专利名称：一种非洲猪瘟病毒核酸扩增引物、检测方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及一种非洲猪瘟病毒核酸扩增引物、检测 方法和试剂盒。
背景技术：
非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种急性、热性传染病，其特征是发病过程短， 死亡率高达100%，该病国际兽疫局(OIE)将其归入A类疾病，我国将其划入1类疾病，由于 我国目前无非洲猪瘟病发生，因此无法在发病猪体内进行直接检测。1.国内外现有的非洲猪瘟(ASF)检测技术
①血吸附(HAD)试验是ASF最经典的检疫方法之一，该方法敏感性较高，缺点是费 时、操作繁琐且技术要求高，需制备、培养骨髓细胞，且不能用于非血吸附毒株的诊断。②血清学检测技术由于感染康复猪血清中的非洲猪瘟病毒(ASFV)特异抗体能 维持很长时间甚至终生，可用ELISA等常规免疫学方法检测。Wardley等(1979)建立的 ELISA方法能检测到50-500HAD5(1/ml的ASFV ；Vidal等(1997)用p72特异单抗建立了检测 ASFV的夹心ELISA ；蒋正军等(2000)用杆状病毒表达的重组p72抗原建立了检测ASFV特 异抗体的间接ELISA。尽管ELISA具有一定的特异性和敏感性，但主要用于感染康复和慢性 感染猪血清中ASFV抗体的检测，不适合急性感染和临床前检测，而且操作较复杂，反应时 间较长，有时出现假阴性，目前已不是ASF诊断的首选。③PCR检测技术根据ASFV高度保守基因序列设计PCR引物，理论上可以扩增 出包括非血吸附和低毒力分离株在内的所有ASFV病毒核酸。Steiger等(1992)首先根 据ASFV DNA保守区序列设计2对PCR引物，用建立的PCR检测细胞培养和感染组织中的 ASFV，具有灵敏、快速优点，但检测血液样品时易出现非特异条带；孙书华等(1995)在国内 率先建立了 ASFV p72基因的PCR扩增方法，但未进行病毒感染细胞和临床样品的检测；蒋 正军等(2000)根据ASFV p72基因序列设计两对引物，用建立的PCR对4个毒株感染细胞 培养、感染猪组织和200份临床样本进行检测，结果显示与HAD试验的阳性符合率为100% ； Gonzague等(2002)和Aguero等(2003)建立了可用于临床样本中ASFV快速诊断的PCR方 法；King等(2003)建立了检测ASFV的TaqManPCR技术；Zsak等(2005)建立了用于接触 ASFV猪临床前诊断的实时定量PCR技术。PCR检测技术的特出优点是快速和敏感性高，还 适合因腐败等原因不能进行病毒分离或抗原检测样品的检测，适合动物及其产品的进出口 检疫，已成为ASF检疫技术的主要发展方向之一，但有时存在假阳(阴)性问题，需用其它检 测方法予以证实。然而，上述ASFV检测方法通常仅限于在ASF疫区国家和少数非疫区国家的专门实 验室使用，而国内建立的ASFV诊断方法的敏感性、特异性和实用性尚需临床实践验证，目 前我国动物检疫部门还缺少敏感、特异、使用方便、价格经济的ASFV检测方法。随着我国周 边地区ASF的发生(如格鲁吉亚)，以及各种国际交往，特别是与非洲、拉美国家交往的增多， ASF对我国的潜在威胁越来越大，因此研制快速、特异、敏感、廉价的ASFV检疫技术已迫在眉睫。2.核酸扩增纳米金检测技术
核酸扩增纳米金检测技术是在DNA芯片基础上发展起来的检测特定核苷酸序列新技 术，纳米金是直径为I-IOOnm的金颗粒，分散在水中的水溶胶又称纳米金，具有巨大的比表 面、尺寸量子效应和化学反应活性，作为免疫学试验标记物使用已又很长的历史。纳米金核 酸扩增技术的基本原理是以烷巯基寡核苷酸修饰的纳米金颗粒为报告基团，将探针与靶序 列杂交，通过捕捉探针也可与同一条靶序列杂交，将形成的复合物捕捉、固定于酶标板中， 通过银染色可将敏感性提高IO5倍，能检测浓度为IOfM的靶片段，直接用肉眼观察酶标板 孔中颜色变化即可作出判断，为非洲猪瘟病毒提供了一种简便、快速、廉价的检测方法。目 前国内外尚无核酸扩增纳米金检测非洲猪瘟病毒感染方面的报道。
发明内容
本发明的目的是要克服非洲猪瘟病毒现有检测技术的不足之处，提供一种非洲猪 瘟病毒核酸扩增的引物、检测用的探针，以及应用上述引物和探针检测非洲猪瘟病毒的方法。本发明所说的用于非洲猪瘟病毒核酸扩增和检测的PCR引物对和特异性核酸探 针，选自下列各组
(a)正向引物5，-CGTATCTGGACATAAGACGT-3，，(SEQID NO 1) 反向引物5，-ATGCGTCTGGAAGAGCTGT-3，； (SEQ ID NO 2)
生物素标记的捕捉探针5，-生物素-TTTTTTTTTTGCGCAAGAGGGGGCTGATAG-，3 ； (SEQ ID NO :3的5，端经生物素修饰)
巯烷基标记的检测探针5，-ATTGCGTCTACTGGGGCGTCTTTTTTTTTT-0- (CH2)「SH-3，； (SEQ ID NO :4的3，端经巯烷基修饰)
(b)正向引物5，-ATAAGCTTTCAGGATAGAG-3，，(SEQ ID NO 5) 反向引物:5，-CATAATCCGTGTCCCAACT -3，，(SEQ ID NO 6)
生物素标记的捕捉探针5，-生物素-TTTTTTTTTTAGGGTATGTAAGAGCTGCAG-3，； (SEQ ID NO :7的5，端经生物素修饰)
巯烷基标记的检测探针5，- ATACCATGAGCAGTTACGGTTTTTTTTTT-O-(CH2)3-SH-3，； (SEQ ID NO :8的3，端经巯烷基修饰)
(c)正向引物5，-CACGCAGAAATAAGCTTTC-3，，(SEQ ID NO 9) 反向引物:5，-CGTGTCCCAACTAATATAA- 3，，(SEQ ID NO 10)
生物素标记的捕捉探针5’ _ 生物素 _ TTTTTTTTTTGGTATTCCTCCCGTGGCTTC-3’ ； (SEQ ID NO 11的5’端经生物素修饰)
巯烷基标记的检测探针5，-GCGTCTGGAAGAGCTGTATCTTTTTTTTTT-0- (CH2)「SH-3，(SEQ ID NO 12的3，端经巯烷基修饰)。本发明还公开了上述PCR引物对和特异性核酸探针在检测非洲猪瘟病毒中的应用。所述的应用是在金标银染法中的应用，包括以下步骤 (a)利用PCR引物扩增待测样本中核酸；(b)将烷巯基标记的检测探针标记至纳米金颗粒上；
(c)将生物素标记的捕捉探针和步骤(b)纳米金标记的检测探针与变性的PCR产物杂
、-
父；
(d)将步骤(c)的杂交体系加入包被链亲素的酶标板，捕捉杂交复合物；
(e)弃去未能吸附的反应液，加入银染增强液，放大酶标板上间接吸附的纳米金颗粒信
号；
(f)终止银染增强反应，肉眼观察灰度判定结果。所述的(b)步骤中对烷巯基修饰的核酸探针进行纳米金标记，标记的纳米金颗粒 大小30-80nm。进一步地，标记时为了使结合到纳米金颗粒上的核酸数量少，以便(c)步骤 中杂交形成的复合物上有更多的金颗粒，提高反应灵敏度，建议使用低盐、高缓冲能力的缓 冲体系(如0. 01mol/L PB, ρΗ7· 0)，要求缓冲体系的ρΗ值为7. 0-7. 8。所述(c)步骤中，将步骤(a)扩增的PCR产物94°C变性5min后快速冷却，加入生 物素修饰探针和纳米金标记的探针，混勻。所述(d)步骤中的链亲素吸附的酶标板在制备时，将链亲素用pH 7.4、0.01mol/L PBS稀释成20ug/mL，4°C过夜包被高吸附性酶标板，再将(c)步骤中的杂交反应体系加入其 中，42°C继续杂交并使杂交复合物吸附至酶标板上，反应时间30min。本发明还公开了包含上述PCR引物对和特异性核酸探针的非洲猪瘟病毒检测试剂盒。本发明的原理是
1.设计一对引物，要求该引物具有特异性，只针对非洲猪瘟病毒核酸，并以此为模板， PCR方法可进行相应核酸片段的扩增，PCR扩增非洲猪瘟病毒核酸片段时，PCR循环次数 25-30 次。2.根据PCR扩增出的非洲猪瘟核酸序列，设计两条修饰了核酸探针，要求其中一 条进行生物素修饰(捕捉探针)，另一条进行烷巯基修饰(检测探针)，且该两条探针必须与 PCR产物中的同一条单链能够杂交(严格互补配对)，而不与其他能感染猪的病毒核酸及猪 基因组核酸杂交。根据设计的特异性引物和探针采用金标银染法检测待测样本。根据样品检测孔与 实验阴性对照孔灰度的不同，判定实验结果，有非洲猪瘟病毒的检测样品最终反应结果呈 现黑色，而无非洲猪瘟病毒的阴性孔反应结果呈无色，或淡灰色。本发明的优点是核酸扩增纳米金技术(金标银染法)检测非洲猪瘟病毒具有检测 快速、检测方便、灵敏度高、价格低廉、结果易判定等特点，减少出入境隔离饲养成本；操作 过程不需要特殊的仪器设备，节省检测仪器设备的投入、维持费用；在核酸扩增基础上的纳 米金进一步的检测，有效避免PCR检测时出现假阳(阴)性现象，可检测IOfmol甚至更少量 的非洲猪瘟病毒核酸扩增产物，检测灵敏度可与荧光定量PCR相媲美；低廉的制作成本，不 但可为国家节省购买进口检测试剂盒费用，还适用于大量样本的成批检测。
图1是酶标板孔内反应示意图。
图2是检测靶核酸PCR扩增结果1.DNA分子质量标准；
2-4. PCR扩增出的检测靶核酸。图3是核酸探针检测ASFV p72基因结果
1.检测靶核酸浓度为InM；
2.检测靶核酸浓度为IOOpM；
3.检测靶核酸浓度为IOpM；
4.检测靶核酸浓度为IpM；
5.检测靶核酸浓度为IOOfM；
6.检测靶核酸浓度为IOfM；
7.检测靶核酸浓度为IfM；
8.阴性对照；
9.空白对照。图4是不同基因型ASFV PCR结果
1.λ DNAEco 1310分子质量标准；2.ASFVBenin97/1 Genotype I ；3.ASFV0URT88/3 Genotype I ；4.ASFV0URT88/1 Genotype I ；5.ASFVUganda 95/3 Genotype X ；6.ASFVUganda95/1 Genotype IX ；7.ASFVVir Uganda ；8.ASFVMalawi LIL20/1 Genotype VDI9.ASFVTengani 60 Genotype V ；10..ASFV RSA 99/1 Genotype IV11,.ASFV Malta 78 Genotype I ；12,.空白对照。图5是10株ASFV核酸扩增纳米金检测结果
1.Benin97/1 ；2. 0URT88/3 ； 3. 0URT88/1 ；4. Uganda95/3 ；5.Uganda95/1 ；6.Vir Uganda ；7. Malawi LIL20/1 ；8. Tengani60 ；9. RSA99/1 ；10 Malta78 ；11.质粒 pcDNA_vp72 ； 12.阴性对照。图6是ASFV Benin97/1核酸扩增纳米金检测敏感性结果。图7是其他病毒核酸及正常猪DNA为模板PCR扩增结果。1. XDNA/Ecol310 分子质量标准；
2.PRV ；
3.PPV ；
4.PCV-2 ；
5.CSFV ；
6.PRRSV；
7.健康猪组织DNA。图8是纳米金核酸扩增检测其他DNA结果
1.阳性对照；2. PRV ；3. PPV ；4. PCV-2 ；5. CSFV ；6. PRRSV ；7.健康猪组织 DNA ；8.空白对照。
具体实施例方式本发明人利用本科研小组构建的携带非洲猪瘟p72基因的重组质粒以及从国外 引进的非洲猪瘟病毒基因组分别作为检测目标，以核酸扩增纳米金检测方法对其进行检 测。本发明的具体实施方式
结合下面两实施例来阐述。实施例1 以携带非洲猪瘟病毒p72基因的重组质粒pcDNA-p72作为检测目标进 行检测
1.引物及探针的设计对来自不同国家、地区的22株ASFV(ol、BA71、BEN、cam、crol. 2、 cro3. 5、DR2、E70> E75> F6> ht、KU ker、Ml、Malawi> mk、Pr4> Pr5> ten、vie、wb、Za) p72 基因(Accession NO. AY578701. 1、FJ174348. 1、EF121428. 1、AF511452. 1、AY578690. 1、 AY578691. 1、L76727. 1、AY578692. 1、AY578693. 1、AY578694. 1、AY578695. 1、AY578696. 1、 AY578697. UAY578699. UAY261361. UAY578700. UAY578702. UAY578703. UAY578704. 1、 AY578705. UAY578707. UAY578708. 1)进行了比对分析，找出一高度保守、长度为651bp区 域(905-1555bp)作为被检序列，设计、合成PCR引物及标记探针 正向引物 5，-CGTATCTGGACATAAGACGT-3，(SEQ ID NO 1)； 反向引物 5，-ATGCGTCTGGAAGAGCTGT-3’ (SEQ ID NO 2)；
生物素捕捉探针 5’ -生物素-TTTTTTTTTTGCGCAAGAGGGGGCTGATAG-’ 3(SEQ ID NO 3 的 5’端经生物素修饰)；
巯烷基标记检测探针 5，-ATTGCGTCTACTGGGGCGTCTTTTTTTTTT-0-(CH2)「SH-3，(SEQ ID NO :4的3，端经巯烷基修饰)。2.纳米金检测探针的标记①纳米金溶液500uL，常温下13000rpm离心15min， 弃上清，保留胶油状纳米金颗粒；②在其中加入巯烷基标记的检测探针(100Umol/L)3UL 和 47uL TE 缓冲液(10mmol/L Tris · Cl，lmmol/L EDTA, ρΗ7. 4)，混勻，4°C静置 12h 后，加 入50uL的20mmol/L pH7. 0 PB缓冲液，混勻后4°C继续静置24h ；③常温下13000rpm离心 15min，弃上清，保留胶油状纳米金颗粒；④用IOOuL超纯水重悬，13000rpm离心15min，弃上 清，并重复一次；⑤IOOuL 10mmol/L pH7. 0 PB缓冲液重悬纳米金颗粒，4°C储存。通过该标记方法，单链核酸未发生降解，当加入1. 2ug烷巯基检测探针时，最终被 标记到胶体金上的核酸可达1. 05ug。3.链亲素包被酶标板用0. 05M pH9. 6碳酸盐缓冲液、0. 02M pH8. 0 Tris-Cl缓冲 液以及0. OlM pH7. 4 PBS分别稀释10ug/ml链亲素，4°C条件下分别包被国产酶标条、国产 酶标软板以及Greiner Microlon高吸附能力酶标板10小时，5%脱脂乳封闭后，加入辣根 过氧化物酶标记的生物素，进行直接ELISA试验，试验结果表明，以0. OlM pH7.4 PBS作为 链亲素稀释液，包被Greiner Microlon高吸附能力酶标板时效果最佳。将链亲素用0. OlM PH7. 4 PBS做梯度稀释，在Greiner Microlon高吸附能力酶标板上进行直接ELISA试验，确 定链亲素最佳包被浓度为20ug/ml。4.目的核酸的扩增及检测用正反向引物扩增出ASFV p72基因中大小为651bp的核酸片段(图2)，回收该核酸，并进行梯度稀释，以此作为检测靶核酸，94°C变性5min后快 速冷却，加入IOuL捕捉探针(10nmol/L)、5UL上述纳米金标记的检测探针以及IOuL的待检 测核酸于20uL的杂交液(0. 01%SDS, 10mmol/L PB, pH7. 8)中，混勻后加入吸附有链亲素的 酶标板中42°C进行杂交30min，杂交结束后0. 01mol/L PBS洗涤酶标板中未能结合上的复 合物，每孔再加IOOuL银染液(25% AgNO3溶液12uL ；5. 7%氢醌溶液300uL ；25. 5%柠檬酸、 23. 5%柠檬酸三钠溶液IOOuL)避光放大纳米金信号(示意图1)，反应3-5min即浸泡于蒸馏 水中，终止反应，并拍干酶标板，肉眼观察并判定检测结果，结果显示，该方法可检测到浓度 为IOfM的非洲猪瘟病毒核酸扩增样品，检测孔呈现黑色，而无非洲猪瘟病毒核酸的阴性孔 呈无色，或淡灰色，如图3。实施例2 10株非洲猪瘟病毒基因组作为检测目标进行检测
1.引物及探针的设计DNAstar分析软件对已发表的100株不同基因型的ASFV p72基 因进行比较，确定其中1516-1836位核苷酸序列高度保守，设计、合成2对PCR引物、生物素 标记的捕捉及烷巯基标记的检测探针各两对
Fl :5’ -ATAAGCTTTCAGGATAGAG -3，(SEQ ID NO 5)； Rl :5’ -CATAATCCGTGTCCCAACT -3，(SEQ ID NO 6)； F2 :5，-CACGCAGAAATAAGCTTTC -3，(SEQ ID NO 9) R2 :5，-CGTGTCCCAACTAATATAA- 3，(SEQ ID NO 10)
捕捉探针 Cl :5，_ 生物素-TTTTTTTTTTAGGGTATGTAAGAGCTGCAG-3，(SEQ ID N0:7 的 5， 端经生物素修饰)；
捕捉探针 C2 :5，_ 生物素 _ TTTTTTTTTTGGTATTCCTCCCGTGGCTTC-3，(SEQ ID NO: 11 的 5’端经生物素修饰)；
检测探针 Dl :5，-GATACCATGAGCAGTTACGGTTTTTTTTTT-0-(CH2)3-SH-3，(SEQ ID NO 8 的3’端经巯烷基修饰)；
检测探针D2:5，_ GCGTCTGGAAGAGCTGTATCTTTTTTTTTT-O-(CH2)3-SH-3，(SEQ ID NO 12 的3’端经巯烷基修饰)。2.纳米金检测探针的标记方法与实施例1中标记方法雷同。3.链亲素包被酶标板以实施例1中确定的最佳包被体系进行包被。4.目的核酸的扩增及检测以10株非洲猪瘟病毒核酸为模板进行双重PCR扩增， 模板量为 10ng，反应条件-MV X5min-(94°C X30s_50°C X30s_72°C X 30s) X 20_72°C Xl 0min-16°C，取少量PCR产物，1. 2%琼脂糖凝胶电泳，结果均可扩增出330bp大小的条带(图 4)。各取10 uL PCR扩增的产物，按照实例1中的步骤用两套捕捉探针和检测探针混合进 行靶核酸的检测(杂交体系中，杂交缓冲液40 uLUOnmol/L捕捉探针各10 uL、检测探针标 记的纳米金各5uL、10 uL PCR产物)，反应条件同实施例1，结果显示可检测出10株ASFV 核酸(图5)。将ASFV Benin97/1核酸为模板的PCR产物进行10倍梯度稀释，纳米金方法 对稀释物进行检测，结果显示可检测出0. I-Ifmol扩增的核酸产物(图6)。而以伪狂犬病 病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪2型圆环病毒(PCV-2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳病病毒 (PRRSV)基因组以及健康猪组织DNA为模板，同样PCR条件不能扩增出330bp的DNA片段 (图7)，纳米金检测PCR产物也均为阴性(图8)，这表明该方法检测ASFV核酸具有敏感性高、 特异性强的特点。
8
权利要求
一种用于非洲猪瘟病毒核酸扩增和检测的PCR引物对和特异性核酸探针，其特征在于，所述的PCR引物对和特异性核酸探针选自下列各组(a)正向引物5' CGTATCTGGACATAAGACGT 3'，反向引物5' ATGCGTCTGGAAGAGCTGT 3'；生物素标记的捕捉探针5' 生物素 TTTTTTTTTTGCGCAAGAGGGGGCTGATAG 3'；巯烷基标记的检测探针5' ATTGCGTCTACTGGGGCGTCTTTTTTTTTT O (CH2)3 SH 3'；(b)正向引物5’ ATAAGCTTTCAGGATAGAG 3’，反向引物5’ CATAATCCGTGTCCCAACT 3’，生物素标记的捕捉探针5’ 生物素 TTTTTTTTTTAGGGTATGTAAGAGCTGCAG 3’；巯烷基标记的检测探针5’ ATACCATGAGCAGTTACGGTTTTTTTTTT O (CH2)3 SH 3’；(c)正向引物5’ CACGCAGAAATAAGCTTTC 3’，反向引物5’ CGTGTCCCAACTAATATAA 3’，生物素标记的捕捉探针5’ 生物素 TTTTTTTTTTGGTATTCCTCCCGTGGCTTC 3’；巯烷基标记的检测探针5’ CGTCTGGAAGAGCTGTATCTTTTTTTTTT O (CH2)3 SH 3’。
2.权利要求1的PCR引物对和特异性核酸探针在检测非洲猪瘟病毒中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以下步骤(a)利用PCR引物扩增待测样本中核酸；(b)将烷巯基标记的检测探针标记至纳米金颗粒上；(c)将生物素标记的捕捉探针和步骤(b)纳米金标记的检测探针与变性的PCR产物杂、-父；(d)将步骤(c)的杂交体系加入包被链亲素的酶标板，捕捉杂交复合物；(e)银染增强捕捉的纳米金；(f)终止银染增强反应，肉眼观察灰度判定结果。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于(b)步骤中对烷巯基修饰的检测探针进行 纳米金标记，标记的纳米金颗粒大小30-80nm。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于(c)步骤中，将步骤(a)扩增的PCR产物 94°C变性5min后快速冷却，加入生物素标记捕捉探针和纳米金标记的检测探针，混勻。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于(d)步骤中的链亲素吸附的酶标板在制备 时，将链亲素用PH 7. 4,0. 01mol/L PBS稀释成20ug/mL，4°C过夜包被高吸附性酶标板，再 将(c )步骤中的杂交反应体系加入其中，42 °C进行杂交30min。
7.包含权利要求1所述PCR引物对和特异性核酸探针的非洲猪瘟病毒检测试剂盒。全文摘要
本发明涉及一种非洲猪瘟病毒核酸扩增引物、检测方法和试剂盒。所说的引物对和特异性核酸探针选自SEQIDNO1-12。其检测方法包括步骤(a)利用PCR引物扩增待测样本中核酸；(b)将烷巯基标记的检测探针标记至纳米金颗粒上；(c)将生物素标记的捕捉探针和步骤(b)纳米金标记的检测探针与变性的PCR产物杂交；(d)将步骤(c)的杂交体系加入包被链亲素的酶标板，捕捉杂交复合物；(e)银染增强捕捉的纳米金；(f)终止银染增强反应，肉眼观察灰度判定结果。本发明具有检测敏感性高、检测特异性强以及检测成本低的特点，可有效排除PCR方法检测非洲猪瘟病毒出现的假阳性或假阴性，快速检测出非洲猪瘟病毒核酸。
文档编号C12Q1/68GK101921878SQ20101028847
公开日2010年12月22日 申请日期2010年9月21日 优先权日2010年9月21日
发明者夏晓莉, 孙怀昌, 张鑫宇, 田瑞鹏 申请人:扬州大学