专利名称：东方伊萨酵母菌、其组合物和应用的制作方法
东方伊萨酵母菌、其组合物和应用发明所属领域 本发明属于白酒酿造领域，具体地说，本发明涉及东方伊萨酵母菌、含该菌的酿酒 菌剂组合物，及该酵母菌和其组合物在白酒酿造中的应用
背景技术：
中国白酒香味物质种类繁多，包括醇、醛、酮、酸、酯、缩醛、芳香族化合物、含氮 化合物、含硫化合物、醚类、内酯类等化合物达数百种之多(庄名扬，酿酒，2007，34(2) 109-113)。中国白酒风味物质的形成，是微生物代谢的产物，同时也是原料中基本组分及非 基本组分，在各类生物酶的直接或间接催化下的生物合成、非酶促化学反应和热降解反应 等多种因素共同作用结果。白酒的风味与酿造微生物及酿造工艺也有直接关系。酿造基酒质量的高低对产品 的最终质量的好坏起决定性的作用。白酒酿造中的生香酵母又称产酯酵母，主要属于产膜 酵母和假丝酵母，大多为异型汉逊酵母及少数小圆型酵母属，是白酒和黄酒发酵产香的重 要菌种(熊子书，酿酒科技，2002，5 :19-21)。浓香型白酒以己酸乙酯为主的复合香，是由梭 状芽孢杆菌，俗称己酸菌的作用，产于泥质发酵老窖或人工培养泥窖中，发酵周期长；清香 型白酒以醋酸乙酯为主体香，在小曲、麸曲或液态法白酒中添加生香酵母，在发酵过程中生 成醋酸及其乙酯。酒精发酵过程中酯的产生量与特殊的酵母菌种类有密切关系。白酒发酵要求酿酒菌剂具有产酯率高、产酒精率高并耐高温。重量和质量相同的 原料使用不同的酿酒菌剂，形成不同的酒精产量和酯含量。好的酿酒菌剂使同样的原料酒 精产量高、富含酯类，并使白酒纯香。但传统大曲虽然产酯率高，产酒率却较低，特别是大曲 构成成份复杂，使白酒质量不稳定；而单个酵母菌或酿酒菌剂组合物不耐高温，虽发酵产酒 率高但产酯率低，白酒品质较差。在中国专利CN200710175714. 6中公开了一种东方伊萨酵母在木质纤维素水解产 物中的应用；中国专利CN200810180438. 7公开了东方伊萨酵母和其组合物制剂降解除去 存在于半纤维素水解物中微生物代谢抑制物；中国专利CN200710026730. 9也公开了东方 伊萨酵母在杨梅果酒中降酸的应用。目前还没有东方伊萨酵母菌应用于白酒发酵的报道。发明技术内容本发明的一个目的是提供一种新的东方伊萨酵母菌株，该菌株耐高温，使用该菌 株发酵生产白酒，具有高产酯率和高酒精产率，并形成白酒独特风味。本发明的另一个目的是提供一种含有东方伊萨酵母菌的酿酒菌剂组合物。本发明的再一个目的是提供制备酿酒菌剂组合物的方法。本发明的再一个目的是提供东方伊萨酵母菌株在白酒发酵中的应用。本发明的再一个目的是提供酿酒菌剂组合物在白酒发酵中的应用。本发明公开了一株新的东方伊萨酵母菌，其特征在于，该菌株为东方伊萨酵母Zl 株(Issatchenkia orientalis Zl)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2010167，保藏日期是2010年7月2日。东方伊萨酵母Zl株从湖北白云边酒池分离经筛选获得。该菌株有如下特征东方伊萨酵母Zl株可耐42°C高温，液体发酵乙酸乙酯产量高 达229. 06毫克/升，液体发酵产物酒精度可达5. 2%。即东方伊萨酵母Zl株具有耐高温， 高乙酸乙酯产力和较强的产酒精能力。东方伊萨酵母Zl株形态特征是菌落乳白色、形状为规则圆形、表面较平坦、干 燥，培养较长时间后，芽生孢子延长呈梳妆交错，假菌丝分支分布，细胞呈圆形或椭圆形。东方伊萨酵母Zl株生化特征是可发酵利用果糖，蔗糖；不能发酵利用D-半乳 糖，纤维二糖，绵子糖，D-阿拉伯糖，L-阿拉伯糖，D-海藻糖，L-鼠李糖，L-山梨糖和D-木
糖。
东方伊萨酵母Zl株耐高温及生长特征是YPD平板上划线接种，分别在33°C至 42°C下培养均生长良好。在37°C培养时，菌株Zl在YPD培养基中延迟期明显比生香产酯酵 母菌短，在早期的生长中具有明显的优势，而市售生香产酯酵母菌——安琪生香活性干酵 母具有较长的延迟期。东方伊萨酵母Zl株耐酒精能力特征是接种菌种到酒精度0-14%的YPD液体培 养基中，30°C摇床培养24小时，OD630nm测定酵母菌的生长浓度，东方伊萨酵母Zl株最高耐 受酒精度为10%，表明酵母菌Zl的耐酒精能力好。东方伊萨酵母Zl株26S rDNA D1/D2区域基因序列分析显示东方伊萨酵母Zl株 与东方伊萨酵母NRRL Y-5396株的同源性超过99%。本发明还公开了一种含东方伊萨酵母Zl株菌的酿酒菌剂组合物，该酿酒菌剂组 合物主要成份是东方伊萨酵母Zi株及胞外产物。优先地，本发明还公开了一种含东方伊萨酵母Zl株酿酒菌剂组合物，其特征在于 它含有下列组份(活菌数比)东方伊萨酵母 50%酒精酵母50%其中东方伊萨酵母为CCTCC M2010167，酒精酵母为CCTCC AY92003。酒精酵母 CCTCC AY92003为常用普通微生物菌种，登载于中国典型培养物保藏中心目录，处于公开状 态，科学工作者可向中国典型培养物保藏中心索取。本发明公开的酿酒菌剂组合物为液态或固态。优先的，本发明公开的酿酒菌剂组 合物为固态。本发明还公开了制备固态酿酒菌剂组合物的方法，包括如下步骤1)菌种活化分别接种东方伊萨酵母Zl株和酒精酵母CCTCC AY92003于灭菌的 糖度为12巴林的麦芽汁或米曲汁三角瓶培养基中，28 30°C摇床培养18-24天；2)固体培养固体培养的配料是麸皮70%、玉米面30%，用玉米糖化液润料，力口 浓硫酸，蒸煮冷散后，将1)中活化培养的2种酵母菌液按1 1体积比混合接种后装盒，
保持室温20°C左右.品温25°C左右，培养发酵2天；3)真空干燥对发酵后的固体样品在45°C进行真空干燥处理，样品含水率低于 10%后真空包装。本发明还公开了新的东方伊萨酵母菌Zl株在白酒酿造中的应用。本发明还公开了酿酒菌剂组合物在白酒酿造中的应用。本发明的优点
1、本发明提供的东方伊萨酵母Zl株是一株新的菌株，该菌株可耐42°C高温，液体 发酵乙酸乙酯产量高达229. 06毫克/升，液体发酵产物酒精度可达5. 2%。即东方伊萨酵 母Zl株具有耐高温，高乙酸乙酯产力和较强的产酒精能力。其乙酸乙酯的产生能力远高于 一般酵母菌株。2、东方伊萨酵母Zl与酒精酵母混合制备的菌剂进行液态发酵制酒，乙酸乙酯含 量比安琪生香活性干酵母发酵样品提高了 38. 3%，而产酒率相同。3、东方伊萨酵母Zl株与酒精酵母混合制备酿酒菌剂，在目前通用的白酒固态 发酵物料中添加酿酒菌剂进行发酵制酒，与不添加酿酒菌剂的对照组相比出酒率提高了 2. 7 %，同时原酒中总酯的含量增加了 9. 6 %，对改善口感作用明显。
图1.东方伊萨酵母菌Zl株26S rDNADl/D2区序列系统发育树图2.东方伊萨酵母菌Zl株及对照菌株在0-14%酒精浓度下生长曲线Zl代表东方伊萨酵母菌Zl株；XG-I代表酒精酵母CCTCC AY92003 ；TRADY代表安 琪耐高温酿酒酵母。
具体实施例方式下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明 本发明，而不能限制本发明的保护范围。实施例实施例1东方伊萨酵母Zl的分离与鉴定1. 1东方伊萨酵母Zl株的分离从白云边酒厂堆积发酵料，包括堆积后高温酒醅、 刚混合的酒醅和堆积后中等温度的酒醅中取样，将样品活化后加入到PH4. 5-5. 0的YPD液 体培养基中，转速200rpm，温度30°C时富集培养48小时，然后取100 μ 1经过一定梯度稀释 后的培养液涂布到YPD培养基固体平板上，30°C培养48小时后，挑取典型酵母形态的单菌 落，再在相同培养基固体平板上重复划线纯化三次后，4°C保存。然后通过粮食水解液发酵 实验检验这些分离出来的菌株在发酵过程中的乙醇产率、乙酸乙酯产率，最后根据发酵试 验结果筛选出产酒精能力和产酯率均较高的菌株。本发明人将分离的一株新的东方伊萨酵 母菌Zl株(Issatchenkia orientalis Zl)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC M2010167。保藏日为2010年7月2日。1. 2东方伊萨酵母菌Zl株的鉴定通过形态特征观察、生理生化测定及26SrDNA D1/D2区域基因序列分析结果对Zl进行鉴定。在鉴定中，本实验选择安琪耐高温酿酒 酵母 TRADY、东方伊萨酵母 Issatchenkia orientalis NRRL Y-5396，和 Saccharomyces cerevisiae CCTCC AY92003菌株作为对照菌株。安琪耐高温酿酒酵母TRADY为市场流通 商品；东方伊萨酵母 Issatchenkia orientalis NRRLY-5396 和酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae CCTCC AY92003为常用普通微生物菌种，分别登载于美国农业部菌种保藏中心 和中国典型培养物保藏中心目录，处于公开状态，科学工作者可向保藏中心索取。 1. 2. 1东方伊萨酵母菌Zl株形态特征观察菌落乳白色、形状为规则圆形、表面较 平坦、干燥，培养较长时间后，芽生孢子延长呈梳妆交错，假菌丝分支分布，细胞呈圆形或椭圆形。1. 2. 2通过26S rDNA D1/D2区域序列分析进行系统发育地位鉴定用酵母菌基因组DNA提取试剂盒(BioFlux杭州博日科技有限公司提供) 提取Zl的全DNA，然后以提取出来的全DNA为模板，进行PCR扩增，正向引物NLl 5，-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3，，反向引物 NL4 5，-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3，。按以下 的反应条件共进行30个循环94°C预变性5min，94°C变性lmin，59°C退火lmin，72°C延伸 lmin，30个循环后，72°C延伸5min。所得PCR产物由北京奥科生物技术公司进行纯化及序列 测定。将测定出来的Zl的26S rDNADl/D2区域与GenBank核酸序列数据库中的序列进行 比对，采用ClustalX软件进行匹配排列(align)，用MEGA4. O软件中的neighbor-joining 分析法构建系统发育树，并进行1000次Bootstraps检验，最后用TreeView软件显示系统 树。实验得到571bp的基因序列，在Genbank核酸序列数据库中进行同源序列搜索，Zl 与 Issatchenkia orientalis NRRL Y-5396 的同源性超过99%，符合Kuttzman&Robnett 所 定的同种内不同菌株见差异不超过的标准。图1是根据26S rDNA D1/D2区域序列所做 的系统发育树。1. 2. 3 东方伊萨酵母菌Zl株的生理生化实验测定结果(1)发酵试验
权利要求
1.一株东方伊萨酵母菌，其特征在于，该菌株为东方伊萨酵母Zl株(/sMideZ^ia oriental is Zl )，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2010167。
2.一种含权利要求1中所述菌株的酿酒菌剂组合物。
3.根据权利要求2中所述的酿酒菌剂组合物，其特征在于它含有下列组份(活菌数 比)东方伊萨酵母50%酒精酵母50%其中东方伊萨酵母为CCTCC M2010167，酒精酵母为CCTCC AY92003。
4.根据权利要求2中所述的酿酒菌剂组合物，其特征在于所述的酿酒菌剂组合物为 固态菌剂。
5.制备权利要求4中所述的固态酿酒菌剂组合物的方法，包括如下步骤菌种活化分别接种东方伊萨酵母Zl株和酒精酵母CCTCC AY92003于灭菌的糖度为12 巴林的麦芽汁或米曲汁三角瓶培养基中，28 30°C摇床培养18-24天；固体培养固体培养的配料是麸皮70%、玉米面30%，用玉米糖化液润料，加浓硫 酸，蒸煮冷散后，将活化培养2种酵母菌液按1 :1体积比混合接种后装盒，保持室温20°C左 右.品温25°C左右，培养发酵2天；真空干燥对发酵后的固体样品在45°C进行真空干燥处理，样品含水率低于10%后真 空包装。
6 权利要求1所述的东方伊萨酵母Zl株在白酒酿造上的应用。
7.权利要求2或3或4中所述的任何一种酿酒菌剂组合物在白酒酿造上的应用。
全文摘要
本发明提供了一株新的东方伊萨酵母菌，含该菌的酿酒菌剂组合物以及东方伊萨酵母菌及酿酒菌剂组合物在白酒酿造中的应用。本发明还提供制备酿酒菌剂组合物的方法。本发明提供的东方伊萨酵母菌耐高温，且具有高产酯率和高酒精产率。采用该菌株发酵可形成白酒独特风味。
文档编号C12G3/02GK102102084SQ20101052013
公开日2011年6月22日 申请日期2010年10月26日 优先权日2010年10月26日
发明者刘婷婷, 宋瑶, 张明春, 曾驰, 杨团元, 熊小毛, 缪礼鸿 申请人:武汉工业学院, 湖北白云边酒业股份有限公司