专利名称：丁羟甲苯和/或α-亚麻酸作为前体在制备辅酶Q10中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于微生物发酵制备辅酶QlO的新前体——丁羟甲苯、α-亚麻酸，及 其在微生物发酵制备辅酶QlO中的应用。
背景技术：
辅酶Qltl具有很好的医学价值，已广泛用于各类心脏病、糖尿病、癌症、急慢性肝 炎、帕金森症等疾病的治疗，药行业不断增长的需求，辅酶Qltl的工业化生产将变得更加重要。辅酶Qltl可以通过化学合成法、半化学合成法和微生物转化法生产[5]。目前制约 生物发酵法工业化生产CoQltl的主要因素是微生物细胞不能高水平的生产并累积CoQltl，导 致发酵产率低、生产成本较高。近年来，不少研究者用基因工程的方法来改造微生物和使用 基因重组菌发酵生产CoQltl，但由于CoQltl合成途径复杂，构建CoQltl基因工程高产菌国内外 至今尚未取得突破性进展。因此，添加前体物质或发酵促进物，对发酵条件进行优化，仍是 提高CoQltl产量的主要手段。李英华、吕春茂等(《前体物质对烟草细胞辅酶Qltl合成的影 响》，烟草科技，2009，6 51 55)研究了前体物质对烟草细胞CoQltl合成的影响，结果表明， 单独添加适当浓度的几种前体物质均能在一定程度上促进NC89烟草细胞生长和辅酶Qltl合 成。刘萍等(《前体物质对辅酶QlO生物合成的影响》，食品与发酵工业，2005. 31 (4) :1 5)用粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces promb)研究了添加侧链供给前体茄尼醇及醌 环供给前体对羟基苯甲酸对CoQltl产量的影响。结果显示，单独添加茄尼醇能达到最大产量 33. lmg/L，比对照提高了 91% ；对羟基苯甲酸也能提高CoQltl产量。此外，L-半胱氨酸、蛋 氨酸、维生素Bl等也可以提高CoQltl产量(蒋世云，余龙江，申晓林，熊欣，简艳，《芳香族氨 基酸对沼泽红假单胞菌合成CoQlO的影响》，药物生物技术，2008，15 (5) 380 387)。
发明内容
本发明目的是提供新的用于微生物发酵制备辅酶QlO的前体物质，及其在微生物 发酵制备辅酶QlO中的应用。本发明采用的技术方案是丁羟甲苯和/或α-亚麻酸作为前体在微生物发酵制备辅酶QlO中的应用。丁 羟甲苯、α -亚麻酸为发明人筛选发现的两种新的用于辅酶QlO微生物法制备的前体物质， 可以作为唯一的前体物质添加于培养基中，也可以混合或各自与现有已知的前体(如茄尼 醇、对羟基苯甲酸等)组合用于辅酶QlO的制备。具体的，所述应用为以 辅酶QlO产生菌接种于液体培养基，添加适量前体于25 28°C下培养24 36h，所得发酵液分离取菌丝体，于菌丝体中获得所述辅酶Q1(l。所述辅酶 QlO产生菌可为本领域已知用于辅酶QlO制备的菌株，如背景技术中提到的粟酒裂殖酵母、 沼泽红假单胞菌、鞘氨醇单胞菌等。
优选的，所添加的前体为丁羟甲苯和茄尼醇的混合物，丁羟甲苯添加量为20 40mg/L、茄尼醇添加量为60 100mg/L。更有选的，丁羟甲苯添加量为30mg/L、茄尼醇添加 量为 70mg/L。优选的，所添加的前体为丁羟甲苯和α-亚麻酸的混合物，丁羟甲苯添加量为 20 40mg/L、α -亚麻酸添加量为60 100mg/L。更有选的，丁羟甲苯添加量为30mg/L、 α -亚麻酸添加量为70mg/L。
本发明中辅酶QlO产生菌优选为鞘氨醇单胞菌CCTCC No :M207084。作为优选的技术方案，所述应用方法如下以鞘氨醇单胞菌CCTCCNo =M 207084接 种于液体培养基，添加前体于25 28°C下培养24 36h，得发酵液，发酵液分离取菌丝体， 于菌丝体中获得所述辅酶QlO ；所述液体培养基按如下配方配制每IOOOmL水加入葡萄 糖 10 20g、(NH4)2SO4 5 15g、KH2PO4 0. 1 1. 0g、Na2HPO4 · 05 2. Og 和 MgSO4 0. 1 1. Og, ρΗ6· 0 8. 0。本发明的有益效果主要体现在提供了两种新的用于辅酶QlO微生物法制备的前 体物质及其应用，丁羟甲苯比对羟基苯甲酸的价格便宜，而α-亚麻酸也比茄尼醇的价格 低，用于制备辅酶QlO将大大降低成本。
图1为茄尼醇标品、粗品HPLC图谱；图2为不同纯度茄尼醇添加发酵产CoQlO效果；1 对照；2 茄尼醇粗品；3 茄尼
醇纯品；图3为茄尼醇粗品硅胶柱分离后得到的样品层析图；图4为不同组分物质添加发酵产CoQlO效果；1 对照；2 12 25管洗脱液合并浓 缩物；3 26 43管洗脱液合并浓缩物；4 色素物质；图5为CoQlO发酵最佳组分薄层层析图；图6为CoQlO发酵最佳组分中主要组分的HPLC图谱；图7为CoQlO发酵最佳组分中主要组分的质谱图；图8为不同前体对转化体系辅酶QlO产量的影响；图9为丁羟甲苯浓度对辅酶QlO产量的影响；图10为丁羟甲苯浓度对辅酶QlO转化率的影响；图11为茄尼醇浓度对辅酶QlO产量的影响；图12为茄尼醇浓度对辅酶QlO转化率的影响；
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此实施例1 1材料与方法1. 1 菌种发明人自行分离获得的产CoQltl菌株鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)ZUTE03,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No =M 207084，已在在先申请CN200710070806. 8中作为新菌种予以保护。1. 2仪器与试剂SPD-1(1AVP高效液相色谱仪，日本岛津(SHIMADZU) ；Agilent5975C气质联用仪 (GC-MS)，美国Agilent ；CoQ10标准品(> 99% ),日本和光纯药“WAK0”工业株式会社；茄 尼醇(> 99% )，山东潍坊三强集团；其余试剂均购自杭州。1. 3培养基固体斜面/平板培养基酵母膏10g/L，葡萄糖20g/L，NaCl 5g/L，蛋白胨10g/L， 琼脂20g/L，溶剂为水，pH7.0。种子培养基葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，NaCl 5g/L，溶剂为水，pH 7. 0。发酵培养基葡萄糖10g/L，(NH4)2SO4 10g/L，酵母膏 lg/L，KH2PO4O. 5g/L，Na2HPO4 1. 5g/L, MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，溶剂为水，pH 8. 0。以上均 115°C灭菌 30min。1. 4 方法1. 4. 1茄尼醇粗品的制备称取120g烟叶，浸泡在蒸馏水中，抽滤去除水溶性杂质，将处理过的烟叶在100°C 烘箱中烘2h，在组织捣碎勻浆机中破碎2min。将上述处理后的烟叶在50°C下浸于1500ml 石油醚中，搅拌萃取10h，过滤，滤液进行减压蒸馏蒸去溶剂，得茄尼醇粗品浸膏。1. 4. 2茄尼醇粗品的硅胶柱分离及组分分析装硅胶柱(4X60cm)高度约40cm，将皂化后的茄尼醇浸膏用少量石油醚充分溶 解，加到硅胶柱中，先用石油醚缓慢冲洗柱子，使茄尼醇固定在硅胶柱上，色素物质被冲洗， 待流出的石油醚无色后再用石油醚丙酮9 1 (ν/ν)洗脱，每管40ml收集洗脱液。将各管收集液进行薄层层析，硅胶板(GF254，青岛海洋化工厂)，展开剂为石油 醚乙酸乙酯4 1 (ν/ν)，用碘熏法显色。将硅胶板上相同Rf值的对应馏分收集并浓缩， 得到的不同组分的物质添加到CoQltl发酵液中，并考察其对Sphingomonas sp. ZJUTE03发酵 生产CoQltl的影响。将发酵最佳促进组分进行二次硅胶柱分离，相同Rf值的对应馏分收集 浓缩后用HPLC检测，再将主要物质进行GC-MS分析。1. 4. 3不同前体的添加对Sphingomonas sp. ZUTE03转化产辅酶Qltl的影响Sphingomonas sp. ZUTE03 菌体培养CCTCC No :M 207084 接种至斜面培养基， 28°C活化培养24h，活化后的菌种接种至种子培养基，30°C培养24h，获得种子液，离心，得 湿菌体备用。用正己烷配置100mg/L α -亚麻酸(LNA)、100mg/L 丁羟甲苯(BHT)、100mg/L茄尼 醇(Solanesol) +100mg/L 对羟基苯甲酸(PHB)、100mg/L 丁羟甲苯 +100mg/L 茄尼醇、IOOmg/ L α -亚麻酸+100mg/L丁羟甲苯、100mg/L对羟基苯甲酸+100mg/La -亚麻酸和对照组(不 加前体)，分别与等体积水相组成Sphingomonas sp. ZUTE03产CoQltl两相转化体系(25ml， 0. Imol/L.pH 4. 6醋酸缓冲液为水相，25mL正己烷为有机相)，再加入ImL豆油作为细胞通 透齐U，接入170mg DCW菌体，180rpm，37°C转化，考察添加不同前体组合的转化体系对菌株产 辅酶Qltl的影响，HPLC测定转化8h时有机相中CoQltl的浓度，确定较优的前体或前体组合。1. 4. 4 丁羟甲苯浓度对Qltl产量的影响
混合前体中设定茄尼醇浓度为100mg/L，丁羟甲苯的浓度分别为20mg/L、30mg/L、 40mg/L、50mg/L、60mg/L，转化体系同1. 4. 3，测定不同丁羟甲苯的浓度下各自的辅酶Qltl产 量 ，从而确定丁羟甲苯添加的较优浓度。1. 4. 5茄尼醇浓度对Qltl产量的影响在选定丁羟甲苯浓度的情况下，设置茄尼醇的浓度分别为60mg/L、70mg/L、80mg/ L、90mg/L、100mg/L，转化体系同1. 4. 3，测定各自的辅酶Qltl产量，确定茄尼醇添加的较优浓度。1. 4. 6CoQ1q、茄尼醇、丁羟甲苯的HPLC检测CoQ10 的 HPLC 检测条件=ZORBAX SB-C18 柱(4. 6mmX 250mm)，V (正己烷)+V (甲醇) =17+83混合液为流动相，流速1. Oml/min，紫外检测波长275nm。茄尼醇及烟叶提取物的HPLC检测条件Shim-pack HRC-SIL硅胶柱 (4. 6mmX 150mm)，V (正己烷)+V (甲醇)=98+2混合液为流动相，流速0. 5ml/min，紫外检 测波长215nm。丁羟甲苯(BHT)的 HPLC 检测条件=ZORBAX SB-C18 柱(4. 6 X 150mm, 5 μ m), 100% 色谱级乙醇为流动相，流速1. Oml/min，紫外检测波长215nm。2结果与分析2. 1茄尼醇粗品中的茄尼醇含量分析将方法1. 4. 1得到茄尼醇粗品进行HPLC检测，结果如图1，经HPLC检测茄尼醇粗 品中茄尼醇含量为14. 43%。2. 2添加茄尼醇粗品对Sphingomonas sp. ZUTE03发酵产CoQltl影响将一定量的茄尼醇粗品和标准品加入发酵培养基，使茄尼醇终浓度为100mg/L，接 种Sphingomonas sp. ZUTE03培养36h，测定CoQltl产量和细胞生物量。结果由图2可知，添 加茄尼醇粗品发酵产CoQltl的效果最好，能够达到3. 12mg/L,而添加茄尼醇纯品的CoQltl产 量只有2. 09mg/L，说明茄尼醇粗品中含有促进效果更好的物质，但是茄尼醇粗品仍然是混 合物质，所以本申请继续对茄尼醇粗品进行硅胶柱分离，考察粗品中对生物转化起作用的 具体组分。2. 3茄尼醇粗品的硅胶柱分离对茄尼醇粗品进行硅胶柱层析，用碘熏法显色，结果由图3可知，1 7号管几乎 没有物质，主要是由于在加入石油醚和丙酮混合洗脱液后，基本没有物质洗出，所以未有显 色；8 11号管开始出现明显Rf值大于茄尼醇Rf值的显色物质，同时还有少量茄尼醇被洗 出；12 20号管在Rf值等于茄尼醇Rf值的位置上出现的斑点最深，主要物质为茄尼醇； 21 25号管对应茄尼醇位置上的斑点颜色逐渐变浅，茄尼醇逐渐减少；26 43号管茄尼 醇位置上几乎无斑点出现，均为Rf值均小于茄尼醇Rf值的显色物质。合并12 20管洗 脱液，浓缩得纯度较高的茄尼醇，合并26 43管洗脱液，浓缩得到茄尼醇斑点以下的物质。2. 4不同硅胶柱分离组分的添加效果研究将由方法1. 4. 2得到的不同组分的物质分别配置成0. 75g/L的浓度，发酵12h后 添加到发酵液中，总发酵时间36h，测定细胞生长量和CoQltl含量。结果由图4可知，添加 26 43管洗脱液的浓缩物后CoQltl的发酵效果最好，CoQ10产量达11. 73mg/L,是对照组的 653%，是12 25管洗脱液浓缩物添加后CoQltl产量的572%，是色素物质(柱层析分离由石油醚最先洗脱出的物质)添加后CoQltl产量的156%，优势很明显。所以确定26-43管洗 脱液的浓缩物即薄板上茄尼醇斑点以下物质为最佳组分。2. 5CoQ10发酵最佳促进组分的分离纯化 将CoQltl发酵最佳促进组分即26 43管洗脱液的浓缩物进行二次硅胶柱分离，并 硅胶板薄层层析，碘熏法显色，结果如图5所示。将图5中Rf值相同的12 17管合并后 浓缩，进行HPLC检测，结果如图6，HPLC图谱显示12 17管浓缩物质有两类主要组分，保 留时间分别为6. 488min和9. 715min。将这两类主要组分进行GC-MS分析，经过GC-MS检 测，有效组分是多种物质的混合物，有较多的结构，但主要是两大类，一类是直链的烯烃，这 与茄尼醇的结构有一定相似性，另一类是含苯环结构的物质，这为CoQltl的合成创造了有利 的条件。图7是具有代表性的两种物质，前者是丁羟甲苯，后者为α-亚麻酸。本发明以这 两种物质为前体，研究其对Sphingomonas sp. ZUTE03转化产CoQltl的促进作用。2. 6添加不同前体对Sphingomonas sp. ZUTE03转化生产CoQltl的影响根据方法1. 4. 3，添加7种不同组合的前体进行转化生产CoQltl，结果如图8。实验 表明，添加两种前体均比添加一种前体的辅酶Qltl产量高，其中以添加丁羟甲苯+茄尼醇的 组合辅酶Qltl的产量最高，达到72. 05mg/L。其次，各组合中加入了 α-亚麻酸或者丁羟甲 苯的又明显比茄尼醇+对羟基苯甲酸产辅酶Qltl的效果好，而且后者辅酶Qltl的产量与单独 添加α-亚麻酸或者丁羟甲苯基本持平，说明新前体α-亚麻酸、丁羟甲苯要比茄尼醇、对 羟基苯甲酸的转化效果好。因此，本发明选择丁羟甲苯+茄尼醇的前体组合。2. 7 丁羟甲苯浓度对Qltl产量的影响由图9可知，在茄尼醇浓度设定为100mg/L时，丁羟甲苯浓度为30mg/L时辅酶Qiq 的产量最高，达到74. 52mg/L，丁羟甲苯浓度为40mg/L、50mg/L、60mg/L时，辅酶Qltl的产量 均未提高，说明丁羟甲苯浓度为30mg/L时前体已是过量，再提高丁羟甲苯浓度也不能提高 辅酶Qltl的产量。实验中丁羟甲苯及茄尼醇的转化率如图10，结果表明丁羟甲苯浓度为30mg/L时 丁羟甲苯及茄尼醇的转化率均达到最大，其中丁羟甲苯的转化率为92. 15%，茄尼醇的转化 率为90. 31%。所以，在茄尼醇浓度为100mg/L下，丁羟甲苯添加的较优浓度应为30mg/L， 此时辅酶Qltl的产量已达到最高，且丁羟甲苯及茄尼醇的转化率均达到最大。2. 8茄尼醇浓度对Qltl产量的影响由图11可知，在丁羟甲苯浓度一定(均为30mg/L)的情况下，茄尼醇浓度为70mg/ L时辅酶Qltl的产量最高，达75. 81mg/L ；而丁羟甲苯浓度为80mg/L、90mg/L、100mg/L时，辅 酶Qltl的产量均低于茄尼醇浓度为70mg/L时辅酶Qltl的产量，说明茄尼醇浓度为70mg/L时 前体已是过量，再提高茄尼醇浓度也不能提高辅酶Qltl的产量。实验中丁羟甲苯及茄尼醇的转化率如图12，结果表明，茄尼醇浓度为70mg/L时， 丁羟甲苯及茄尼醇的转化率均达到最大，其中丁羟甲苯的转化率为93. 19%，茄尼醇的转化 率为92. 28%。所以，在丁羟甲苯浓度为30mg/L下，茄尼醇添加的较优浓度应为70mg/L，此 时辅酶Qltl的产量已达到最高，且丁羟甲苯及茄尼醇的转化率均达到最大。综上，前体丁羟甲苯和茄尼醇的较优浓度组合应为30mg/L 丁羟甲苯、70mg/L茄尼 醇，此时丁羟甲苯和茄尼醇的转化率均达到90%以上。4 结论
研究表明，如果两种或多种能提高次生代谢物产率的条件联合作用，将对次生代 谢物产量的提高发挥协同作用。目前已发现可用于辅酶Qltl合成的前体物质有茄尼醇、对羟 基苯甲酸、L-苯丙氨酸，L-半胱氨酸等，其中以茄尼醇、对羟基苯甲酸为前体研究最多，茄 尼醇与CoQltl的侧链——异戊二烯焦磷酸在结构上有一定的相似性，而对羟基苯甲酸则作 为CoQltl合成中醌环的前体物质。本申请对烟叶来源的茄尼醇粗品进行硅胶柱分离，经促进 发酵对比实验和GC-MS分析，从中获得两种新的前体物质——丁羟甲苯和α _亚麻酸，研究 还发现在Sphingomonas sp. ZUTE03转化生产CoQltl的两相转化体系中，添加以30mg/L 丁 羟甲苯+70mg/L茄尼醇为前体组合的产量最高 ，可达75. 81mg/L，丁羟甲苯和茄尼醇的转化 率分别达93. 19%和92. 28%。以丁羟甲苯和α -亚麻酸为前体物质促进微生物转化生产 CoQ10的研究为首次报道，推测丁羟甲苯为CoQltl的合成提供苯环结构，而α _亚麻酸与茄尼 醇的结构有相似性，为CoQltl合成提供侧链，且丁羟甲苯是一种抗氧化剂，能保护辅酶Qltl不 被氧化。此外，丁羟甲苯比对羟基苯甲酸的价格便宜，而α-亚麻酸也比茄尼醇的价格低， 对新型前体的进一步研究将有利于降低生产成本。
权利要求
丁羟甲苯和/或α 亚麻酸作为前体在微生物发酵制备辅酶Q10中的应用。
2.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用为以辅酶QlO产生菌接种于液体 培养基，添加适量前体于25 28°C下培养24 36h，所得发酵液分离取菌丝体，于菌丝体 中获得所述辅酶Q1(l。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所添加的前体为丁羟甲苯和茄尼醇的混合 物，丁羟甲苯添加量为20 40mg/L、茄尼醇添加量为60 100mg/L。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于丁羟甲苯添加量为30mg/L、茄尼醇添加量为 70mg/Lo
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于所添加的前体为丁羟甲苯和α-亚麻酸的混 合物，丁羟甲苯添加量为20 40mg/L、α -亚麻酸添加量为60 100mg/L。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于丁羟甲苯添加量为30mg/L、α-亚麻酸添加 量为 70mg/L。
7.如权利要求4 6之一所述的应用，其特征在于所述辅酶QlO产生菌为鞘氨醇单胞 菌 CCTCC No :M 207084。
8.如权利要求4 6之一所述的应用，其特征在于所述应用如下以鞘氨醇单胞菌 CCTCC No =M 207084接种于液体培养基，添加前体于25 28°C下培养24 36h，得发酵液， 发酵液分离取菌丝体，于菌丝体中获得所述辅酶QlO ；所述液体培养基按如下配方配制每 IOOOmL 水加入葡萄糖 10 20g、(NH4) 2S045 15g、KH2P04 0· 1 1. Og^Na2HPO4 . 05 2. Og 和 MgSO4 0. 1 1. 0g, pH6. 0 8. 0。
全文摘要
本发明提供了丁羟甲苯和/或α-亚麻酸作为前体在微生物发酵制备辅酶Q10中的应用。以丁羟甲苯和α-亚麻酸为前体物质促进微生物转化生产CoQ10的研究为首次报道，推测丁羟甲苯为CoQ10的合成提供苯环结构，而α-亚麻酸与茄尼醇的结构有相似性，为CoQ10合成提供侧链，且丁羟甲苯是一种抗氧化剂，能保护辅酶Q10不被氧化。丁羟甲苯比对羟基苯甲酸的价格便宜，而α-亚麻酸也比茄尼醇的价格低，用于制备辅酶Q10将大大降低成本。
文档编号C12R1/01GK101955979SQ20101029342
公开日2011年1月26日 申请日期2010年9月27日 优先权日2010年9月27日
发明者吴石金, 方建军, 王伟建, 邱乐泉, 钟卫鸿, 钟莉 申请人:浙江工业大学