专利名称：利用油菜素内酯刺激雨生红球藻快速生产虾青素的方法
技术领域：
本发明提供一种利用油菜素内酯刺激雨生红球藻快速生产虾青素的方法，属于生 物技术领域。
背景技术：
虾青素(3，3' - 二羟基_4，4' - 二酮基_β，β'-胡萝卜素，C4tlH52O4)是一种在 医药、食品和饲料领域有广泛应用前景和巨大市场潜力的类胡萝卜素。与其它类胡萝卜素 一样，它有一个很长的共轭双键，但该双键末端还含有不饱和的α -羟基酮，这种结构使得 虾青素比普通类胡萝卜素具有一些特殊的生理功能。主要体现在两个方面首先，具有超强 的抗氧化活性，有研究显示虾青素抗氧化活性显著高于胡萝卜素(10倍以上)、玉米黄 素、角黄质、维生素C和维生素E (550倍)等常见抗氧化物质；其次，大量研究表明，虾青素 能大幅提高人和动物的免疫力，还能防治癌症，有被开发成为抗肿瘤药物的潜能。对天然虾 青素生物学功能和药理药效研究表明它是安全健康的天然色素，在日本、美国、、欧盟、加拿 大已被批准为安全的人类食品添加剂，用于食品的着色、保鲜、营养补充及用作珍贵鱼类和 甲壳类动物和家禽的饲料添加剂。雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)在多种逆境胁迫条件下，如强光、高温、 营养盐(氮、磷)饥饿、高盐等，能够迅速合成并大量合成积累虾青素，其积累量最高可达 藻细胞干重的4.0%，远远高于从水产品废弃物(虾蟹等甲壳)提取和利用红发夫酵母 (Phaffiarhodoxyma)发酵生产虾青素的产量(0. 15% -0.4% ),因此被公认是目前自然界 中生产天然虾青素最理想的工具。过去关于刺激雨生红球藻积累虾青素的诱导因子研究大多集中在物理因子和 化学因子。植物激素在高等植物中有着广泛的应用，但在微藻中的应用报道还很少， 同上述诱导因子相比较，植物激素具有用量小、效益高、残毒少等优势。油菜素内酯 (Brassinosteroids,BR)能调控植物生长发育，是公认的第六大类植物激素，并且在作用过 程中与其它植物激素如脱落酸、水杨酸、乙烯等有着密切联系，BR细胞信号通路是植物学最 前沿的领域之一，如今BR已在农业上得到应用，但在微藻上的应用却没有相关报道。目前，国内市场上已经有一些生产虾青素的相关专利技术，如宁波大学的“大 规模培养雨生红球藻和转化虾青素的装置及其方法”(200610154678.0)公开了一种大 规模培养雨生红球藻和转化虾青素的装置及方法，整个培养装置由设置在固定架上的 光生物反应器系统、充气装置、培养液灌输装置和静细胞收集装置组成，固定架上设置 浮沉控制装置；中山大学的“光生物反应器促进雨生红球藻生长增殖及调控虾青素合 成和积累的方法”(CN02134387.X)，涉及几种可调控的全天候封闭式大规模运行系统光 生物反应器培养和促进雨生红球藻生长增殖及提高种群密度和调控细胞内次生代谢产 物虾青素合成和积累的方法。“从甲壳质、壳聚糖生产废水中回收虾青素和蛋白质的方 法”(CN200510047267. 7)，主要是从甲壳质、壳聚糖生产废水中回收虾青素，虽然能变废为 宝，但是虾青素的提取效率较低。“产虾青素的藻类和酵母混合培养发酵生产虾青素的方法”(CN03105314. 9)，公开了一种产虾青素的藻类和酵母混合培养发酵生产虾青素的方法， 属于生物法生产虾青素技术。该方法是在装有特定培养基的反应器内，同时接种包括雨生 红球藻在内的藻类和包括红发夫酵母在内的酵母进行混合培养发酵生产虾青素。“一种培 养雨生红球藻生产虾青素的方法(CN02138827.X)公开了一种培养雨生红球藻生产虾青素 的方法，包括培养基配方、一步法生产工艺、培养基的循环使用和用二氧化碳调节培养液PH 值诱导红球藻孢子的形成及虾青素积累的方法。上述相关专利技术虽然先进，但均涉及光 生物反应器等专业设施，对设备要求比较高，技术工艺比较复杂，操作有难度，而且费用很 高，这无疑增加了生产成本和技术推广的难度。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够克服现有技术中存在的缺陷，技术工艺简单易行、 廉价高效且能显著提高雨生红球藻生产虾青素效率的利用油菜素内酯刺激雨生红球藻快 速生产虾青素的方法。其具体的技术方案为利用油菜素内酯刺激雨生红球藻快速生产虾青素的方法，其特征在于采用如下步 骤(1)制备藻液培养雨生红球藻细胞到对数生长期，获得诱导培养的藻液；(2)积累虾青素先用2倍体积的无水乙醇溶解油菜素内酯，再用二甲亚砜配制成 浓度为lmg/mL的油菜素内酯母液，将油菜素内酯母液添加到上述已培养好的藻液中至油 菜素内酯终浓度为4. 95 5. 05mg/L ；然后将上述添加了油菜素内酯的藻液在25 28°C、 光强4500 50001χ、日光灯连续光照及营养盐饥饿的复合胁迫条件下进行培养，直至光学 显微镜下观察到雨生红球藻细胞完全变红，即完成虾青素积累，此时虾青素产量达到最高。所述的利用油菜素内酯刺激雨生红球藻快速生产虾青素的方法，步骤(1)中，雨 生红球藻采用712藻株，采用MCM培养基，在温度19 21 °C，光强1500 18001x，光暗比为 12h/12h的条件下培养，日光灯下培养至培雨生红球藻细胞达到对数生长期，此时细胞浓度 达 IO8 个 /mL。所述的利用油菜素内酯刺激雨生红球藻快速生产虾青素的方法，油菜素内酯采用 中科瑞泰(北京)生物科技有限公司生产的油菜素内酯。本发明与现有技术相比，其优点是1、本发明简单易行、成本低廉，原材料雨生红球藻细胞可以按常规方法自行培养。2、本发明能大幅提高雨生红球藻中虾青素的积累效率，实验证明，添加4. 95 5. 05mg/L油菜素内酯处理组比空白对照组雨生红球藻细胞完成虾青素积累的周期缩短了 63. 6 68. 2%，虾青素产量为空白对照组的94. 2 95. 7%，达11. 25 11. 43mg/L藻液。
具体实施例方式实施例1 步骤1、制备藻液雨生红球藻选用712藻株，采用MCM培养基，在温度19°C、 15001x光强、光暗比为12h/12h的条件下培养，日光灯下培养至雨生红球藻细胞达到对数 生长期，细胞浓度达IO8个/mL，即获得诱导培养的藻液；步骤2、诱导雨生红球藻积累虾青素油菜素内酯采用中科瑞泰(北京)生物科
4技有限公司生产的油菜素内酯。先用2倍体积的无水乙醇溶解油菜素内酯，再用二甲亚砜 配制成浓度为1. Omg/mL的油菜素内酯母液，将油菜素内酯母液添加到上述已培养好的藻 液中至油菜素内酯终浓度为4. 95mg/L;然后将上述添加了油菜素内酯的藻液与空白对照 组藻液同时在25°C、光强45001x、日光灯连续光照及营养盐饥饿的复合胁迫条件下进行培 养，16天后雨生红球藻细胞完全变红，即完成虾青素积累，此时虾青素含量达到最高。实施例2:步骤1、制备藻液雨生红球藻选用712藻株，采用MCM培养基，在温度20°C、光强 18001x、光暗比为12h/12h的条件下培养，日光灯下培养至雨生红球藻细胞达到对数生长 期，细胞浓度达IO8个/mL，即获得诱导培养的藻液；步骤2、诱导雨生红球藻积累虾青素油菜素内酯采用北京中科瑞泰生物科技有 限公司生产的油菜素内酯。先用2倍体积的无水乙醇溶解油菜素内酯，再用二甲亚砜配制 成浓度为1. Omg/mL的油菜素内酯母液，将油菜素内酯母液添加到上述已培养好的藻液中 至油菜素内酯终浓度为5. Omg/L ；然后将上述添加了油菜素内酯的藻液与空白对照组藻液 同时在26°C、光强48001x、日光灯连续光照及营养盐饥饿的复合胁迫条件下进行培养，15 天后雨生红球藻细胞完全变红，即完成虾青素积累，此时虾青素含量达到最高。实施例3:步骤1、制备藻液雨生红球藻选用712藻株，采用MCM培养基，在温度21°C、光强 16001x、光暗比为12h/12h的条件下培养，日光灯下培养至雨生红球藻细胞达到对数生长 期，细胞浓度达IO8个/mL，即获得诱导培养的藻液；步骤2、诱导雨生红球藻积累虾青素油菜素内酯采用中科瑞泰(北京)生物科 技有限公司生产的油菜素内酯。先用2倍体积的无水乙醇溶解油菜素内酯，再用二甲亚砜 配制成浓度为1. Omg/mL的油菜素内酯母液，将油菜素内酯母液添加到上述已培养好的藻 液中至油菜素内酯终浓度为5. 05mg/L ；然后将上述添加了油菜素内酯的藻液在28°C、光强 50001x、日光灯连续光照及营养盐饥饿的复合胁迫条件下进行培养，14天后雨生红球藻细 胞完全变红，即完成虾青素积累，此时虾青素含量达到最高。采用以下方法对本发明中含有油菜素内酯的藻液及空白对照组藻液定期进行显 微观察，具体是每天取少量藻液样品在光学显微镜下观察藻细胞的颜色变化以及虾青素积 累情况；然后按以下步骤对本发明含有油菜素内酯的藻液及空白对照组藻液中的虾青素含 量进行测定①每三天各取出3ml上述两种藻液，5000r/min离心5min，弃上清得到藻细胞 沉淀；②分别向两种藻细胞沉淀加入5% KOH和30%甲醇破坏叶绿素5min后，5000r/min离 心收集沉淀；③在收集的沉淀中分别加入3ml 二甲亚砜，利用超声波破壁后(3次15sec破 壁/5sec间歇，输出功率40W)，于70°C水浴中处理lOmin，抽提至藻体发白；④然后IOOOOr/ min离心lOmin，分别取上清于490nm下测定OD值；⑤按公式C(mg/L) = (4. 5A X 490 X Va)/ Vb计算两种上清中的虾青素含量，其中A表示OD值，Va表示二甲亚砜的体积，Vb表示藻液 体积。结果表明空白对照组雨生红球藻细胞完全变红的时间为44天，此时虾青素含量 为11. 94mg/L藻液，油菜素内酯处理组比空白对照组的雨生红球藻细胞完全变红的周期缩 短63. 6 68. 2%，虾青素 量为空白对照组的94. 2 95. 7%，达11. 25 11. 43mg/L藻 液。
权利要求
一种利用油菜素内酯刺激雨生红球藻快速生产虾青素的方法，其特征在于采用如下步骤(1)制备藻液培养雨生红球藻细胞到对数生长期，获得诱导培养的藻液；(2)积累虾青素先用2倍体积的无水乙醇溶解油菜素内酯，再用二甲亚砜配制成浓度为1mg/mL的油菜素内酯母液，将油菜素内酯母液添加到上述已经培养好的藻液中至油菜素内酯终浓度为4.95～5.05mg/L；然后将上述添加了油菜素内酯的藻液在25～28℃、光强4500～5000lx、日光灯连续光照及营养盐饥饿的复合胁迫条件下进行培养，直至光学显微镜下观察到雨生红球藻细胞完全变红，即雨生红球藻细胞完成积累虾青素，此时虾青素产量达到最高。
2.根据权利要求1所述的利用油菜素内酯刺激雨生红球藻快速生产虾青素的方法，其 特征在于步骤(1)中，雨生红球藻采用712藻株，采用MCM培养基，在温度19 21°C，光 强1500 18001x，光暗比为12h/12h的条件下培养，日光灯下培养至培雨生红球藻细胞达 到对数生长期，此时细胞浓度达IO8个/mL。
3.根据权利要求1所述的利用油菜素内酯刺激雨生红球藻快速生产虾青素的方法，其 特征在于油菜素内酯采用北京中科瑞泰生物科技有限公司生产的油菜素内酯。全文摘要
本发明提供一种利用油菜素内酯刺激雨生红球藻快速生产虾青素的方法，采用如下步骤(1)制备藻液培养雨生红球藻细胞到对数生长期，获得诱导培养的藻液；(2)积累虾青素先用2倍体积的无水乙醇溶解油菜素内酯，再用二甲亚砜配制成浓度为1mg/mL的油菜素内酯母液，将油菜素内酯母液添加到上述已培养好的藻液中至油菜素内酯终浓度为4.95～5.05mg/L；然后将上述添加了油菜素内酯的藻液在25～28℃、光强4500～5000lx、日光灯连续光照及营养盐饥饿的复合胁迫条件下进行培养，直至光学显微镜下观察到雨生红球藻细胞完全变红，此时虾青素产量达到最高。本发明简单易行、成本低廉、并能大幅缩短雨生红球藻细胞完全变红的时间，从而大大提高雨生红球藻生产虾青素的效率。
文档编号C12R1/89GK101974599SQ20101050596
公开日2011年2月16日 申请日期2010年10月14日 优先权日2010年10月14日
发明者叶乃好, 孟春晓, 王依涛, 罗韬, 胡百文, 高政权 申请人:山东理工大学