专利名称：检测多刺曼陀罗的引物、试剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及农业和植物检验检疫技术领域，具体涉及一种利用分子生物学检测 技术快速准确地检测多刺曼陀罗(D.ferox)的核酸组合物，采用实时荧光PCR检测技术， 该组合物适用于口岸检验检疫、农业生产和植物保护等领域当中。
背景技术：
曼陀罗属(Datura L.)，为茄科植物。世界上每年都会发生曼陀罗中毒事件， 另外，由于曼陀罗属许多种被广泛地用于药物学和园艺学，因此，该属许多种在世 界各地和我国均有大量栽培，导致该属在世界范围内广泛分布。在进口货物如大豆 中，经常有截获有毒和有害杂草曼陀罗属种子的报道，且种子鉴定易发生混淆。目 前在国内外文献中常出现的曼陀罗属的植物名称有多刺曼陀罗(D.ferox)，栎叶曼 陀罗(D.quercifolia)，曼陀罗(D.stramonium)，木本曼陀罗(D.arborea)，美丽曼陀 罗(D.candida)，湿地曼陀罗(D.ceratocaula)，异色曼陀罗(D.discolor)，无刺曼陀罗 (Djnermis)，毛曼陀罗(Djnoxia)，光曼陀罗(D.Ieichhardtii)，洋金花(D.metel)，紫花曼 陀罗(D.tatula)，柏哈地曼陀罗(D.bemhardii)，红花曼陀罗(D.sanguinea)等，其中多刺 曼陀罗的异名为D.quercifolia。
实际工作中，农产品中夹杂的曼陀罗杂草种子的外观特征往往会因运输受到磨 损与变形，同时由于环境、气候、栽培条件的影响、种子成熟度的不同等引起的个体差 异，更为形态鉴定增加了难度，而细胞生物学方法等需要的周期比较长且难以准确鉴定。
目前，细胞学研究表明曼陀罗(D.stramonium)和多刺曼陀罗(D.ferox)的随体 和二价体形状和数目最接近；生物化学的研究表明曼陀罗(D.stramonium)和多刺曼陀罗 (D.ferox)的同工酶最近似；在分子水平，利用AFLP技术发现曼陀罗(D.stramonium)和 多刺曼陀罗(D.ferox)的相似距离最近，在进化树上归为同一组。迄今为止，尚未有分子 水平的研究成果可用于鉴定多刺曼陀罗(D.ferox)。发明内容
本发明的一个目的在于克服上述现有技术中关于形态鉴定和细胞生物学方法 存在的困难，提出采用分子生物学的方法，对核糖体内转录间隔区(IntemalTranscribed Spacers, ITS)序列差异设计多刺曼陀罗(D.ferox)的检测用引物。
本发明的另一个目的在于，建立多刺曼陀罗(D.ferox)的PCR检测方法，将核酸 组合物用于口岸检验检疫、农业生产和植物保护等领域当中，以达到快速和准确的检测 鉴定。
本发明提供的检测多刺曼陀罗(D.ferox)的引物是基于多刺曼陀罗(D.ferox)与其 近似种在rDNA内转录间隔区序列上的差异设计的。18S 26S核核糖体DNA(nrDNA) 的内转录间隔区ITS分为ITSl和ITM两部分。ITS区在植物核基因组中是高度重复的。全部nrDNA重复单位包括4万个拷贝以串联重复(tandemrepeats)方式出现在一个或多个 染色体基因位点上(Hamby R K, Zimer EA.Ribosomal RNA as a phylogenetic tool in plant systematics of plants [M], Chapman and Hall, New York, NY. 1992, 50 9U。在被子植物中，ITS区既具有核苷酸序列的高度变异性又有长度上的保守性，说明这些间隔区的序列 很容易在近缘类群间排序，而且丰富的变异可在较低的分类阶元上(如属间和种间)解 决植物系统发育问题。屈良鹄和陈月琴(1999)(生物分子分类检索表——原理与方法， 中山大学学报(自然科学版)[J].1999，38(1) 1-6)通过对不同生物类群的ITS序列(自 生物学数据库)的比较得出被子植物大多数科属的ITS序列的种间差异值为1.2% 10.2%,属间差异值为9.6% ^.8%，这对系统发育研究来说都是较合适的范围。
本发明提供的一种检测多刺曼陀罗的引物，包括核酸引物DFlM和核酸引物 DF2。
核酸引物DF1M，即上游引物，其5’ 端至3’ 端序列为 TTAAGACGTGCGCGGGCT。
核酸引物DF2，即上游引物，其5’ 端至3’ 端序列为 ATGCGTGACGCCCAGGCAGA。
根据核苷酸碱基配对规则可以推知，与本发明提供的核酸引物DFlM和核酸引 物DF2核酸序列完全互补的核酸链组成的一组核酸组合物也适用于本发明当中。
提取目标样品的总DNA后，运用PCR检测技术就可完成对目标样品的扩增，再 经凝胶电泳和染色，结合分子量标记即可判断目标样品是否为多刺曼陀罗(D.ferox)。
本发明是在提取单粒种子的DNA后，在各种PCR常规试剂的配合下，利用核酸 引物对DF1M/DF2进行PCR扩增，再经分离(如凝胶电泳)和显色(如溴化乙锭染 色)后，阳性样品能得到全长357bp的核酸产物，如通过与已知分子量标记进行比对， 在凝胶上会出现357bp电泳条带；PCR扩增后的阴性样品及空白对照在相应位置处没有 电泳条带呈现，由此可以区分多刺曼陀罗(D.ferox)和其它曼陀罗属的样品。
传统的鉴定方法是利用种子形态学特征、细胞生物学特征等。外观形态鉴定作 为能便捷地辨别不同植物的外部特征对不同种植物进行分类而成为口岸检疫杂草的重要 手段之一。但是，由于进口的农产品中因脱落、干燥、储运、装卸等原因，夹杂的杂草 种子的外观特征往往会因此受到磨损与变型，同时由于环境、气候、栽培条件的影响、 种子成熟度的不同等引起的个体差异也是难免的，这样就给外表形态鉴定带来了困难。 而细胞生物学方法等不仅需要较长的周期，而且仅依据染色体的形态仍难以鉴定。
多刺曼陀罗(D.ferox)的近似品种较多，如曼陀罗(D.stramonium)，木本曼 陀罗(D.arborea)，美丽曼陀罗(D.candida)，湿地曼陀罗(D.ceratocaula)，异色曼陀罗 (D.discolor)，无刺曼陀罗(Djnermis)，毛曼陀罗(Djnoxia)，光曼陀罗(D.Ieichhardtii)， 洋金花(D.metel)，紫花曼陀罗(D.tatula)，柏哈地曼陀罗(D.bemhardii)，红花曼陀罗 (D.sanguinea)等。这些植物的籽实与多刺曼陀罗(D.ferox)极为相似，但是其危害性及检 疫地位各有不同。本发明采用核酸引物DFlM和核酸引物DF2及其互补核酸链形成的引 物对，采用PCR技术扩增后，分离得到357bp的核酸分子，实现对多刺曼陀罗(D.ferox) 的特异性区分，有利于口岸检验检疫、农业生产和植物保护等领域对目标样品的快速准 确的检测鉴定。
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使 用的附图作简单地介绍。
图1为核酸引物对DF1M/DF2对多刺曼陀罗(D.ferox)及其近似品种的DNA进 行PCR扩增后得到凝胶电泳图像；图中，M表示标准分子标记DL2000，各个条带由上 至下分别表示长度为2000bp、lOOObp、750bp、500bp、250bp和IOObp的核酸分子，数字 1-10为不同来源的多刺曼陀罗(D.ferox)扩增产物，数字11_22为多刺曼陀罗(D.ferox)近 似品种的扩增产物，数字23为空白对照。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、 完整地描述。
1.样品DNA提取
单粒种子研磨粉碎，按照以下步骤提取
1)液氮中研细后转入离心管中，加入500 800 μ L TES[100mM Tris(pH8.0)， lOmMEDTA，2% SDS]；力卩50 100 μ g蛋白激酶K混勻，置于55°C 60°C水浴60 90min,期间轻轻混勻几次；
2)调节盐浓度，加1/10体积的10%十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)，置于65°C 水浴10 20η ι ；
3)加入等体积的SEVGA(氯仿异戊醇=24 1)混勻，0°C孵育30min ；
4)离心，取上清，力卩3 6yLRNaseA，37°C水浴30η ι，去除RNA ；
6)加预冷异丙醇，_20°C放置15 30min ；
7)离心，弃异丙醇，70%乙醇洗2次。室温干燥，50 200 μ LddH2O溶解。
2.PCR 扩增
利用核酸引物DFlM 6EQ ID No 1)，核酸引物DF2 ^EQ ID No 2)对提取的样品 DNA进行PCR扩增。
PCR 反应总体积为 20 μ L，包含ddH20 11.4 μ L，PCR 缓冲液(含 Mg2+) 2 μ L， dNTP(2.5mmol/L)3.2yL, rTaq DNA 聚合酶(2.5U/mL)0.4y 1，上述核酸引物(20 μ mol/ L) 2 μ 1，模板 DNA 1 μ L (^50ng)。反应程序为95°C预变性 3min ； 94°C变性 30s，68°C退 火30s，72°C延伸lmins，30个循环，然后72°C再延伸6min，最后4°C保存。
3.凝胶电泳
取分子量标记(Marker)和扩增产物10 μ L，加入3 μ L上样缓冲液(6 X上样缓冲 液)，混勻，1.5%琼脂糖凝胶电泳。电泳，溴化乙锭(EB)染色后于凝胶成像仪中成像。
采用上述相同的检测步骤，对来自于不同地区的多刺曼陀罗(D.ferox)及其近似 品种的样品(见表1)进行检测，检测结果见表2。
扩增产物的凝胶电泳见图1，图中数字1-22与表1中的数字一一对应，对凝胶电 泳1-10的产物进行核酸测序，确定其长度为357bp。
表IPCR扩增所用材料及其来源
权利要求
1.一种检测多刺曼陀罗的引物，其特征是包括核酸引物DFlM和核酸引物DF2或与 核酸引物DFlM和核酸引物DF2完全互补的核酸链；所述的核酸引物DFlM如SEQ ID No 1所示，所述的核酸引物DF2如SEQ ID No 2所示。
2.根据权利要求1所述的检测多刺曼陀罗的引物，其特征是所述的引物对多刺曼陀罗 DNA进行PCR扩增后得到357bp的核酸产物。
3.根据权利要求1所述的检测多刺曼陀罗的引物，其特征是所述的引物用于判断目标 样品中的多刺曼陀罗。
4.一种检测多刺曼陀罗的试剂，其特征是包括权利要求1所述的引物。
全文摘要
本发明提供一种检测多刺曼陀罗(D.ferox)的引物，包括SEQ ID No 1所示的核酸引物DF1M和SEQ ID No 2所示核酸引物DF2或与核酸引物DF1M和核酸引物DF2完全互补的核酸链。通过PCR技术扩增得到357bp的核酸产物。本发明引物能在半个工作日内完成检测，不仅检测时间大大缩短，检测的灵敏度也显著提高。将本发明核酸组合物用于口岸检验检疫、农业生产和植物保护等领域当中，以达到快速和准确的检测鉴定。
文档编号C12N15/11GK102021241SQ20101029394
公开日2011年4月20日 申请日期2010年9月28日 优先权日2010年9月28日
发明者傅怡宁, 印丽萍, 方其, 易建平, 魏莎莎 申请人:中华人民共和国上海出入境检验检疫局