专利名称：一株提高按树抗冻能力的内生真菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株青霉菌株及其应用，更具体地涉及了 一株能提高按树抗冻能力的 内生真菌及其应用。
背景技术：
桉树同松树、杨树一起被称为世界上三大速生树种，由于其具有广泛的适应性，且 经济价值高，同时兼具有生态和社会效益，而受到不少国家的青睐。目前，桉树已经成为我 国南方发展速生丰产林的战略树种。但由于桉树的低温抗冻能力比较差，受到区域极端气 温的影响，限制了其推广范围。目前研究桉树抗寒能力主要从生理和分子两方面进行研究。 生理方面涉及蛋白质、糖、脂类等生物大分子和膜、细胞器等结构的变化，以及光合作用和 呼吸作用等生理过程[1]。分子机理方面主要从事桉树的转基因研究，在桉树转基因研究中 涉及了愈伤组织再生、体胚再生、原生质体再生等桉树再生体系的建立，转基因方法只要有 农杆菌介导法、基因枪转移法等目前转基因主要方法，转基因过程所可选择的基因主要包 含抗冻蛋白基因、冷诱导基因、脂肪酸去饱和酶基因、抗氧化酶活性基因、渗透调节相关基 因和LEA蛋白基因[2~6]。人们在健康植株中发现内在微生物起始于100多年前，这类微生物被称为内生菌 (endophyte).但由于其存在对植株并无有害症状，因此长期受到忽视。在20世纪30年代 由于畜牧业受到了感染真菌的牧草的影响而引起重大损失，植物内生菌的研究才逐步引起 重视[7]。植物内生菌几乎存在于目前研究过的任何植物中，分布广泛而且种类繁多。根据 其在植株中所发挥的作用可以分为固氮菌、固磷菌、固钾菌等植物促生菌[8~9]、具有抗病虫 害的生防菌[1°~13]和具有促进植物对不良环境的修复能力的抗性菌[14]。目前对桉树根际微生物的研究主要集中在菌根方面。桉树是一种菌根营养型的树 种，它不仅具有内生菌根(endomycorrhiza),也有外生菌根(ectomycorrhiza, ECM),还有 混合菌根[15~17]。国外对桉树的研究初步证实，混合菌根对桉树具有较好的促生作用，并且 能提高宿主的抗逆性[18~19]。但在促进桉树低温条件下抗寒方面的研究尚未见报道。
发明内容
本发明提供了 一株提高按树抗冻能力的内生真菌及其应用，促进桉树低温条件下 的抗寒能力。本发明所述内生真菌为青霉iPeniciIlhm sp.)菌株1，所述菌株1的保藏号为 CGMCC No. 4139。所述内生真菌的分离筛选过程如下 (1)野外采集桉树根、茎和叶。(2)桉树样本消毒处理的最佳方案为①叶片70%酒精40s，0. 升汞90s ；②茎 段:70%酒精30s,0. 升汞60s ；③根部:70%酒精50s,0. 升汞120s。(3)将消毒后的材料接种于改良马丁固体平板培养基。所述改良马丁固体平板培养基的配方为蛋白胨5. Og/L、酵母浸出粉2. Og/L、葡萄糖20. Og/L、磷酸氢二钾1. Og/L、硫 酸镁0. 5g/L、琼脂14. Og/L、其它为无菌水，pH值6. 4士0. 2。接种方法将消毒过的外植体用接种刀切开，将其铺放在培养基表面。3 5天后 观察菌株生长状况。若菌株繁殖迅速，将所产生的菌种根据外观进行分离纯化。若菌株繁 殖比较缓慢且数量比较少，可适当延长培养时间，7 10d后进行分离纯化。(4)将外观不同的菌株分别点接入平板培养基进行纯化，3 5天后观察菌株生长 状况，若菌株外观(菌落颜色、表面特征、质地)还显现杂合状态，再继续将不同外观的菌种 分别点接入平板进行纯化培养，经过2 3次转接，若菌种外观性状表现稳定，则菌种纯化 结束，分离筛选得到能提高按树抗冻能力的内生真菌即菌株1 ；所述平板培养基为改良马 丁固体平板培养基。所述的内生真菌的用途，将所述内生真菌接种于桉树，具体步骤如下
⑴将菌种点接入液体培养基，经过48h振荡培养，培养温度为28°C。所述液体培养基配 制为改良马丁培养基，其中蛋白胨5. 0g/L、酵母浸出粉2. 0g/L、葡萄糖20. 0g/L、磷酸氢 二钾1. 0g/L、硫酸镁0. 5g/L、其它为无菌水、pH值6. 4士0. 2。⑵将菌液滴入血球计数板，在光学显微镜下计数，得出菌液浓度。⑶将菌液用超纯水稀释成5. OX 106cfu/ml。⑷取1L稀释后的菌液浇施入植株根际。试验通过研究菌种1接种于尾巨桉幼苗，得到菌种1明显能促进桉树提高抗寒能 力。可将菌种1应用于生产。采用光学显微镜对菌种鉴定。将菌种制成载玻片，在显微镜下观察并参考《真菌鉴 定手册》和《半知菌属图解》进行初步鉴定。菌种1形态特征外观正面灰绿色，圆点状，周边白色，平均直径1 2cm，背面红 褐色，单个圆形。显微特征菌丝体有隔。分生孢子梗和孢子无色，末端生小梗，小梗直立， 刷状。单胞，卵圆形，表面光滑。分生孢子梗自菌丝单个地发生。在顶部附近分枝，形成典 型的帚状特征结构。参照真菌鉴定手册将菌株1鉴定为青霉属。本发明的青霉(/如iciWi腫sp.)菌株1，已经于2010年9月3日保藏在中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No. 4139。本发明的显著优点本发明的菌种1可大幅降低植株的半致死温度，并且从抗寒 生理和营养特征分析，都表明该菌种显著提高了植株的抗寒性。
图1为2种处理在常温下的电导率； 图2为2种处理在0°C胁迫时的电导率； 图3为2种处理在一 1°C胁迫时的电导率； 图4为2种处理在一 2°C胁迫时的电导率； 图5为2种处理在一 3°C胁迫时的电导率； 图6为2种处理在一 4°C胁迫时的电导率； 图7为2种处理在一 5°C胁迫时的电导率；
4图8为2种处理在不同温度下的可溶性糖含量； 图9为2种处理不同温度下的过氧化物酶含量； 图10为2种处理不同温度下的可溶性蛋白含量 图11为2种处理不同温度下的超氧化物歧化酶含量； 图12为2种处理不同温度下的丙二醛含量； 图13为2种处理不同温度下的脯氨酸含量。
具体实施例方式菌液的制备将菌种1接入等体积的液体培养基，所述液体培养基为改良马丁培 养基，配制为蛋白胨5. Og/L、酵母浸出粉2. Og/L、葡萄糖20. Og/L、磷酸氢二钾1. Og/L、 硫酸镁0. 5g/L、其它为无菌水、pH值6. 4士0. 2。经过24h的培养，利用血球计数板计算菌液 浓度，将菌液共同用超纯水稀释成5.0X106cfu/ml。取IL稀释后的菌液浇施入桉树根际， 用蒸馏水处理作为空白对照。接种30天后进行低温胁迫试验处理。七个温度梯度(一 5°C、—4°C、—3°C、—2°C、—rC、0°C、常温)进行试验。每个 温度处理桉树苗30株，光照时间为每日8 00 18 :00，光照强度为4000 lx，光源为白炽 灯，湿度控制80 100%。试验处理在高低温交变湿热试验箱中进行。每个温度梯度胁迫时间为10个小时，每隔2小时进行电导率测定，并在胁迫结束 后立刻进行可溶性糖、可溶性蛋白、过氧化物酶、超氧化物歧化酶、丙二醛、脯氨酸和叶绿体 含量测定。1半致死温度的测定。根据电导率进行回归分析，得到logistic方程Y =
JT
,，当Y = K/2时t值作为桉树冻害胁迫的半致死温度[2°_24]。 1 + ae表1菌种1处理下各温度电导率(％)试验结果
对2种处理的电导率进行方差分析，如表1所示，不同处理间电导率的差异达到极显著 水平，不同处理温度也达到极显著水平。与对照CK处理相比，菌种1处理的电导率下降了 31. 4%。如图1-7所示，在常温条件下，与对照CK相比，菌种1处理达到了显著。在0°C条 件下，与对照相比，菌种1处理达到了极显著。在一 l°c条件下，与对照相比，菌种1处理达 到了极显著。在一 2°c条件下，与对照相比，菌种1处理达到了极显著。在一 3°C条件下，与 对照相比，菌种1处理达到了极显著水平。在一 4°C条件下，与对照相比，菌种1处理达到了 极显著水平。在一 5°C条件下，与对照相比，菌种1处理达到了极显著水平。表明菌种1处 理的电导率与对照相比显著降低，植株的抗寒性得到了大幅提高。2可溶性糖含量分析
5不同处理和不同温度间的差异均达到了极显著水平。表明可溶性糖含量在不同处理间 和不同温度间均呈现出了明显的差别。如图8所示，与对照CK相比，菌种1处理达到了极 显著水平，菌种1处理可溶性糖含量分别增加了 41. 11%。3过氧化物酶活性分析
如图9所示，随着胁迫温度的下降，过氧化物酶的含量呈现上升的趋势。当温度达到一 2°C 一 3°C时，POD含量达到最大值。当温度达到一 2°C时，菌种1处理比对照高出23%。 当温度达到一 4°C 一 5°C时，POD含量呈现下降的趋势。植株受到低温的冻害破坏，组织 受到一定程度的破坏。与对照CK相比，菌种1处理的过氧化物酶含量增加了 35. 40%。4可溶性蛋白含量
如图10所示，随着温度的降低，可溶性蛋白质含量呈现上升的趋势。当温度下降到一 2°C 一 3°C时，对照可溶性蛋白质含量达到最大值，而菌种1的可溶性蛋白持续上升。当温 度达到一 3°C时，菌种1处理比对照高出15%。当温度达到一 4°C 一 5°C时，对照可溶性 蛋白质含量呈现下降的趋势，而菌种1可溶性蛋白含量达到最大。与对照处理CK相比，菌种1处理的可溶性蛋白含量增加了 14. 90%。5超氧化物歧化酶活性
如图11所示，随着温度的降低，超氧化物酶含量呈现上升的趋势。当温度下降到一 2°C 一 3°C时，超氧化物酶含量达到最大值。当温度达到一 3°C时，菌种1处理比对照高出 42%。当温度达到一 4°C 一 5°C时，超氧化物酶含量呈现下降的趋势。与对照处理CK相比，菌种1处理的超氧化物歧化酶含量分别增加了 36. 39%。6 丙二醛
如图12所示，当温度达到一 5°C时，菌种1处理丙二醛含量比对照低了 58%。7脯氨酸
如图13所示，菌种1处理的脯氨酸含量比对照高46%。8叶绿素含量
总叶绿素含量在当温度达到一 4°C和一 5°C时，总叶绿素出现下降，与对照形成显著差 异。与对照处理CK相比，菌种1处理的叶绿素含量分别增加了 6. 80%。小结
综合上所述菌种1接种桉树后，从生理特征指标和营养特征都可以看出，菌种1对桉树 的抗寒能力有很大的促进作用。参考文献刘建，项东云，周坚。桉树抗寒生理及分子机理研究进展[J].西南林学院学报， 2006,26 (5) 81 85fforrall D, Elias L, Ashford D, et al. A carrot leucine rich repeat protein that inhibits ice recrystallization[J]. Science, 1998, 282(2):115 — 117王艳，邱立明，谢文娟，等。昆虫抗冻蛋白基因转化烟草的抗寒性[J].作物学报， 2008,34 (3) 397 402Liorente F, Lopezcr M, Catala R, et al. A novel cold inducible gene from Arabidopsis, RCI3, encodesaper oxidase that constitutes a component fortolerance[J], Plant J, 2002, 32:13 24王多佳，苍晶，牟永潮，等。植物抗寒基因研究进展[J]。东北农业大学学报，2009， 40 (10) 134 138陈少雄，吴志华。桉树分子育种研究进展[J]。中南林业科技大学学报，2008，28 (4) 42 48Leuchtmann A. Systematics, distribution, and host specificity of grass endophytes. Nat Toxins, 1992，1 (3):150—162.Lu H, Zou W X, Meng J C, Hu J, Tan R X. New bioactive metabolites produced by Colletotrichum sp. , an endophytic fungus in Artemisia annua . Plant Sci, 2000， 151:67-73Reis V M, Baldani V L D, Dobereiner J. Biological dinitrogen fixation in Cramineae and palm trees. Critical Rev Plant Sci,2000, 19:227-247Stone J K, Bacon C E, White J F Jr. An overview of endophytic microbes: endophytism defined Microbial Endophytes, New York:Marcel Dekker,2000; 3-29.冯永君，宋未.植物内生细菌[J].自然杂志，2001，23(5)249-252.刘云霞.植物内生细菌的研究与应用[J]·植物保护，1994，20(5):30-32.杨海莲，孙晓璐，宋未.植物内生细菌的研究[J].微生物学通报， 1998，25(4) 224-227.Lodewyckx C, Vangronsfeld J, Porteous R, et al. Endo-phytic bacteria and their potential applications. Crit Rev Plant Sci, 2002, 21:5837606. Lodewyckx et al, 2002郭秀珍，毕国昌。林木菌根及应用技术，北京中国林业出版社，1989。161 163.弓应明，陈应龙，仲崇禄。菌根研究及应用。北京中国林业出版社，1997。84
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权利要求
1. 一株桉树内生真菌，其特征在于所述内生真菌为青霉sp.)菌株1， 所述菌株1的保藏号为CGMCC No. 4139。
2. 一种如权利要求1所述的内生真菌的用途，其特征在于将所述内生真菌接种于桉树。
3.根据权利要求2所述的内生真菌的用途，其特征在于所述内生真菌接种于桉树的 具体步骤为⑴将菌种点接入液体培养基，经过48h振荡培养，培养温度为28°C。所述液体培养基配 制为改良马丁培养基，其中蛋白胨5.(^/1、酵母浸出粉2.(^/1、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢 二钾1. Og/L、硫酸镁0. 5g/L、其它为无菌水、pH值6. 4士0. 2 ；⑵将菌液滴入血球计数板，在光学显微镜下计数，得出菌液浓度； ⑶将菌液用超纯水稀释成5. OX 106cfu/ml ； ⑷取1L稀释后的菌液浇施入植株根际。
全文摘要
本发明提供了一株提高按树抗冻能力的内生真菌及其应用，所述内生真菌为青霉(Penicilliumsp.)菌株1，所述菌株1的保藏号为CGMCCNo.4139。将该菌种接种于桉树，可促进桉树低温条件下的抗寒能力。本发明的菌种1可大幅降低植株的半致死温度，并且从抗寒生理和营养特征分析，都表明该菌种显著提高了植株的抗寒性。
文档编号C12N1/14GK102002463SQ20101029335
公开日2011年4月6日 申请日期2010年9月27日 优先权日2010年9月27日
发明者吴承祯, 洪伟, 谢安强 申请人:福建农林大学