专利名称：一株短小芽孢杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一株短小芽孢杆菌以及使用该菌株将酒 精转化为有机酸的方法。
背景技术：
有机酸是成品醋中的重要成分，其组成非常丰富，它不仅决定了食醋的酸味质量， 还是决定成品醋缓冲性和PH的重要物质之一，同时它还影响产品的货架期和生物安全性。 尽管食醋中酸含量很高，但并无刺激感，酸味很柔和，这其中有机酸的作用是非常重要的。目前发现用于食醋酿造过程的微生物主要有乳酸菌(Lactic acid bacteria), 乳杆菌(Lactobacillus)、醋酸菌(Acetic acid bacteria)、酵母菌(Saccharomycete)、曲 霉菌(Aspergillus)。但未见报道采用本发明所述短小芽孢杆菌用于食醋的酿造。本发明 从镇江香醋醋醅中分离出一株产酸的短小芽孢杆菌，液态发酵显示该株芽孢杆菌可以产生 多种有机酸，并且对醋的风味具有一定作用。
发明内容
本发明提供了一株短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，该菌株筛选自镇江香醋醋 醅中，于2010年5月11日保藏于中国普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC 3824。获取所述菌株16S rDNA序列，在GenBank中进行BLAST比对确定其种属，该菌株 16SrDNA全长序列为1495bp，与其具有最高同源性的菌株为Bacillus pumilus (GenBank登 录号 EU373381)，相似性为 99% ；16S rDNA 序列见 SEQ ID NO :1。所述菌株可利用乙醇发酵生产乙酸、琥珀酸、苹果酸和乳酸组成的有机酸。所述发酵生产有机酸的工艺为种子培养基葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L，pH7.0，115°C 下灭菌20min ；液态发酵培养基葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5-lOg/L，氯化钠5-lOg/L， pH7. 0，115°C下灭菌20min ；待培养基冷却至室温，加入6% (w/w)无水乙醇；种子培养方法250mL三角瓶装液量25mL，摇床转速120rpm，37°C培养；发酵培养方法以5-10%的接种量将种子接入发酵培养基，250mL三角瓶装液量 25mL，摇床转速120rpm，37°C培养。本发明还提供了一种所述菌株的应用，采用上述发酵生产有机酸的工艺，该菌株 发酵生产的乙酸、琥珀酸、苹果酸和乳酸组成的有机酸可应用于食品领域。本发明还提供了一种所述菌株的应用，在酿醋过程中加入所述短小芽孢杆菌，可 提高原料的利用率以及改善醋的风味。本发明从醋醅中筛选得到一株具有较好有机酸生产能力的菌株，经鉴定为短小 芽孢杆菌。该菌株可产生乙酸、琥珀酸、苹果酸和乳酸组成的有机酸，其有机酸总量达到 6. 25g/L，在酿醋过程中添加该菌株，可提高原料的利用率以及改善食醋的风味。
具体实施例方式实施例1 产酸芽孢杆菌的筛选从镇江香醋醋醅中取10g样品装入混有玻璃珠和90mL无菌水的500mL三角瓶中， 在37°C摇床上以115r/m振荡30min，然后取菌悬液lmL用无菌生理盐水10倍梯度稀释，以 10_3和10_4梯度稀释样涂布GYC平板，37°C培养48 72h ；根据其在GYC平板上有无透明 圈来判断是否是产酸菌，然后挑取透明圈明显、菌落丰厚的菌落经分离纯化后接入斜面培 养基，37 °C培养48h，4°C保藏。分离培养基(GYC)酵母粉1%，葡萄糖1%，碳酸钙0.5%，琼脂2%，115°C灭菌 20min后冷却至50°C加入无水乙醇6% (v/v)。斜面培养基(肉汤)酵母粉0. 5%，蛋白胨1%，牛肉膏1%，NaCl 0.3%，琼脂 2%, pH7. 0-7. 2，115°C灭菌 20min。根据分离培养基中透明圈大小挑取菌株，并且在添加乙醇的液体培养基上验证有 机酸产量，并结合其在平板上的菌落形态，得到4株高产有机酸的细菌，于4°C置于斜面培 养基中保藏以备进一步分析。实施例2 产酸菌的分子鉴定纯化筛选得到的细菌，取指数生长期新鲜菌液，离心收集菌体，采用基因组抽提试 剂盒提取基因组DNA。采用细菌通用引物Pfh扩增其16S rDNA全长序列，具体如下P0 5' -GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3’Pfi :5，-CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA—3，
①反应体系(50u 1) 10 X buffer (Mg2+) dNTPs(2. 5mM) P0(12. 5uM)
P6(12. 5uM)
ExTaq DNA 聚合酶(OT/ul)
Template DNA
ddH20
②反应程序 预变性
5. Oul 4. Oul
2. Oul 2. Oul
1. Oul 2. OuL 34ul
95 °C
变性 退火 延伸
95 °C 56°C 72V
45 S 45 S 90S
终延伸
72 °C
4min
(30个循环)
8min
PCR产物用1. 0%琼脂糖凝胶电泳分离检验，电压约llV/cm，电泳时间20分钟。 PCR扩增产物的纯化按上海生工生物技术公司的小量胶回收PCR产物纯化试剂盒 说明进行，测序由上海生工生物技术公司完成。 获得其中一株细菌16S rDNA序列，在GenBank中进行BLAST比对确定其种
4属，该菌株16S rDNA全长序列为1495bp，与其具有最高同源性的菌株为Bacillus pumilus(GenBank 登录号 EU373381)，相似性为 99% ；16S rDNA 序列见 SEQ ID N0:1。该菌株于2010年5月11日保藏于中国普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为 CGMCC3824。实施例3 :HPLC测定有机酸组成将CGMCC 3824接种于发酵培养基中，37°C液态发酵144h，通过HPLC测定其发酵液 中的有机酸组成。种子及液态发酵培养基葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L， pH7. 0，115°C下灭菌20min ；待培养基冷却至室温，加入6% (w/w)无水乙醇。采用高效液相色谱法测定镇江香醋中有机酸的含量。具体方法如下①有机酸提取准确吸取5ml发酵液，12000rpm离心lOmin，取上清，分别加入亚铁氰化钾(106g/ L)和30%硫酸锌溶液去蛋白，滤纸过滤。滤液用0. 22iim膜过滤，再用S印-Pak C18过滤处 理后进HPLC。与此同时，以草酸、酒石酸、丙酮酸、苹果酸、a-酮戊二酸、乳酸、乙酸、柠檬 酸、富马酸和琥珀酸为标准品，其浓度如表1所示。表 权利要求
一株短小芽孢杆菌，利用乙醇发酵生成有机酸。
2.如权利要求1所述短小芽孢杆菌，其特征在于，所述有机酸为乙酸、琥珀酸、苹果酸 和乳酸组成的混合酸。
3.如权利要求2所述短小芽孢杆菌，其特征在于，保藏编号为CGMCC3824。
4.如权利要求3所述短小芽孢杆菌，其特征在于，其16SrDNA序列具有SEQ ID NO=I 所示的序列。
5.如权利要求4所述短小芽孢杆菌，其特征在于，该菌株培养基为葡萄糖20g/L，蛋白 胨 10g/L，酵母粉 5g/L，氯化钠 5g/L，ρΗ7· 0。
6.如权利要求4所述短小芽孢杆菌，其特征在于，所述生成有机酸的方法为培养基灭 菌后，加入乙醇，接入所述菌株，通气条件下，37°C培养。
7.如权利要求6所述短小芽孢杆菌，其特征在于，所述方法中乙醇浓度为6%(w/w) 0
8.如权利要求6所述短小芽孢杆菌，其特征在于，所述方法中菌株接种量为5%-10% (w/w) O
9.一种权利要求1所述短小芽孢杆菌的应用，其特征在于，发酵生产乙酸、琥珀酸、苹 果酸和乳酸组成的有机酸。
10.一种权利要求1所述短小芽孢杆菌的应用，其特征在于，在酿醋过程中加入所述短 小芽孢杆菌，提高原料的利用率以及改善食醋的风味。
全文摘要
本发明公开了一株短小芽孢杆菌以及该菌株的应用，属于发酵工程技术领域。该菌株于2010年5月11日保藏于中国普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.3824。经发酵培养，该菌株可产生乙酸、琥珀酸、苹果酸和乳酸组成的有机酸，其有机酸总量达到6.25g/L，在酿醋过程中添加该菌株，可提高原料的利用率以及改善食醋的风味。
文档编号C12J1/00GK101974457SQ20101029711
公开日2011年2月16日 申请日期2010年9月30日 优先权日2010年9月30日
发明者史劲松, 李国权, 王明法, 窦文芳, 许伟, 许正宏, 陆震鸣 申请人:江南大学