专利名称：纳米金颗粒检测单核苷酸多态性的方法
技术领域：
本发明涉及的是一种纳米技术领域的检测方法，特别是一种利用非对称二维DNA折纸芯片上所构建5nm粒径的纳米金颗粒检测单核苷酸多态性的方法。
背景技术：
纳米金(nanogold)是指金的微小颗粒，其直径为1 lOOnm，一般为分散在水中形 成的胶体溶液，故又称胶体金。在纳米金颗粒表面吸附着某种化学物质，单体纳米金颗粒是 非常稳定的。金纳米粒子电子密度高，具有量子尺寸效应，小体积效应和表面效应，可以通 过静电引力、疏水效应等多种作用形式与大分子结合形成稳定的胶体金探针。在过去40多 年来，纳米金颗粒已经被广泛应用于免疫细胞化学以及生物标记等生物技术中。现有技术的形成是2006年加州理工大学的Rothemimd提出、设计、并实现了 DNA 折纸术[Rothemund Pff. Nature 2006,440,297], Rothemund 在最初的文章中折出了 六种图形，虽然各具特色，但不难发现它们全部是对称图形；引入分支迁移反应(branch migration)，或称toehold原理，最早是用在构造纳米器件上的，其实就是一个DNA链间的 竞争机制虽然一开始局部可能不按设计配对结合，但经过缓慢降温的热动力学过程，那 些整条链都能互补的寡核苷酸链将取代其他部分互补的情况，最终达到完全匹配[Yurke B, Turberfield AJ, Mills Jr AP, etal. Nature 2000，406，605]。另外，前人实验结果所 得，toehold长度不同，分支迁移反应的时间就不同(两者成指数关系)[Yurke B, Mills A. Genetic Programming and Evolvable Machines 2003,4,111]。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水 平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱 基的变异，这种变异可由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，也 可由碱基的插入或缺失所致，目前，检测单核苷酸多态性的方法包括等位基因特异性杂交 法，内切酶酶切技术，引物延伸法，寡核苷酸连接反应等。公开文献记载了张钊等在先进材料上发表名为空间可寻址免索引的液相非对称 DNA折纸芯片文章中公开了 DNA折纸芯片订书钉链序列表[Zhao Ζ, Ying W，et al. Adv Mater2010, 22，1 ]，该文利用仿中国地图形状的非对称二维DNA折纸术为模板，在模板上 设计和引出特定的寡核苷酸序列作为连接位点，通过和修饰了互补序列DNA短链的生物 素-亲和素系统杂交结合，把纳米粒子结合到折纸芯片上，同时，还对纳米粒子的结合位置 进行了比较。在对现有技术文献的进一步检索中没有发现“利用在仿中国地图形状的纳米折 纸术结构上连接5nm粒径胶体金作为标记，应用toehold原理”的技术来检测单核苷酸多态 性相关文献的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种纳米金颗粒检测单核苷酸多态性的方法。本发明采用现有技术相同的DNA折纸芯片订书钉链序列表，方向是从左到右 为5’ _3’，但是，本发明中模板上设计结合位点的位置和伸出特定的寡核苷酸序列在制备 DNA折纸芯片时，需将带伸出寡核苷酸捕获探针的订书钉链替换列表中相同序列号的订书 钉链即可。本发明利用DNA折纸芯片上所构建的纳米金颗粒，利用toehold长度不同，分支 迁移反应的时间就不同(两者成指数关系)，从而检测单核苷酸多态性。本发明是通过以下技术方案实现的
本发明包括如下步骤第一步，利用DNA折纸术构造一个非对称二维图形，制备DNA折纸芯片；所述的非对称二维图形是依靠M13mpl8噬菌体的单链DNA，长达7249个碱基脚手 架长链光栅填充式的反复折叠形成的，而图形则来自用于绑定的229条短订书钉链。所述的DNA折纸芯片的制备方法(1)把所有要用的ΙΟΟμΜ订书钉链，包括形成非对称二维图形的、伸出探针的等 体积混合，再稀释20倍备用；(2)在96孔板上混合总量为30 μ 1的溶液0. 025 μ M订书钉链22 μ 1 ；1/2浓度 的 M13mpl8 1 μ 1 ； 1 X TAE-Mg2+buffer :7μ 1。第二步，制备胶体金探针；所述的胶体金探针制备方法①寡核苷酸与5nm粒径胶体金摩尔浓度比200比1加入IOmM磷酸缓冲液中，室温 300rpm摇24小时。②加入终浓度0. IM NaCl，室温300rpm摇48小时。③4°C，15000rpm离心10分钟，弃上清。④加入IOmM磷酸缓冲液，终浓度0. IM NaCl清洗两次。⑤加入Ix TE ；IOmM Tris-HCl, ImM EDTA, pH = 8. 0，4°C保存。⑥5nm粒径胶体金探针浓度利用520nm波长紫外吸收峰测定。第三步，DNA短链与胶体金探针杂交；所述的杂交是指5nm粒径胶体金探针与IOnt DNA短链摩尔浓度比1比1混合， 50°C水浴杂交1小时。第四步，粒径胶体金探针与非对称二维图形DNA折纸芯片连接；所述的连接是指5nm粒径胶体金探针与非对称二维图形DNA折纸芯片摩尔浓度 比2比1混合，37°C水浴杂交1小时。第五步，单核苷酸多态性检测。第五步中所述的单核苷酸多态性检测的步骤在原子力显微镜成像前，加入报告 探针摩尔浓度2倍量的靶核苷酸链，取若干时间点原子力显微镜成像。用所述的原子力显微镜时间梯度成像，原本都是有亮点的，在某一时间后，完全互 补的已没有亮点，根据分支迁移反应机制，加入两种toehold长短不同靶核苷酸链，单碱基 突变的仍有明显亮点。本发明是在折纸图形特定位置附近伸出三条订书钉链末端修饰寡核苷酸的捕获 探针(capture probe)，让它们与同一个末端修饰5nm粒径金胶颗粒的报告探针(importer probe)三对一杂交，杂交位点在原子力显微镜下呈现明显亮点，从而作为标记。
本发明根据分支迁移反应机制，加入两种toehold长短不同靶核苷酸链(target strands)，用原子力显微镜时间梯度成像，原本都是有亮点的，在某一时间后，完全互补的 已没有亮点，单碱基突变的仍有明显亮点。原子力显微镜成像结果显示，本发明检测单核苷 酸多态性效率能达到95%以上。本发明与传统检测单核苷酸多态性的方法相比，具有无需严格的实验条件和复杂的酶反应，同时既简单，成本又低等优点。
具体实施例方式本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例检测条件本实施例利用DNA折纸术构造的中国地图的形状，依靠脚手架长链(M13mpl8噬菌 体的单链DNA，长达7249个碱基)光栅填充式的反复折叠形成的，而地案则来自用于 绑定的229条短订书钉链，此图形的特点是229条订书钉链就是两百多个可寻址的潜在反 应位点，模版上的任何一点都可以利用图形自身作为参照精确定位，无需索引标记，另外， 229条短DNA单链中的任意一条都可以伸出核苷酸序列作为捕获探针与带纳米颗粒标记的 互补核苷酸序列进行杂交，作为折纸图形上纳米颗粒的标记点，在原子力显微镜下(Atomic Force Microscope, AFM)呈现突出亮点，以便观测。本实施例以中国地图为芯片基底，所有订书钉链，包括形成地图的、伸出探针的， 全部从上海捷瑞公司订购(PAGE纯化)，且统一用二次水稀释到100 μ M备用。脚手架链使 用NEB公司的M13mpl8病毒单链，货号N4040S。共7249base，浓度为0. 25 μ g/μ 1，总5 μ g。 由于Iyg 0.42pmol，故浓度约0. 1ρΜ/μ 1 = 0. ΙμΜ。实际稀释到1/2浓度使用。不用 酶切处理，保持环链状态。5nm粒径胶体金使用Sigma公司，货号G1402。使用相同的反应 buffer 和成像 buffer 在 1 X TAE (Tris，40mM ；乙酸，20mM ;EDTA，2mM)中加入乙酸镁粉末， Mg2+终浓度为12. 5mM, pH8. 0。使用美国Veeco/Digital Instruments公司的多模式原子 力显微镜(Multimode AFM)观测。J-scanner，NP-S针尖，共振频率在7_10kHz之间。本实施例实施检测步骤如下第一制备仿中国地图形状DNA折纸芯片1.把所有要用的订书钉链(100μΜ)包括形成地图的、伸出探针的等体积混合，再 稀释20倍备用。2.在96孔板上按照以下体系混合溶液(以下是最“节省”的体系，实际做时可以 整体翻倍，或单独把脚手架链翻倍)订书钉链(0.025 μ Μ) 22 μ 1 ；M13mpl8 (1/2 浓度)1 μ 1 ；1X TAE-Mg2+buffer 7 μ 1 ；Total30 μ 1 ；3.放在 PCR 仪(ABI 9700)上退火，95°C 降温至 20°C，0. 1°C /IOs = 0. 6°C /min =rc /ioos。 第二 制备5nm粒径胶体金探针1.寡核苷酸与5nm粒径胶体金摩尔浓度比200比1加入IOmM磷酸缓冲液中，室温 300rpm摇24小时。2.加入终浓度0. IM NaCl，室温300rpm摇48小时。3. 4°C，15000rpm 离心 10 分钟，弃上清。4.加入IOmM磷酸缓冲液，终浓度0. IM NaCl清洗两次。5.加入 Ix TEdOmM Tris-HCl, ImM EDTA, pH = 8. 0)，4°C保存。6. 5nm粒径胶体金探针浓度利用520nm波长紫外吸收峰测定。第三IOnt DNA短链与5nm粒径胶体金探针杂交5nm粒径胶体金探针与IOnt DNA短链摩尔浓度比1比1混合，50°C水浴杂交1小 时。第四5nm粒径胶体金探针与仿中国地图形状DNA折纸芯片连接5nm粒径胶体金探针与仿中国地图形状DNA折纸芯片摩尔浓度比2比1混合，37°C 水浴杂交1小时。第五单核苷酸多态性检测在原子力显微镜成像前，加入报告探针摩尔浓度2倍量的靶核苷酸链，取几个时 间点(加前、加后15分钟、加后1小时，加后3小时等)原子力显微镜成像。DNA折纸芯片订书钉链伸出寡核苷酸探针如下(直体部分是订书钉链，斜体部分 是伸出寡核苷酸探针，横线部分是toehold，加框部分是SNP检测位点，从左到右为5’ -3’， 制备DNA折纸芯片时，替换相同序列号订书钉链)44 CGCCTAGnGGACMCGACACCTCCA^ATACk GTTAATGCGTCATACATGGCTTTTAAAGCCA45 CGCCTAGnGGACMCGACACCTCCA^ATA(L TCTGAATTTACCGTTCCAGTAAG60 CGCCTAGnGGACAACGACACCTCCA^ATA(R AATGGAAAGAGCCGCCGCCAGCAGATTTGTA61 CGCCTAGnGGACAACGACACCTCCA^ATACiG TGTCGACACCAGAACCACCACCAGCGCAGT81 CGCCTAGnGGACAACGACACCTCCA^ATACi CATCGCCAAGGCTTGCCCTGACGGTTTACCA83 CGCCTAGnGGACAACGACACCTCCA^ATACK CCTGCTCATCAACGTAACAAAGCGAGAGGCT101 CGCCTAGTTGGACAACGACACCTCCA^ATACRkC, GACGAAAGATTAAGAGGAAGCTAGTTTGA102 CGCCTAGTTGGACMCGACACCTCCA^ATAOX. AAATGGAGCGGATTGCATCAAATAAAAACC103 CGCCTAGTTGGACAACGACACCTCCA^ATAm TGCAAATTATAGTCAGAAGCAATCAATAAC121 CGCCTAGTTGGACMCGACACCTCCA^ATAOC￡k TTAGATTATTTCAACGCAAGGGGAGCAAA
122 CGCCTAGTTGGACAACGACACCTCCA^ATAOC,^ TAATCTTTGCGGGAGAAGCCTTACATTTC123 CGCCTAGTTGGACMCGACACCTCCA^ATA(L TGTTTAGATGACCCTGTAATACTGTAAAACTIOnt DNA短链序列(从左到右为5，-3，)CGCCTAGTTG巯基基团修饰报告探针序列(从左到右为5’ -3’ )
GTGGAGGTGTCGTTGTCCAACTAGGCG-SH两种toehold长短不同靶核苷酸链(横线部分是toehold，加框部分是SNP检测位 点，从左到右为5’ -3’ )GTAi|g TGGAGGTGTCGTTGTCCAACTAGGCG(full-matched)GTAT@G TGGAGGTGTCGTTGTCCAACTAGGCG本实施例通过原子力显微镜成像的结果可以验证，本实施例的方法简单、准确，检 测成本又低等优点，而且无需严格的检测的条件和复杂的酶反应。验证时，吸取2. 5 μ 1样品(实际2-5 μ 1均可)滴到新切云母表面，吸附2分钟后 即可拿到原子力显微镜下成像。统一使用轻敲模式，液相成像。原子力显微镜成像结果显示，采用本实施例所述方法，检测单核苷酸多态性效率 能达到95%以上
权利要求
一种纳米金颗粒检测单核苷酸多态性的方法，其特征在于，包括如下步骤第一步，利用DNA折纸术构造一个非对称二维图形，制备DNA折纸芯片；第二步，制备胶体金探针；第三步，DNA短链与胶体金探针杂交；第四步，粒径胶体金探针与非对称二维图形DNA折纸芯片连接；第五步，单核苷酸多态性检测。
2.根据权利要求1所述的纳米金颗粒检测单核苷酸多态性的方法，其特征是，第一步 中所述的DNA折纸芯片的制备方法(1)把所有要用的ΙΟΟμΜ订书钉链，包括形成非对称二维图形的、伸出探针的等体积 混合，再稀释20倍备用；(2)在96孔板上混合总量为30μ 1的溶液0. 025 μ M订书钉链22 μ 1 ；1/2浓度的 M13mpl8 1 μ 1 ； 1 XTAE-Mg2+buffer :7μ 1。
3.根据权利要求1所述的纳米金颗粒检测单核苷酸多态性的方法，其特征是，第二步 中所述的胶体金探针制备方法①寡核苷酸与5nm粒径胶体金摩尔浓度比200比1加入IOmM磷酸缓冲液中，室温 300rpm摇24小时；②加入终浓度0.IM NaCl，室温300rpm摇48小时；③40C，15000rpm离心10分钟，弃上清；④加入IOmM磷酸缓冲液，终浓度0.IM NaCl清洗两次；⑤加入Ix TE ；IOmM Tris-HCl，ImM EDTA, pH = 8. 0，4°C保存；⑥5nm粒径胶体金探针浓度利用520nm波长紫外吸收峰测定。
4.根据权利要求1所述的纳米金颗粒检测单核苷酸多态性的方法，其特征是，第三步 中所述的杂交是指5nm粒径胶体金探针与IOnt DNA短链摩尔浓度比1比1混合，50°C水 浴杂交1小时。
5.根据权利要求1所述的纳米金颗粒检测单核苷酸多态性的方法，其特征是，第四步 中所述的连接是指5nm粒径胶体金探针与非对称二维图形DNA折纸芯片摩尔浓度比2比1 混合，37°C水浴杂交1小时。
6.根据权利要求1所述的纳米金颗粒检测单核苷酸多态性的方法，其特征是，第五步 中所述的单核苷酸多态性检测的步骤在原子力显微镜成像前，加入报告探针摩尔浓度2 倍量的靶核苷酸链，取若干时间点原子力显微镜成像。
7.根据权利要求6所述的纳米金颗粒检测单核苷酸多态性的方法，其特征是，所述的 原子力显微镜成像，原本都是有亮点的，在某一时间后，完全互补的已没有亮点，根据分支 迁移反应机制，加入两种toehold长短不同靶核苷酸链，单碱基突变的仍有明显亮点。
全文摘要
一种纳米技术领域的纳米金颗粒检测单核苷酸多态性的方法。包括如下步骤利用DNA折纸术构造一个非对称二维图形，制备DNA折纸芯片；制备胶体金探针；DNA短链与胶体金探针杂交；粒径胶体金探针与非对称二维图形DNA折纸芯片连接；单核苷酸多态性检测。本发明具有无需严格的实验条件和复杂的酶反应，同时既简单，又低成本等优点。通过本发明可以在纳米尺度、液相反应中实现DNA杂交过程，实现高灵敏的生物医学检测。
文档编号C12Q1/68GK101956015SQ20101050306
公开日2011年1月26日 申请日期2010年10月12日 优先权日2010年10月12日
发明者冯晓录, 李璨, 贺林, 陈培华 申请人:上海交通大学;上海佰真生物科技有限公司