tris-HCl和5-50%的异丙 醇。本发明所述裂解液I、裂解液II既含有阳离子去污剂，又含有阴离子去污剂，能够 针对广泛的微生物群落，彻底裂解样品，同时还含有去除多糖多酚效果的成分，能使核酸和 多糖多酚分离；所述的抑制物去除液I和抑制物去除液II能够最大限度的去除腐殖酸、黄 酸、蛋白质等杂质；结合液能够提高核酸和玻璃纤维素膜的结合能力。优选地，所述裂解液I 包含 pH8. 0 IOOmM 的 Tris-HCl、ρΗ8· OlOOmM 的 EDTA、1. 5M 的 NaCl、1 % 的 CTAB 和 1 % 的 PVP。优选地，所述裂解液II为使用终浓度为2%的SDS。优选地，所述抑制物去除液I为250mM的乙酸铵。优选地，所述抑制物去除液II为120mM的硫酸铝铵。优选地，所述结合液包含5M的盐酸胍、pH7. 5 20mM的Tris-HCl和30%的异丙醇。本发明所述提取微生物DNA的试剂盒还包括提取缓冲液、漂洗液、洗脱液和玻璃纤维素膜，所述提取缓冲液包含50_150mM的 异硫氰酸胍和150-200mM的磷酸钠，所述漂洗液包含pH7. 5 5_20mM的Tris-HCl、50-80%的 无水乙醇和50-200mM的NaCl，所述洗脱液为pH7. 0-8. 5 5-30mM的Tris-HCl，所述玻璃纤 维素膜孔径为0. 45 μ m。本发明所述的提取缓冲液能够降低土壤、粪便、淤泥、泥沙以及岩石样品对微生 物细胞的吸附作用，为提取微生物DNA提供最优的缓冲环境；漂洗液可以去除玻璃纤维素 膜上吸附的蛋白和其他代谢产物，如多糖、纤维素、脂类等；洗脱液是一种不含核酸酶的 低盐高PH值的溶液，能够把吸附在玻璃纤维素膜上的DNA洗脱下来；玻璃纤维素膜采用 Whatman公司的GF\B型号。优选地，所述提取缓冲液包含120mM的异硫氰酸胍和ISlmM的磷酸钠。优选地，所述漂洗液包含pH7. 5 IOmM的Tris_HCl、80 %的无水乙醇和IOOmM的 NaCl。优选地，所述洗脱液为pH8. 0 IOmM的Tris-HCl。本发明还提供一种提取微生物DNA的方法，包括以下步骤步骤1、将提取缓冲液和样品充分混勻，加入裂解液I振荡，再加入裂解液II水浴， 离心取上清液，所述样品为土壤、粪便、泥沙、岩石或淤泥，所述提取缓冲液包含50-150mM的异硫氰酸胍和150-200mM的磷酸钠，所述裂解液I包含pH8. 0 50_200mM的Tris_HCl、 pH8. 0 50-150mM 的 EDTA、0. 5-3M 的 NaCl、0. 5-2% 的 CTAB 和 0. 5-2% 的 PVP，所述裂解液 II 为使用终浓度为0. 5-2%的SDS ；步骤2、向步骤1所述上清液加入抑制物去除液I，充分混勻，冰浴，离心取上清液， 所述抑制物去除液I为100-300mM的乙酸钾、乙酸钠或乙酸铵；步骤3、向步骤2所述上清液加入抑制物去除液II，充分混勻，冰浴，离心取上清 液，所述抑制物去除液II为50-200mM的硫酸铝、硫酸铵或硫酸铝铵；步骤4、步骤3所述上清液与玻璃纤维素膜、结合液充分作用后漂洗，然后洗脱所 述玻璃纤维素膜上吸附的DNA，所述结合液包含3-6M的盐酸胍、pH7. 5 10_50mM的Tris-HCl 和5-50%的异丙醇，所述漂洗液包含pH7. 5 5-20mM的Tris-HCl、50_80 %的无水乙醇和 50-200mM 的 NaCl，所述洗脱液为 pH7. 0-8. 5 5-30mM 的 Tris-HCl。优选地，所述裂解液I 包含 pH8. 0 IOOmM 的 Tris-HCl、pH8. OlOOmM 的 EDTA、1. 5M 的 NaCl、1 % 的 CTAB 和 1 % 的 PVP。优选地，所述裂解液II为使用终浓度为2%的SDS。优选地，所述抑制物去除液I为250mM的乙酸铵。优选地，所述抑制物去除液II为120mM的硫酸铝铵。优选地，所述结合液包含5M的盐酸胍、pH7. 5 20mM的Tris-HCl和30%的异丙醇。优选地，所述漂洗液包含pH7. 5 IOmM的Tris_HCl、80 %的无水乙醇和IOOmM的 NaCl。优选地，所述洗脱液为pH8. 0 IOmM的Tris-HCl。由以上技术方案可知，采用本发明所述提取微生物DNA的试剂盒及方法，所提取 的微生物DNA纯度高、通用性好、提取速度快，可直接用于下游实验。
图1示从土壤中提取微生物DNA的琼脂糖凝胶电泳图；泳道M 分子量Marker，从上至下依次为23kb、9. 4kb、6. 5kb ；泳道1 本发明从土 壤中提取的微生物DNA条带；泳道2 :Mo BioUltraClean Soil DNAKit从土壤中提取的微生 物DNA条带；图2示从土壤中提取微生物DNA的扩增16S rRNA基因的琼脂糖凝胶电泳图；泳道M 分子量 Marker，从上至下依次为 2. Okb、1. 0kb、750bp、500bp、250bp、 IOObp ；泳道1-4 =Mo Bio UltraClean Soil DNA Kit方法从土壤中提取的微生物DNA梯度 稀释0倍、10倍、50倍、100倍后作为模板扩增16S rRNA基因的PCR产物结果；泳道5_8 本发明从土壤中提取的微生物DNA梯度稀释0倍、10倍、50倍、100倍后作为模板扩增16S rRNA基因的PCR产物结果。
具体实施例方式本发明公开了一种提取微生物DNA的试剂盒，还公开了一种提取微生物DNA的方 法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有 类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的试剂盒及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内 容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本 发明技术。依照本发明，所述提取微生物DNA的试剂盒包括裂解液I、裂解液II、抑制物去除液I，抑制物去除液II和结合液，所述裂解液I包 含 pH8. 0 50-200mM 的 Tris-HCl、ρΗ8· 0 50_150mM 的 EDTA、0. 5-3M 的 NaCl、0· 5-2% 的 CTAB 和0. 5-2%的PVP，所述裂解液II为使用终浓度为0. 5-2%的SDS，所述抑制物去除液I为 100-300mM的乙酸钾、乙酸钠或乙酸铵，所述抑制物去除液II为50_200mM的硫酸铝、硫酸铵 或硫酸铝铵，所述结合液包含3-6M的盐酸胍、pH7. 5 10-50mM的Tris-HCl和5-50%的异丙本发明所述裂解液I、裂解液II既含有阳离子去污剂，又含有阴离子去污剂，能够 针对广泛的微生物群落，彻底裂解样品，同时还含有去除多糖多酚效果的成分，能使核酸和 多糖多酚分离；所述的抑制物去除液I和抑制物去除液II能够最大限度的去除腐殖酸、黄 酸、蛋白质等杂质；结合液能够提高核酸和玻璃纤维素膜的结合能力。优选地，所述裂解液I 包含 pH8. 0 IOOmM 的 Tris-HCl、pH8. OlOOmM 的 EDTA、1. 5M 的 NaCl、1 % 的 CTAB 和 1 % 的 PVP。优选地，所述裂解液II为使用终浓度为2%的SDS。优选地，所述抑制物去除液I为250mM的乙酸铵。优选地，所述抑制物去除液II为120mM的硫酸铝铵。优选地，所述结合液包含5M的盐酸胍、pH7. 5 20mM的Tris-HCl和30%的异丙醇。本发明所述提取微生物DNA的试剂盒还包括提取缓冲液、漂洗液、洗脱液和玻璃纤维素膜，所述提取缓冲液包含50_150mM的 异硫氰酸胍和150-200mM的磷酸钠，所述漂洗液包含pH7. 5 5_20mM的Tris-HCl、50-80%的 无水乙醇和50-200mM的NaCl，所述洗脱液为pH7. 0-8. 5 5-30mM的Tris-HCl，所述玻璃纤 维素膜孔径为0. 45 μ m。本发明所述的提取缓冲液能够降低土壤、粪便、淤泥、泥沙以及岩石样品对微生 物细胞的吸附作用，为提取微生物DNA提供最优的缓冲环境；漂洗液可以去除玻璃纤维素 膜上吸附的蛋白和其他代谢产物，如多糖、纤维素、脂类等；洗脱液是一种不含核酸酶的 低盐高PH值的溶液，能够把吸附在玻璃纤维素膜上的DNA洗脱下来；玻璃纤维素膜采用 Whatman公司的GF\B型号。 优选地，所述提取缓冲液包含120mM的异硫氰酸胍和ISlmM的磷酸钠。优选地，所述漂洗液包含pH7. 5 IOmM的Tris_HCl、80 %的无水乙醇和IOOmM的 NaCl。优选地，所述洗脱液为pH8. OlOmM的Tris-HCl。本发明还提供一种提取微生物DNA的方法，包括以下步骤步骤1、将提取缓冲液和样品充分混勻，加入裂解液I振荡，再加入裂解液II水浴， 离心取上清液，所述样品为土壤、粪便、泥沙、岩石或淤泥，所述提取缓冲液包含50-150mM 的异硫氰酸胍和150-200mM的磷酸钠，所述裂解液I包含pH8. 0 50_200mM的Tris-HCl、 pH8. 0 50-150mM 的 EDTA、0. 5-3M 的 NaCl、0. 5-2% 的 CTAB 和 0. 5-2% 的 PVP，所述裂解液 II为使用终浓度为0. 5-2%的SDS ；步骤2、向步骤1所述上清液加入抑制物去除液I，充分混勻，冰浴，离心取上清液， 所述抑制物去除液I为100-300mM的乙酸钾、乙酸钠或乙酸铵；步骤3、向步骤2所述上清液加入抑制物去除液II，充分混勻，冰浴，离心取上清 液，所述抑制物去除液II为50-200mM的硫酸铝、硫酸铵或硫酸铝铵；步骤4、步骤3所述上清液与玻璃纤维素膜、结合液充分作用后漂洗，然后洗脱所 述玻璃纤维素膜上吸附的DNA，所述结合液包含3-6M的盐酸胍、pH7. 5 10_50mM的Tris-HCl 和5-50%的异丙醇，所述漂洗液包含pH7. 5 5-20mM的Tris-HCl、50_80%的无水乙醇和 50-200mM 的 NaCl，所述洗脱液为 pH7. 0-8. 5 5-30mM 的 Tris-HCl。优选地，所述裂解液I 包含 pH8. 0 IOOmM 的 Tris-HCl、pH8. OlOOmM 的 EDTA、1. 5M 的 NaCl、1 % 的 CTAB 和 1 % 的 PVP。优选地，所述裂解液II为使用终浓度为2%的SDS。优选地，所述抑制物去除液I为250mM的乙酸铵。优选地，所述抑制物去除液II为120mM的硫酸铝铵。优选地，所述结合液包含5M的盐酸胍、pH7. 5 20mM的Tris-HCl和30%的异丙醇。优选地，所述漂洗液包含pH7. 5 IOmM的Tris_HCl、80 %的无水乙醇和IOOmM的 NaCl。优选地，所述洗脱液为pH8. 0 IOmM的Tris-HCl。取相同样品量采用本发明的方法和MO BIO公司的Mo BioUltraClean Soil DNA Kit (MoBio Laboratories, Inc. , Solana Beach, Calif.)的方法分别提取 DNA，本发明所提 取的DNA的0D260/0D280值与MOBIO公司的试剂盒所提取的DNA相当，但0D260/0D230值 比MO BIO公司的试剂盒所提取的DNA更接近标准值，表明本发明所提取的DNA杂质较少； 在通过PCR扩增16S rRNA基因的部分片段来进一步检测所提取DNA纯度的实验中，本发明 提取的DNA在稀释0倍、10倍、50倍、100倍后都扩增出预期大小的PCR产物，而MO BIO公 司的试剂盒所提取的DNA只有在稀释DNA的前提下才扩增出PCR产物，PCR扩增实验结果 进一步表明本发明提取的DNA纯度高，可用于下游实验。下面结合实施例进一步阐述本发明。实施例1 本发明所述提取微生物DNA的试剂盒本发明所述提取微生物DNA的试剂盒包括提取缓冲液120mM的异硫氰酸胍、181mM pH值为7. 0的Na3P04。具体配制方法 称取异硫氰酸胍1. 42克，加入足够的蒸馏水进行充分溶解，然后加入pH为7. 0、浓度为IM 的Na3P0418. 1ml，充分混勻，定容到100ml。裂解液 I IOOmM 的 Tris-HCl (pH 为 8. 0)、IOOmM 的 EDTA (pH 为 8. 0)、1. 5M 的 NaCl、 1 %的CTAB、1 %的PVP。具体配制方法分别称取1克CTAB和1克PVP10，加适量蒸馏水分 别溶解，然后加入 IM 的 Tris-HCl (pH 为 8. 0) IOml, 0. 5M 的 EDTA(pH 为 8. 0) 20ml, 5M 的 NaCl 30ml，然后定容到100ml。裂解液11 终浓度为2 %的SDS。抑制物去除液I :250mM的乙酸铵。具体配制方法取250 μ 1 IOM的乙酸铵，加入 蒸馏水定容到10ml。
抑制物去除液II :120mM的硫酸铝铵。结合液5M的盐酸胍、20mM的Tris-HCl (pH为7. 5)、30%的异丙醇。具体配制方 法称取47. 75克盐酸胍，加蒸馏水充分溶解，然后加入IM的Tris-HCl (pH为7. 5) 2ml，异 丙醇30ml，定容到IOOml，充分混勻。漂洗液IOmM的pH值为7. 5的Tris-HClUOOmM的NaCl、80%的无水乙醇。具体 配制方法量取PH值为7. 5，浓度为IM的Tris-HCl lml，再量取5M的NaCl 2ml，加入适量 的RNase-free的蒸馏水混勻，再加入80ml的无RNase-free的无水乙醇，定容到100ml，充 分混勻。洗脱液=IOmM的 Tris-HCl, pH 值为 8. 0。玻璃纤维素膜吸附柱0. 45 μ m玻璃纤维素膜，Whatman公司，GF/B型，1. 5mL离心 柱。实施例2 从土壤中提取微生物DNA利用实施例1所述试剂盒进行提取。1、提取试剂提取缓冲液120mM的异硫氰酸胍、181mM pH值为7. 0的Na3P04。裂解液I IOOmM 的 Tris-HCl (pH 为 8. 0)、IOOmM 的 EDTA (pH 为 8. 0)、1. 5M 的 NaCl、 的 CTAB、1% 的 PVP。裂解液11 终浓度为2 %的SDS。抑制物去除液I :250mM的乙酸铵。抑制物去除液II :120mM的硫酸铝铵。结合液5M的盐酸胍、20mM的Tris-HCl (pH为7. 5)、30%的异丙醇。漂洗液10mM的pH值为7. 5的Tris-HClUOOmM的NaCl、80%的无水乙醇。洗脱液=IOmM的 Tris-HCl, pH 值为 8. 0。玻璃纤维素膜吸附柱0. 45 μ m玻璃纤维素膜，Whatman公司，GF/B型，1. 5mL离心 柱。2、提取方法(1)取大树下靠近根系的土壤样品，用单层纱布筛去树根和大块土壤，称取0.5 克，置于5ml的灭菌离心管中，加入1. 5ml提取缓冲液，涡旋振荡30秒充分混勻；(2)加入120 μ 1的裂解液I，涡旋振荡充分混勻，37°C，200rpm振荡30分钟；(3)加入200μ 1裂解液II，70°C水浴10分钟，期间每隔3分钟涡旋混勻一次， 12000rpm离心1分钟，取上清；(4)加入上清1/2体积的抑制物去除液I，充分混勻，冰浴10分钟，12000rpm离心
3分钟，取上清；(5)加入上清1/3体积的抑制物去除液II，充分混勻，冰浴10分钟，12000rpm离心
3分钟，取上清；(6)加入上清1.5倍体积的结合液，充分混勻，把所得混合液(可以分几次)加入 到含有玻璃纤维素膜的吸附柱中，12000rpm离心30秒，弃流出液；(7)在吸附柱上加入漂洗液，12000rpm离心30秒，弃流出液；再加入漂洗液洗涤一 次，弃流出液，然后再12000rpm离心2分钟；
(8)转移吸附柱到一个干净的1. 5ml离心管中，在吸附柱中加入事先65°C温浴的 洗脱液100 μ 1，室温放置1分钟，12000rpm离心1分钟，收集流出液。收集的流出液再加入 到吸附柱中重复洗脱一次，收集流出液，流出液即为所提土壤样品中微生物DNA。实施例3 提取的微生物DNA浓度及纯度检测与实施例1相同、等量的土壤样品用Mo Bio UltraClean Soil DNAKit提取微生 物DNA，对实施例1所提取的微生物DNA及用Mo BioUltraClean Soil DNA Kit提取的微生 物DNA进行浓度及纯度检测，结果参见表1。表1微生物DNA浓度及纯度检测
本发明方法Mo Bio UltraClean Soil DNA KitDNA 浓度(μ g/ml)104860D260/0D2801. 71. 860D260/0D2300. 940. 87结果显示，实施例1所提取的微生物DNA浓度大于用Mo BioUltraClean Soil DNA Kit提取的微生物DNA浓度；本发明所提取的DNA的0D260/0D280值与标准值(1. 8)无明 显差异，但0D260/0D230值比MO BIO公司的试剂盒所提取的DNA更接近标准值(1. 7-2. 0)。 以上结果表明，相同样品量，本发明所提取的DNA浓度高，且杂质较少。实施例4 提取的微生物DNA琼脂糖凝胶电泳检测将实施例1所提取的微生物DNA及实施例2用Mo Bio UltraCleanSoil DNA Kit 提取的微生物DNA进行1 %琼脂糖凝胶电泳检测，结果参见图1。结果显示，本发明所提取的 DNA经琼脂糖凝胶电泳检测显示出单一的目的条带，没有出现杂带，并且条带亮度明显亮于 Mo BioUltraClean Soil DNA Kit提取的微生物DNA的条带。以上结果进一步表明，本发明 所提取的微生物DNA纯度高、杂质少。实施例5 提取的微生物DNA扩增16S rRNA基因将实施例1所提取的微生物DNA及实施例2用Mo Bio UltraCleanSoil DNA Kit 提取的微生物DNA梯度稀释为O倍、10倍、50倍、100倍后作为模板，使用16S rRNA基因通 用引物27F和1492R扩增16SrRNA基因的部分片段来进一步检测所提取土壤样品基因组 DNA的纯度，结果参见图2。其中，扩增引物为27F 5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，；1492R :5，-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，。PCR反应体系与反应条件参见表1、表2。表1 PCR反应体系
权利要求
一种提取微生物DNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括裂解液I、裂解液II、抑制物去除液I，抑制物去除液II和结合液，所述裂解液I包含pH8.0 50 200mM的Tris HCl、pH8.0 50 150mM的EDTA、0.5 3M的NaCl、0.5 2％的CTAB和0.5 2％的PVP，所述裂解液II为使用终浓度为0.5 2％的SDS，所述抑制物去除液I为100 300mM的乙酸钾、乙酸钠或乙酸铵，所述抑制物去除液II为50 200mM的硫酸铝、硫酸铵或硫酸铝铵，所述结合液包含3 6M的盐酸胍、pH7.5 10 50mM的Tris HCl和5 50％的异丙醇。
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述裂解液I包含pH8.OlOOmM的 Tris-HCl、pH8. 0 IOOmM 的 EDTA、1. 5M 的 NaCl、l % 的 CTAB 禾口 1 % 的 PVP。
3.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述裂解液II为使用终浓度为2%的SDS。
4.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述抑制物去除液I为250mM的乙酸铵。
5.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述抑制物去除液II为120mM的硫酸铝铵。
6.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述结合液包含5M的盐酸胍、pH7.5 20mM 的Tris-HCl和30%的异丙醇。
7.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括提取缓冲液、漂洗液、洗脱液和玻璃纤维素膜，所述提取缓冲液包含50-150mM的异硫 氰酸胍和150-200mM的磷酸钠，所述漂洗液包含pH7. 55_20mM的Tris_HCl、50-80%的无水 乙醇和50-200mM的NaCl，所述洗脱液为pH7. 0-8. 5 5-30mM的Tris-HCl，所述玻璃纤维素 膜孔径为0. 45 μ m。
8.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，所述提取缓冲液包含120mM的异硫氰酸胍 禾口 18ImM的磷酸钠，所述漂洗液包含pH7. 5 IOmM的Tris_HCl、80%的无水乙醇和IOOmM的 NaCl，所述洗脱液为 pH8. 0 IOmM 的 Tris-HCl。
9.一种提取微生物DNA的方法，包括以下步骤步骤1、将提取缓冲液和样品充分混勻，加入裂解液I振荡，再加入裂解液II水浴，离心 取上清液，所述样品为土壤、粪便、泥沙、岩石或淤泥，所述提取缓冲液包含50-150mM的异 硫氰酸胍和150-200mM的磷酸钠，所述裂解液I包含pH8. 0 50-200mM的Tris_HCl、pH8. 0 50-150mM 的 EDTA、0. 5-3M 的 NaCl、0. 5-2% 的 CTAB 和 0. 5-2% 的 PVP，所述裂解液 II 为使 用终浓度为0. 5-2%的SDS;步骤2、向步骤1所述上清液加入抑制物去除液I，充分混勻，冰浴，离心取上清液，所述 抑制物去除液I为100-300mM的乙酸钾、乙酸钠或乙酸铵；步骤3、向步骤2所述上清液加入抑制物去除液II，充分混勻，冰浴，离心取上清液，所 述抑制物去除液II为50-200mM的硫酸铝、硫酸铵或硫酸铝铵；步骤4、步骤3所述上清液与玻璃纤维素膜、结合液充分作用后漂洗，然后洗脱所述玻 璃纤维素膜上吸附的DNA，所述结合液包含3-6M的盐酸胍、pH7. 5 10-50mM的Tris-HCl 和5-50 %的异丙醇，所述漂洗液包含pH7. 55-20mM的Tri s_HCl、50-80 %的无水乙醇和 50-200mM 的 NaCl，所述洗脱液为 pH7. 0-8. 5 5-30mM 的 Tris-HCl。
10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，所述裂解液I包含pH8.OlOOmM的Tris-HCl, ρΗ8. O IOOmM 的 EDTA、1. 5Μ 的 NaCl、1 % 的 CTAB 禾Π 1 % 的 PVP，所述裂解液 II 为 使用终浓度为2%的SDS，所述抑制物去除液I为250mM的 乙酸铵，所述抑制物去除液II为 120mM的硫酸铝铵，所述结合液包含5M的盐酸胍、pH7. 5 20mM的Tris-HCl和30%的异丙醇。
全文摘要
本发明涉及分子生物学领域，公开了一种提取微生物DNA的试剂盒及方法。该试剂盒包括裂解液、抑制物去除液和结合液，所述裂解液包含50-200mM的Tris-HCl、50-150mM的EDTA、0.5-3M的NaCl、0.5-2％的CTAB、0.5-2％的PVP和0.5-2％的SDS；抑制物去除液为100-300mM的乙酸钾、乙酸钠或乙酸铵和50-200mM的硫酸铝、硫酸铵或硫酸铝铵；结合液包含3-6M的盐酸胍、10-50mM的Tris-HCl和5-50％的异丙醇。本发明试剂盒及方法提取的微生物DNA纯度高、通用性好、提取速度快，可直接用于下游实验，适用于从包含微生物的样品中提取DNA。
文档编号C12N15/10GK101935647SQ20101028159
公开日2011年1月5日 申请日期2010年9月13日 优先权日2010年9月13日
发明者李艳萍 申请人:原平皓(天津)生物技术有限公司