专利名称：一种特异识别单核细胞增生李斯特菌的核酸适配子及其筛选方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及到利用分子生物学技术中的SELEX技术 (指数富集的配体系统进化技术)制备一种与单核细胞增生李斯特菌高特异性和高亲和 力的核酸适配子，为该核酸适配子在检测单增李斯特菌中的应用提供科学依据和理论基 石出。
背景技术：
单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)是一种常见、重要的人畜共患
病原菌。它能引起人、畜的李斯特菌病，严重感染后主要表现为呼吸急促、呕吐、出血 性皮疹、化脓性结膜炎、发热、抽搐、昏迷、自然流产、脑膜炎、败血症直至死亡。它 广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李斯特菌对人类的安全具有危险，该菌在4°C环 境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。因此，如何快速、准 确检测单增李斯特菌具有重要研究意义。传统检测病原菌的方法往往是需要先分离病原微生物，然后通过微生物培养， 再用经典的方法鉴定。耗时、不灵敏是这些方法普遍存在的问题。因此发展快速、灵敏 检测病原微生物的技术十分必要。利用抗体虽然能够特异识别病原细菌，能够迅速、准 确的对待检标本作出鉴定，但该技术受特异性抗体制备难度的制约。因为按照伯杰分类 标准，生物学形状基本相同的细菌群体构成一个菌种，性状相近关系密切的若干菌种组 成一个菌属。从本质上讲，同一菌属所含的表面抗原绝大多数是相同的，只有细微的差 别，找到这些差别并制备相应特异性抗体显然是一项耗时而艰巨的任务。近些年来，寡核苷酸适配子作为抗体分子的前景性替代分子，其研究较为引人 注目。寡核苷酸适配子是通过SELEX过程筛选的与靶物质特异性结合的一簇小分子DNA 或 RNA 片段。SELEX 技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,系 统进化指数富集技术)是20世纪90年代初研制的一种新的组合化学技术，是一种研究核 酸结构和功能的有效方法。其基本原理是体外化学合成一个随机单链寡核苷酸库，用它 与靶物质混合，形成靶物质-核酸复合物，洗去未与靶物质结合的核酸分子，分离与靶 物质结合的核酸分子，以此核酸分子为模板进行PCR扩增，再进行下轮的筛选过程。通 过数轮重复筛选与扩增，最后得到高亲和力和高特异性的寡核苷酸适配子，即aptamer。 利用SELEX技术筛选获得的aptamer识别分子的模式与蛋白抗体类似，但与蛋白类抗 体相比，适配子具有更明显的优越性，如不依赖动物细胞，不受免疫条件和免疫原性限 制，适配子的筛选完全在体外进行，具有时间、质量和数量上的选择弹性，可以在合成 时粘确、定点、随意连接其他功能基团和分子；适配子变性与复性可逆且速度快，可反 复使用、长期保存和室温运输；靶分子范围更广，除蛋白质、核苷酸大分子外，还有小 分子(如染料、可卡因、咖啡因和茶碱等)、生长因子、肽链、类固醇、糖类、辅因子 (如FMN等)，甚至可用于完整的细胞、病毒、孢子等；与靶分子结合具有更强的特异性和亲和力，不受组织或样品中非靶蛋白的干扰，可以在靶目标性质未知的情况下筛选 出其相应的适配子；适配子通过占据靶物质表位，使疾病得到控制，作为临床药物的治 疗，已显现了潜在的时的血管内皮生长因子、血栓生成因子、一些毒素蛋白等的作用， 以达到治疗目的。在微生物检测方面，特别是对一些致病性细菌或病毒的研究，虽然不 知道其内部结构、功能及这些物质的表位，但将其作为靶物质，通过SELEX过程筛选到 与其对应的适配子，检测靶物质，已成为该领域的研究探索热点。本发明以食品中和临床上常见的单核细胞增生李斯特菌为靶标，利用SELEX技 术获得了与单核细胞增生李斯特菌特异性结合的核酸适配子序列，该序列可以快速、准 确检测单增李斯特菌，由于单链DNA寡核苷酸适配子性能稳定、合成方便且廉价、经修 饰后可直接用于荧光或化学发光、发色方法检测靶细菌，因此操作简单、直接。该发明 可以在食品安全检测、临床医学等领域得到广泛应用。
发明内容
本发明目的在于提供一种微生物分子生物学检测方法，特别涉及一种利用适配 子技术快速、准确检测单核细胞增生李斯特菌的方法。本发明方法利用指数级富集配体的系统进化技术(SELEX技术)，以单核细胞增 生李斯特菌完整的菌细胞为靶标，筛选获得与靶细胞高亲和性特异结合的适配子，通过 羧基荧光素(FAM)标记方法将获得的适配子转为报告适配子，用于从临床血、食品培养 上清中检测到相应的靶细菌，达到快速、准确诊断的目的。本发明的优点(1)与蛋白类的抗体相比，单链寡核苷酸更为稳定；aptamer可直接体外合成、 标记，不需要标记的二抗，使得操作更为简单、迅速；aptamer的合成成本较抗体制备成 本低，周期短。(2)该序列是从结构显著、与靶细菌具有不同亲和力的8条适配子序列中选取出 的亲和力和特异性均最强的适配子序列，能够特异识别单核细胞增生李斯特菌。
图1是合成的SSDNA文库2%琼脂糖凝胶电泳图谱图2是部分SELEX筛选的PCR产物2 %琼脂糖凝胶电泳图谱图3是单增李斯特菌适配子F1-F8 二级结构图谱图4是单增李斯特菌适配子F1-F8亲和力饱和结合曲线表1是F2适配子与九种对照细菌的结合率
具体实施例方式下面是通过SELEX技术筛选特异结合单核细胞增生李斯特菌的核酸适配子制备 方法及其快速检出单核细胞增生李斯特菌方面的应用。1、合成随机单链DNA文库和引物(IDT公司合成)随机单链DNA (ssDNA)文库5 ‘ -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA (N35) TTCGACATGAGGCCCGGATC-3 ‘,构建了 长度为 78nt 的随机 ssDNA 文库，两端为固定引物序列，中间为35个碱基的随机序列，库容量为IO14以上；引物I: 5' -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-3‘；引物II 5' —GATCCGGGCCTCATGTCG AA-3 ‘，将随机ssDNA文库和两种引物均用TE缓冲液配制成100 μ mol/L贮存液_20°C 贮存备用。2、双链 DNA (dsDNA)及单链 DNA (ssDNA)文库的 PCR 扩增每轮筛选前先将ssDNA文库扩增为dsDNA文库，并以dsDNA文库为模板扩增出 下一轮筛选的ssDNA文库，为了稳定条件，不改变反应体系和反应程序。PCR反应体系 为随机ssDNA模板2yL，引物I和引物II各2yL(20y mol/L)，含Mg2+dNTP混合物 2yL(25mmol/L), IOXPCR 缓冲液 5 μ L，Taq 聚合酶 0.5 μ L，力口超纯水至 50 μ L ； PCR 反应程序为97°C预变性5min，然后进行循环，96°C变性40s，59°C退火40s，72°C延伸 40s,循环30次，最后72°C延伸9min，12°C冷却5min，PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳 检测，置4°C环境储存备用。3、筛选所用靶标细菌的获取与处理LB液体培养基培养单核细胞增生李斯特菌，37°C摇床培养至对数生长期(OD_ 约为0.3)，停止培养，收集OD6c 为0.3左右的菌液ImL，4°C, 8000rpm离心lOmin，弃 上清，用结合缓冲液(IXBB)冲洗两次，洗去多余的培养基成分，置4°C环境储存备用。4、SELEX技术筛选获得特异识别单增李斯特菌的核酸适配子第一轮筛选时，反应体系为600 μ L，取2nmol扩增后的随机dsDNA文库加入 适量的IXBB于95°C变性5min，立即冰浴lOmin。将其加入处理好的菌细胞(IXlO8 个)离心管中，再加入5倍于随机ssDNA文库摩尔数的5% BSA溶液和酵母tRNA，以 降低结合背景，于37°C振荡孵化lh。孵化后需更换离心管，以去除与离心管壁结合的 ssDNA，将新离心管于4°C，6000rpm离心lOmin，弃上清，去除未结合或结合不紧密的 随机ssDNA文库，随后用含0.05% BSA的IXBB通过重悬浮和离心冲洗2次，最后加 入 100 μ L IXPCR 缓冲液，于 95°C变性 5min，0°C立即冷却 lOmin，经 4°C，8000rpm 离 心lOmin，吸取上清至另一洁净的离心管中，即为第一轮筛选所得的适配子。以此为模 板PCR扩增为dsDNA文库，用于第二轮筛选。第二轮至第八轮反应体系为350 μ L，其 中随机ssDNA文库为lOOpmol，每轮筛选需用新鲜菌液，重复筛选8次获得单核细胞增生 李斯特菌的适配体库。将每轮筛选PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。上述筛选结合缓冲液(IXBB)为50mMTris-HCl(pH 7.4)，5mM KCl, IOOmM NaCl, ImMMgCl2 ；冲洗缓冲液为含0.05%的1 XBB ；洗脱缓冲液为1 XPCR缓冲液。5、克隆和测序将第八轮富集的ssDNA文库，PCR扩增为双链，送上海博尚生物技术有限公司 进行DNA序列测定，获得20条适配子序列。6、适配子序列结构分析采用DNAMAN软件和RNA Structure 4.2软件分别对适配子序列进行一级结构和
二级结构分析，获得20条序列的同源性信息和二级结构图谱。结合一级结构同源性和二 级结构将序列分为8个家族，从每个家族中选出1条结构稳定，能级较低的序列为代表进 行下一步鉴定，共8条，如图3所示，每条适配子中的茎环结构和发卡结构可能是适配子 与靶细菌结合的基础
7、适配子与单核细胞增生李斯特菌亲和力和特异性测定7.1适配子亲和力分析将上述8条适配子序列5'端标记FAM，由上海生工生物工程技术服务有限公司 合成，用于亲和力测定。FAM-Fl5 ‘ -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAAGGGGGGCCTAGACTAGGGGGAGAG GGTGGGACGGTTTCGACATGAGGCCCGGATC-3'FAM-F25 ‘ -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAATACTATCGCGGAGACAGCGCGGGAG GCACCGGGGATTCGACATGAGGCCCGGATC-3'FAM-F35 ‘ -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAAGGGGCGGCGGCGGTGGTACGGGGT TGGGAGCGGGCT TCGACATGAGGCCCGGATC-3 ‘FAM-F45 ‘ -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAAGGCGTATGCGCAGCGAGGGCGGCC GGGCGACGTCGTTCGACATGAGGCCCGGATC-3'FAM-F55 ‘ -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAACCACGGGAACAACATCGTGGCAGG GACGAGCGTCCTTTCGACATGAGGCCCGGATC-3'FAM-F65 ‘ -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAAGCGCGCTGCCGACGCGGGGGGGCT GATTAGCGTGGTTCGACATGAGGCCCGGATC-3'FAM-F75 ‘ -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAAACTGAGGGGCGGCGGACGGGATGG GAAATGTAGGTTCGACATGAGGCCCGGATC-3 ‘FAM-F85 ‘ -GGGAGCTCAGAAFAAACGCTCAATAGCGTGGGTAACCGTGTTGGGGGG TGCCACGGTCTTCGACATGAGGCCCGGATC-3'将八条适配子分别用IXBB稀释为不同的浓度梯度(10，20，50，100，150， 200，250，300nmol/L),与1 X IO8个单核细胞增生李斯特菌在37°C温育结合lh，4°C, 6000rpm,离心lOmin，弃上清，用IXBB冲洗两次，加入IOOyL 1XBB，避光混勻，用 FL-7000荧光分光光度计测定荧光值(测三次取平均值)，利用Sigma Plotl 1.0软件计算 各适配子的解离常数Kd值，并绘制其饱和结合曲线，如图4所示。7.2特异性分析与单核细胞增生李斯特菌细胞亲和力最强即Kd值最小的适配子序列为F2序 列，Kd值为58.85nmol/L，将IOpmol F2适配子(100nmol/L，1 XBB)分别与金黄色葡 萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌、副溶血性弧菌、枯草芽孢杆菌、链球 菌、绿脓杆菌、嗜酸乳杆菌于37°C温肓结合lh，4°C, 6000rpm,离心lOmin，弃上清， 用IXBB冲洗两次，将菌细胞重溶于100 μ L 1XBB，用FL-7000荧光分光光度计测定荧光值(测三次取平均值)。结果显示F2适配子与九种对照菌的结合率不超过5%，如表 1所示，表明F2适配子与单核细胞增生李斯特菌的特异性良好，因此，利用SELEX技术 筛选的单核细胞增生李斯特菌高亲和性特异核酸适配子检测单核细胞增生李斯特菌，具 有广泛的应用前景。表1F2适配子与九种对照细菌的结合率(％ )
权利要求
1.一种特异识别单核细胞增生李斯特菌的核酸适配子及其筛选方法与应用，其特征 在于所述寡核苷酸适配子的核苷酸序列如序列表中序列1-8所示。
2.根据权利要求1所述的靶向单核细胞增生李斯特菌的寡核苷酸适配子的制备方法， 按照下列步骤步骤进行(1)随机单链DNA(ssDNA)文库的构建和引物随机单链DNA(ssDNA)文库5 ‘ -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA (N35) TTCGACATGAGGCCCGGATC-3 ‘；弓丨物 I 5' -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-3‘；引物 II: 5' -GATCCGGGCCTCATGTCGAA-3'；(2)PCR制备随机ssDNA文库；(3)SELEX筛选单核细胞增生李斯特菌的核酸适配子；(4)DNA克隆和测序；(5)适配子序列一级结构和二级结构分析；(6)适配子亲和力和特异性鉴定。
3.根据权利要求1所述的靶向单核细胞增生李斯特菌的寡核苷酸适配子在检测单核细 胞增生李斯特菌方面的应用，其特征在于所述寡核苷酸适配子是体外化学合成的，或是 通过PCR或其他分子生物学方法制备的。
4.根据权利要求1中所述的应用，其特征在于所述寡核苷酸适配子的5'端或3'端 可以经过FITC (FAM)、生物素、地高辛等标记。
全文摘要
本发明公开了一种单核细胞增生李斯特菌的核酸适配子及其筛选方法与应用。通过SELEX技术获得了能够特异识别单核细胞增生李斯特菌的单链DNA寡核苷酸适配子，该适配子可以通过荧光素标记等转为报告适配子用于检测单核细胞增生李斯特菌，该适配子序列在准确、快速检出食品中的单核细胞增生李斯特菌方面具有广泛应用前景。
文档编号C12Q1/04GK102010865SQ20101029576
公开日2011年4月13日 申请日期2010年9月29日 优先权日2010年9月29日
发明者丁晓莹, 王周平 申请人:江南大学