专利名称：一种用于生物传感器测定生化需氧量的包埋BODseed的有机-无机杂化材料膜及制法的制作方法
技术领域：
本发明属于采用溶胶-凝胶包埋BODseed制备有机-无机杂化材料膜，用于水质 生化需氧量的快速检测。
背景技术：
生化需氧量(BOD)是检测环境污染的重要指标之一。传统的BOD5测定方法，耗时 5日，并对操作人员的要求较高，测定结果往往偏差也较大。近些年来发展起来的生物传感 器方法逐渐得到重视。生物传感器方法是指将含有微生物的生物膜固定在氧电极表面，当 水样中的氧气在通过生物膜到达氧电极的同时部分被微生物呼吸作用所利用，根据剩余氧 气含量建立氧气消耗量与水样有机物线性关系的一种快速测定方法。生物膜是生物传感器方法检测BOD的核心，而构成生物膜的微生物和固定化材料 是决定生物膜性能的关键。一般来说，采用单一微生物制备的生物膜，具有较好的长期稳定 性，但因菌种单一，适用性较差，测试不同种类的水体表现出的差异化巨大。而混合微生物 具有广谱的有机物源，对环境适应能力更强，测试更灵敏，准确，对不同水体具有良好的信 号响应(Liu and Mattiasson, Water Research，36，2002，3786)，因此，近年来采用混合微 生物作为受试体用于快速BOD的研究越来越多。文献报道的采用混合微生物作为受试体用于快速BOD的研究，集中于对活性污泥 的研究。BODseed是一种商品化的微生物源，含有7种从活性污泥中分离出来的高效微生 物，最初作为BOD5测试中接种的微生物使用。随后的研究中，BODseed也被作为受试微生物 制备生物膜用于快速BOD测试中，因其菌种组成的多样性，在测试不同种类污水BOD时表现 出了与 BOD5 较高的相关性(Tan and Lim, Sensorsand Actuators B，107，2005，546)。采用物理夹层法包埋微生物的固定方法简单方便，但因包埋的微生物容易泄漏 导致其稳定性差。文献报道采用聚四氟乙烯夹层包埋活性污泥用于BOD的测量，传感器建 立第二日信号较首日已经降低80%，无法实现实际应用(Liu et al. ,Biosens. Bioelectro 14,2000,883)。然而，绝大多数包埋混合菌的研究都局限于物理夹层方法，还未见其他科研 小组采用化学包埋方法固定混合菌的报道。
发明内容
为了解决已有技术存在的问题，本发明的目的之一是提供一种用于生物传感器测 定生化需氧量的包埋BODseed的有机-无机杂化材料膜，所述的材料膜是正硅酸乙酯的溶 胶-凝胶和聚乙烯醇接枝4-乙烯基吡啶相混合时形成的互穿网络材料。该互穿网络材料 能牢固的固定BODseed混合菌，用于快速BOD的检测。本发明的目的之二是提供一种用于生物传感器测定生化需氧量的包埋BODseed 的有机-无机杂化材料膜的制法，其步骤如下(1)将接枝度为5-30%的聚乙烯醇接枝4-乙烯基吡啶配成质量浓度为2-5%的水溶液A ；(2)将BODseed扩大培养后离心分离，加入磷酸盐缓冲溶液中，得到菌浓度为1_6
毫克/毫升的悬浮液B;(3)把无机材料正硅酸己酯溶于甲醇或乙醇，加入浓度为0. Imoir1盐酸作催化 剂，再加入水混勻，超声振荡1小时后，得溶胶C;正硅酸己酯、甲醇或乙醇、浓度为0. Imol 厂1盐酸和水的体积比为20-60 5-20 2-5 50-300 ；(4)然后将溶液A、悬浮液B与溶胶C，按质量比1 0.2-0.5 0. 2_1混勻；用取 样器移取该混合液滴涂到微孔透气膜表面，2-6°C下放置12小时，得到一种用于生物传感 器测定生化需氧量的微生物有机-无机杂化材料膜。该材料膜厚度为5-10 μ m有益效果本发明提供一种用于生物传感器测定生化需氧量的包埋BODseed的有 机-无机杂化材料膜，所述的材料膜是正硅酸乙酯的溶胶-凝胶和聚乙烯醇接枝4-乙烯基 吡啶相混合时形成的互穿网络材料。该互穿网络材料能牢固的固定BODseed混合菌，用于 快速BOD的检测。聚乙烯醇支链上的羟基与溶胶凝胶网络中的硅共价连接，从而防止了含 微生物的生物膜的开裂，保证了生物传感器的重现性和稳定性；聚乙烯醇接枝4-乙烯基吡 啶可以通过氢键等稳定微生物，保持微生物的长期活性。采用这种材料包埋BODseed制备 生物传感器，连续使用50天信号响应未见衰减。测试葡萄糖谷氨酸(GGA)标准溶液及不同 种类的单一有机物，结果表明BODseed生物膜对不同种类的有机物具有相似的降解效率。 这种普遍适用性将促进快速BOD的发展。
图1是制备的一种用于生物传感器测定生化需氧量的微生物有机-无机杂化材料 膜生物传感器对不同种类的有机物的信号响应。
具体实施例方式实施例1.正硅酸乙酯的溶胶-凝胶和聚乙烯醇接枝4-乙烯基吡啶包埋混合菌 BODseed(1)将接枝度为15%的聚乙烯醇接枝4-乙烯基吡啶配成质量浓度为4%的水溶液 A；(2)将BODseed扩大培养后离心分离，称取该混合菌10毫克(湿重)加入5毫升 的磷酸盐缓冲溶液中得到菌浓度为2毫克/毫升的悬浮液B ；(3)选择无机材料正硅酸己酯40yL，溶于IOyL的甲醇，再加入0. lmolL—1盐酸 3 μ L作催化剂，100 μ L的水，混勻，超声振荡1小时后，得溶胶C ；(4)然后将溶液Α、菌悬浮液B与溶胶C，按质量比1 0.4 0.6的比例混勻，用 取样器移取7 μ L该混合液滴涂到孔径为10 μ m的透气膜表面(Oxyphen GmbH)，4°C下放置 12小时，得到一种厚度为7 μ m的用于生物传感器测定生化需氧量的微生物有机-无机杂化 材料膜。实施例2.正硅酸乙酯的溶胶-凝胶和聚乙烯醇接枝4-乙烯基吡啶包埋混合菌 BODseed(1)将接枝度为5%的聚乙烯醇接枝4-乙烯基吡啶配成质量浓度为2%的水溶液A；(2)将BODseed扩大培养后离心分离，称取该混合菌5毫克(湿重)加入5毫升的 磷酸盐缓冲溶液中得到菌浓度为1毫克/毫升的悬浮液B ；(3)选择无机材料正硅酸己酯20yL，溶于5μ L的甲醇，再加入0. Imoir1盐酸 2 μ L作催化剂，50 μ L的水，混勻，超声振荡1小时后，得溶胶C ；(4)然后将溶液Α、菌悬浮液B与溶胶C按质量比1 0.2 0.2的比例混勻，用 取样器移取5 μ L该混合液滴涂到孔径为10 μ m的透气膜表面(Oxyphen GmbH)，4°C下放置 12小时，得到一种厚度为5 μ m的用于生物传感器测定生化需氧量的微生物有机-无机杂化 材料膜。实施例3.正硅酸乙酯的溶胶-凝胶和聚乙烯醇接枝4-乙烯基吡啶包埋混合菌 BODseed(1)将接枝度为30%的聚乙烯醇接枝4-乙烯基吡啶配成质量浓度为5%的水溶液 A；(2)将BODseed扩大培养后离心分离，称取该混合菌30毫克(湿重)加入5毫升 的磷酸盐缓冲溶液中得到菌浓度为6毫克/毫升的悬浮液B ；(3)选择无机材料正硅酸己酯60 μ L，溶于20 μ L的甲醇，再加入0. Imol L—1盐酸 5 μ L作催化剂，300 μ L的水，混勻，超声振荡1小时后，得溶胶C ；(4)然后将溶液Α、菌悬浮液B与溶胶C按质量比1 0.5 1的比例混勻，用取 样器移取 ο μ L该混合液滴涂到孔径为10 μ m的透气膜表面(Oxyphen GmbH)，4°C下放置 12小时，得到一种厚度为10 μ m的用于生物传感器测定生化需氧量的微生物有机-无机杂 化材料膜。实施例4 一种用于生物传感器测定生化需氧量的微生物有机-无机杂化材料膜 的用法将制备的一种用于生物传感器测定生化需氧量的微生物有机-无机杂化材料膜， 放置于30°C的空气饱和的磷酸盐缓冲溶液中，活化2小时。然后将所述的膜贴紧于氧电极 表面用于BOD的测试。结果显示，传感器的线性范围为l_60mg 检出限为0. 5mg 连 续稳定工作50天后，测试7次20. Omg L^1GGA标准溶液，相对标准偏差为3. 2%。该生物传 感器可稳定存放4°C冰箱中。存放20天后，对20. Omg L—1的GGA标准样品信号响应较存放 前仅降低12%，7次测试GGA相对标准偏差为4. 7% ；测试地表水及城市污水处理厂污水， 相对于BOD5的误差分别为7. 和5. 9 %，相对标准偏差分别为1. 5%和4. 6%。实施例5 —种用于生物传感器测定生化需氧量的微生物有机-无机杂化材料膜 对有机物的非特异性响应将制备的一种用于生物传感器测定生化需氧量的微生物有机-无机杂化材料膜 生物传感器用于测试不同浓度的GGA，OECD(—种国际通用的BOD标准溶液)，果糖，蔗糖， 甘油，琥珀酸，天门冬酰胺溶液及这7种溶液的混合物。测得的信号响应对其BOD5作图，得 到图1。结果表明所制备的一种用于生物传感器测定生化需氧量的微生物有机-无机杂化 材料膜生物传感器对不同种类的有机物具有相似的降解特性，这在实际应用中将展示出卓 越的优点。
权利要求
1.一种用于生物传感器测定生化需氧量的包埋BODseed的有机-无机杂化材料膜，其 特征在于，所述的材料膜是正硅酸乙酯的溶胶-凝胶和聚乙烯醇接枝4-乙烯基吡啶相混合 时形成的互穿网络材料；该材料膜是有下述方法制备的(1)将接枝度为5-30%的聚乙烯醇接枝4-乙烯基吡啶配成质量浓度为2-5 %的水溶液A；(2)将BODseed扩大培养后离心分离，加入磷酸盐缓冲溶液中，得到菌浓度为1_6毫克 /毫升的悬浮液B;(3)把无机材料正硅酸己酯溶于甲醇或乙醇，加入浓度为0.Imoir1盐酸作催化剂，再 加入水混勻，超声振荡1小时后，得溶胶C ；正硅酸己酯、甲醇或乙醇、浓度为0. Imol L—1盐 酸和水的体积比为20-60 5-20 2-5 50-300;(4)然后将溶液A、悬浮液B与溶胶C，按质量比1 0.2-0.5 0. 2_1混勻；用取样器 移取该混合液滴涂到微孔透气膜表面，2-6°C下放置12小时，得到一种用于生物传感器测 定生化需氧量的微生物有机-无机杂化材料膜。
2.一种用于生物传感器测定生化需氧量的包埋BODseed的有机_无机杂化材料膜，其 特征在于，所述的材料膜的膜厚度为5-10 μ m。
全文摘要
本发明提供一种用于生物传感器测定生化需氧量的包埋BODseed的有机-无机杂化材料膜，其是正硅酸乙酯的溶胶-凝胶和聚乙烯醇接枝4-乙烯基吡啶相混合时形成的互穿网络材料。其能牢固的固定BODseed混合菌，用于快速BOD的检测。聚乙烯醇支链上的羟基与溶胶凝胶网络中的硅共价连接，防止了含微生物的生物膜的开裂，保证了生物传感器的重现性和稳定性；聚乙烯醇接枝4-乙烯基吡啶可以通过氢键等稳定微生物，保持微生物的长期活性。采用这种材料包埋BODseed制备生物传感器，连续使用50天信号响应未见衰减。测试葡萄糖谷氨酸标准溶液及不同种类的单一有机物，BODseed生物膜对不同种类的有机物具有相似的降解效率。
文档编号C12Q1/02GK102115775SQ20101051903
公开日2011年7月6日 申请日期2010年10月26日 优先权日2010年10月26日
发明者余登斌, 刘玲, 刘长宇, 董绍俊, 郏建波, 马超 申请人:中国科学院长春应用化学研究所