专利名称：一种来源于荧光假单胞菌的磷脂酶b及其生产方法
技术领域：
本发明涉及一种来源于荧光假单胞菌的磷脂酶B及其生产方法，属于酶基因工程 和酶工程领域。
背景技术：
磷脂在自然界分布广泛，所有的细胞中都含有磷脂，磷脂是生物膜的基本组成成 分。磷脂在生命过程中起代谢作用和结构形成作用，是重要的生命物质。磷脂酶是水解磷 脂的酯键的酶，广泛存在于真核生物和原核生物中，影响磷脂的分解代谢、生物膜的形成和 重组，并且磷脂酶也涉及信号的级联。依据其作用位点不同，磷脂酶分为磷脂酶Ai、A2、B、C、 D等。其中磷脂酶~和^分别水解Sn-1和Sn-2位酰基，产生溶血磷脂和脂肪酸。磷脂酶 B具有水解酶和溶血磷脂酶的活性。水解酶的活性能同时水解Sn-1和Sn-2位酰基，溶血磷 脂酶的活性则能水解溶血磷脂剩余的酰基。磷脂酶在工业中有多种应用，包括应用于食品和非食品的磷脂乳化剂的修饰，增 加油/水混合物的乳化；磷脂酶可用于植物油加工过程中的酶法脱胶；淀粉水解产物(特 别是小麦淀粉的水解产物)的后续处理以提高过滤通透能力。此外，磷脂酶在烘焙应用中 对于提高生面团或烘焙产品质量特别有效。低温磷脂酶B的最适酶活温度一般在40°C以 下，它具有最适酶活温度低，在低温下具有更高的催化效率等特点，因而应用于植物油酶法 脱胶和修饰磷脂乳化剂等工业生产中可简化生产工艺、节能减耗、提高产品质量、保护环 境、降低生产成本。磷脂酶B已从动物、植物、微生物等不同的来源获得。动物包括天竺鼠 [A.Gassama-Diagne 等，(J. Biol. Chem.)，264，9470-9475，1989]；老鼠[S. Pind et al.， (Biochem. Cell. Biol. )，69，346-357，1991]；兔子[ff. Boll et al.，(J. Biol. Chem. )，268， 12901-12911,1993] o 植物有蚕豆[Y.Lee et al.，(FEBS Lett. )，343，213-218，2001]。微 生物包括酿酒酵母[M. Ichimasa et al.，(Agric. Biol. Chem.)，49 (4)，1083-1089，1985 ； F. Paultaufet al.，(J. Biol. Chem. )，269，19725-19730，1994]；粟酒裂殖酵母[H. Oishi. et al.，(Biosci. Biotech. Biochem.) ,60(7)，1087-1092，1996]；产黄青霉[N. Kawasaki, et al.， (J. Biol. Chem.) ,77,1233—1244，1975 ；N. Masuda. etal.，(Eur. J. Biochem.) ,202, 783—787， 1991]；牛莫氏杆菌[J. M. Tennent et al.，(J. Bacteriol.), 183,6717-6720,2001]；鼠麻风分 支杆菌[Shinji Mae da et al. , (Biochimica et Biophysica Acta), 1303,31-38,1996]。但 动植物磷脂酶B来源有限，且价格昂贵。微生物磷脂酶B的研究发现为磷脂酶的应用提供了 新的来源，并且其发酵条件简单，大大降低了生产成本，为以后的工业化生产奠定了基础。到 目前为止，有关产生低温磷脂酶B的荧光假单胞菌的研究，国内外尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种来源于荧光假单胞菌的磷脂酶B及其生产方法，该 磷脂酶B在低温下显示活性，并且无脂肪酶的活性，能够水解催化完整磷脂中的两个脂酰基基团，该方法简单、产品质量高、生产成本低。本发明的目的是通过以下技术方案实现的。本发明的一种来源于荧光假单胞菌(Pseudomonas f luorescens)的磷脂酶B，该 磷脂酶B由荧光假单胞菌产生，磷脂酶B在低温下具有良好的活性和稳定性。磷脂酶B基 因全长1272bp，编码423个氨基酸，酶蛋白理论分子量为45. 8kDa，其中1 69bp编码磷脂 酶B信号肽，70 1272bp编码磷脂酶B成熟肽；利用现有分子生物学方法可以得到其表达 载体和重组宿主，即获得含有磷脂酶B基因的大肠杆菌重组质粒以及重组大肠杆菌。本发明的一种来源于荧光假单胞菌的磷脂酶B的生产方法，在合适的发酵培养基 中培养可产生磷脂酶B的荧光假单胞菌株系。通过对发酵培养基及发酵工艺参数的优化， 选用廉价普通的营养成分，采用常规单批发酵方式，磷脂酶B发酵酶活达43. 2U. mL-1.,其中 发酵培养基为终浓度百分含量(g/mL)0. 01 5%大豆磷脂，0. 1 10%淀粉，0. 01 5% 牛肉膏，0. 01 5%蛋白胨，0. 01 3% NaCl，0. 01 2% MgS04 7H20，调 pH3. 0 11. 0。 通过SDS-PAGE以及从荧光假单胞菌克隆到磷脂酶B基因，进一步确定了菌株BIT-18只产 生磷脂酶B，无脂肪酶活性。有益效果本发明的磷脂酶基因B在低温下显示活性，并且无脂肪酶的活性，能够水解催化 完整磷脂中的两个脂酰基基团，在油脂精炼和修饰磷脂乳化剂等工业过程中有着广泛的应 用，本发明的制备方法简单、产品质量高、生产成本低。
图1为棕榈酸甲酯的标准品气相色谱图；图2为油酸甲酯的标准品气相色谱图；图3为荧光假单胞菌BIT-18表达磷脂酶的气相色谱鉴定图；图4为磷脂酶B温度变化曲线；图5为磷脂酶B pH值变化曲线；图6为PCR扩增荧光假单胞菌BIT-18的磷脂酶B基因保守片段的琼脂糖凝胶 电泳；其中M表示DL2000Marker，1表示单引物PLB-1PCR产物，2表示双引物PLB-1和 PLB-2PCR产物，3单引物PLB-2PCR产物；图7为PCR扩增荧光假单胞菌BIT-18的磷脂酶B全长基因的琼脂糖凝胶电泳；其 中M表示DL2000Marker，1表示磷脂酶B全长基因PCR产物；图8为大肠杆菌重组质粒pET28a(+)-plb单酶切和双酶切图；其中M表示 lkbMarker, 1表示EcoRI和Hind III双酶切，2表示EcoRI单酶切，3表示Hindlll单酶切；图9为在大肠杆菌中表达的磷脂酶B的SDS-PAGE ；其中M表示蛋白Marker，1和6 表示荧光假单胞菌BIT-18表达的磷脂酶B，2表示重组大肠杆菌BL21 (DE3)诱导前全细胞， 3表示重组大肠杆菌BL21(DE3)诱导后全细胞，4 表示重组大肠杆菌BL21 (DE3)的周质部 分，5表示重组大肠杆菌BL21(DE3)的上清部分。
具体实施例方式实施例1
一、产生磷脂酶菌株的筛选1、菌种的分离筛选采自新疆维吾尔自治区石河子市、山西省大同市、运城市、河南省郑州市，其中包 括大豆油、菜籽油、棉籽油加工车间周围及大豆和菜籽种植基地的土样，均为地表以下10cm 处采集，共18份。取土样10g，放入盛有90mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶，室温振荡 12h后静置。吸取lmL上层液体接种于49mL富集培养基(大豆磷脂4. Og/L, KN031. Og/L, K2HP041. Og/L, NaCl 0. 5g/L，MgS04 7H20 0. 5g/L)中，30°C摇瓶培养 24h，然后取少量富集 培养液涂布于初筛培养基(大豆磷脂4. Og/L，蛋白胨10. 0g/L, K2HP041. 0g/L, NaCl 0. 5g/ L，MgS04.7H20 0. 5g/L，琼脂18. Og/L)平板上，分离得到能够以大豆磷脂为唯一碳源生长且 产生水解圈的单菌落，水解圈直径与菌落直径比值(R)越大则表明磷脂酶的活力越大。采 用分离培养基筛选得到136株产磷脂酶的微生物，其中有4株菌的水解圈较大。将平板初筛获得的4株菌接种于LB磷脂平板(分别采用酚红和罗丹明染色)， 30°C培养72h，水解圈直径与菌落直径比值(R)越大则表明磷脂酶的活力越大。选出产酶 能力较强的菌株进行斜面保存。单菌株摇瓶发酵(葡萄糖10.(^/1，牛肉膏7.58/1，蛋白胨 7. 5g/L，NaCl 3. 0g/L, MgS04 7H201. Og/L,大豆磷脂 4g/L)试验复筛表明菌株 BIT-18 所产 磷脂酶活力最高，酶活力达到25U. mL—1，可作为进一步研究的原始菌株。2.菌种鉴定(1)生理生化检测形态特征参照《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》(《Bergey's Manual of Systematic Bacteriology)))第九版和《常用细菌系统鉴定手册》中的方法进行，生理生化特征采用细 菌生化试验鉴定仪及配套革兰氏阴性菌检测试验卡对复筛菌株进行生理生化特征鉴定。产 生磷脂酶的微生物菌株BIT-18的生物学特性如表1所示表1菌株BIT-18的生理生化特征
权利要求
1.一种磷脂酶B，其能够水解磷脂中的两个脂酰基基团，其特征在于来源于荧光假单 胞菌的一个株系。
2.根据权利要求1所述的一种磷脂酶B，其特性在于荧光假单胞菌的一个株系为 BIT-18，其 GenBank 号为 GU367870。
3.根据权利要求1所述的一种磷脂酶B，其特性在于由423个氨基酸组成，酶蛋白理 论分子量为45. 8kDa。
4.根据权利要求3所述的一种磷脂酶B，其特性在于423个氨基酸包含与序列SEQ NO. 2所示氨基酸序列有至少90%同源性的氨基酸序列，且能够水解磷脂中的两个脂酰基基团。
5.根据权利要求3所述的一种磷脂酶B，其特性在于423个氨基酸包含的N端氨基酸 序列是序列SEQ NO. 2的第1-423位所示序列。
6.根据权利要求3所述的一种磷脂酶B，其特性在于423个氨基酸所对应的核苷酸序 列为SEQ NO. 1，全长为1272bp，其中1 69bp编码磷脂酶信号肽，70 1272bp编码磷脂酶 成熟肽。
7.一种磷脂酶B的生产方法，其特征在于在合适的发酵培养基中培养可产生磷脂酶B 的荧光假单胞菌株系；通过对发酵培养基及发酵工艺参数的优化，选用廉价普通的营养成 分，采用常规单批发酵方式，以及随后离心回收磷脂酶B;其中发酵培养基为终浓度百分 含量g/mL，0. 01 5%大豆磷脂，0. 1 10%淀粉，0. 01 5%牛肉膏，0. 01 5%蛋白胨， 0. 01 3% NaCl,0. 01 2% MgSO4 · 7H20，调 pH3. 0 11. 0。
8.一种磷脂酶B的生产方法，其特征在于步骤为从可产生磷脂酶B的荧光假单胞菌 株系中分离编码磷脂酶B的DNA序列；在合适的载体上将该DNA片段连上合适的表达信号； 用该载体转化合适的异源宿主生物体；在可导致磷脂酶B表达的条件下培养经转化的宿主 生物体，并从培养基中回收磷脂酶B。
9.根据权利要求8所述的一种磷脂酶B的生产方法，其特征在于异源宿主物体为原 核细胞。
10.根据权利要求9所述的一种磷脂酶B的生产方法，其特征在于原核细胞为大肠杆菌。
全文摘要
本发明涉及一种来源于荧光假单胞菌的磷脂酶B及其生产方法，属于酶基因工程和酶工程领域。该磷脂酶B由荧光假单胞菌产生，其基因全长1272bp，编码423个氨基酸，酶蛋白理论分子量为45.8kDa，其中1～69bp编码磷脂酶B信号肽，70～1272bp编码磷脂酶B成熟肽。利用现有分子生物学方法可以得到其表达载体和重组宿主，即获得含有磷脂酶B基因的大肠杆菌重组质粒以及重组大肠杆菌。本发明的磷脂酶B在低温下具有良好的活性和稳定性，并且无脂肪酶的活性，能够水解催化完整磷脂中的两个脂酰基基团，在油脂精炼和修饰磷脂乳化剂等工业过程中有着广泛的应用，制备方法简单、产品质量高、生产成本低。
文档编号C12R1/39GK102002486SQ20101051623
公开日2011年4月6日 申请日期2010年10月22日 优先权日2010年10月22日
发明者姜芳燕, 戴大章, 李春, 王金梅 申请人:北京理工大学