N-末端乙酰化蛋白或多肽的制备方法及其专用工程菌的制作方法

专利名称：N-末端乙酰化蛋白或多肽的制备方法及其专用工程菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种制备N-末端乙酰化的多肽，尤其是胸腺素的方法及其专用工程 菌。
背景技术：
乙酰化是一种广泛存在的蛋白质修饰方式，存在于原核生物、古细菌和真核生物 中，大约80 90%的哺乳动物细胞质蛋白、50%的酵母蛋白、少量的原核或古细菌蛋白质 会发生乙酉先化(Polevoda B, Sherman F. The diversity of acetylated proteins. Genome Biology, 2002, 3 :1_6)。乙酰化修饰对一些蛋白质的活性和稳定性有影响，如酶活性、酶稳定性、DNA结合、 蛋白质-蛋白质相互作用、受体识别等等。在有些情况下，缺少乙酰化会导致蛋白质热稳定 性的下降或其它动力参数的改变，或者复合体组装效率下降。酵母细胞中蛋白质的乙酰化 修饰与细胞的生长、非发酵碳源的利用、芽胞生成等有关。在哺乳动物细胞中，乙酰化修饰 与组织发育、细胞增殖和肿瘤发生等有关。N-末端乙酰化修饰对原肌球蛋白(tropomyosin) 功能极其重要，无乙酰化修饰的原肌球蛋白不能与肌动蛋白(actin)结合，不能形成多 聚体(Urbancikova M，and Hitchcock-DeGregori SE. Requirement of amino-terminal modification for striated musclealpha-tropomyosin function. J. Biol. Chem.，1994， 269 :24310-24315.)。对肽类药物而言，乙酰化修饰可以提高多肽在体内的半衰期，如乙 酰化修饰的促黑素细胞激素的半衰期是非乙酰化修饰的3倍(Rudman D, Hollins BM, Kutner MB,Moffitt SD,Lynn M1JThree types of α -melanocyte-stimulating hormone bioactivity andhalf-lives. Am J Physiol 1983，245 :E47_E54.)。一些天然多肽类药物，如胸腺素α 1 (Τ α 1)和胸腺素β 4 (Τ β 4)都含有Ν_末端乙 酰化修饰。尽管体外研究表明非乙酰化修饰形式的胸腺素也具有生物活性，但是乙酰化修 饰会增加多肽的体内稳定性。胸腺素α 1 (Τ α 1)由28个氨基酸组成，具有N-末端乙酰化修饰，分子量3108kD， 等电点4. 2，结构保守，在各哺乳动物中结构一致，分布广泛，存在于哺乳动物各组织器官 中，尤以胸腺中含量最高。Ta 1是一种生物反应调节因子，主要是T淋巴系统的免疫增强 剂，对NK细胞也有协同作用。Tal联用干扰素治疗乙型肝炎与丙型肝炎、联用化学疗法或 放射疗法或白介素_2(IL-2)治疗非小细胞肺癌和恶性黑色素瘤、联用叠氮胸苷和干扰素 治疗免疫缺陷综合征等等临床试验都显示其有良好的治疗效果(刘玉英.胸腺素a 1的研 究进展.上海医药，2003，24 (5) :211-216)。化学合成的Ta 1已在中国、美国、日本等在内的 多个国家批准临床应用，以治疗乙型肝炎、丙型肝炎和肺癌等发病率较高且严重危害人类 健康的疾病。如美国SciClone制药公司生产的T a 1 (商品名ZADAXIN)，在2006年销售额 达到3243万美元(约合人民币2. 5亿元)，其中90%来自中国市场，比2005年增加16%。 在中国售价每支(1.6mg)近800元。如果能进一步降低生产成本，作为抗病毒、肿瘤治疗的 辅助药物，T a 1在国内外的市场将会进一步扩大。
胸腺素β 4 (Τ β 4)是一个具有N-末端乙酰化修饰的43肽。T β 4是主要的肌动 蛋白螯合肽，是真核细胞中肌动蛋白聚合的调节因子。肌动蛋白有许多重要功能，如细胞 运动，细胞骨架的构建，微管形成等。这些功能受肌动蛋白丝的聚集和解聚调节，而肌动蛋 白亚单位的聚合和解聚又受 Τβ 4 调节(Allan L. Goldstein, Ewald Hannappe, and Hynda K. Kleinman. Thymosin β 4 :actin_sequestering protein moonlights torepair injured tissues. TRENDS in Molecular Medicine，2005，11 (9) :421_429)。Τβ 4 存在于多数组织 和各种类型细胞中，但不存在于红细胞中。在血小板、嗜中性粒细胞、巨噬细胞及其他淋巴 细胞中浓度很高。在血小板中浓度最高，是首先进入伤口的细胞。Τβ 4具有愈合伤口和抗 炎作用。在皮肤(真皮)伤口，Τβ4通过促进角化细胞和内皮细胞迁移，促进胶原蛋白沉 积，刺激血管生成等，引导伤口收缩和闭合。在小鼠角膜碱损伤模型中，T β 4不仅促进表皮 再植，而且减少了基质水肿，很少的炎性细胞侵染。炎性细胞侵染减少与炎性因子(IL-Ιβ、 MIP-2、MIP-I、MCP-I、KC)基因转录水平降低直接相关。近来还发现，T β 4还能抑制转录因 子NF-κ B的激活和核迁移，NF-κ B是炎性反应的主要调节因子。这可能是T β 4的抗炎活性 的机制。雷根内克斯(RegeneRx)制药有限公司正在进行T β 4的临床研究。2005年雷根内 克斯公司被FDA批准开展一项皮肤II期临床试验，在此之前他们已经在成功完成了 I期临 床试验，结果显示出较好的人体耐受性且没有毒性。2007年他们又被FDA批准进行另外两 项临床试验手术后糖尿病人角膜修复II期临床试验和急性心肌梗塞I期A临床试验。目 前该公司还有多项临床试验正在开展中，如压力溃疡II期临床试验，大疱性表皮松解症 II期临床试验，静脉阻滞溃疡II期临床试验，糖尿病患者角膜上皮细胞损伤II期临床试 验，静脉给药的单次剂量和多次剂量的I期临床试验(David Crockford,Nabila Turjman, Christian Allan,and Janet Angel. Thymosin β 4 !structure,function,and biological properties supporting current and future clinicalapplications. Ann N Y Acad Sci, 2010，1194 179-189)。由于胸腺素的分子量小，并具有N-末端乙酰化修饰，难以用基因工程技术生 产.目前国内外均采用化学合成方法生产N-末端乙酰化的Tal和Τβ4。但由于化学合成 成本高，用基因工程方法制备T α 1和T β 4更具吸引力。曾有多人尝试利用基因工程技术表 达T α 1，无论采用融合表达或者串联表达都不能获得N-末端乙酰化的T α 1和T β 4 (Esipov RS, Gurevich Al, Stepanenko VN, Chupova LA, Chuvikovsky DV, andMiroshnikov Al. Recombinant Thymosin α 1. Russian Journal of BioorganicChemistry,2004, 30 :431-435. Xiankui Li, Lishu Zheng, Fuwang Peng, ChengyuQi, Xiaoguang Zhang, Anguang Zhou, Zhewei Liu, Shuhua ffu. Recombinant thymosinbeta 4 can promote full-thickness cutaneous wound healing. Protein Expressionand Purification, 2007,56 :229-236.)。非乙酰化重组产物可以通过化学方法进行乙酰化修饰，但无疑 会增力口生产成本(Roman S.Esipov, Vasily N. Stepanenko, Ksenia A. Beyrakhova, Tatjana I. Muravjeva and Anatoly I. Miroshnikov. Production of thymosin α 1 via non-enzymatic acetylation of the recombinantprecursor. Biotechnol Appl Biochem, 2010,56 17-25)。蛋白质的N-末端乙酰化修饰是由N-末端乙酰转移酶 (N-terminalacetyltransferases,NATs)将乙酰辅酶A的乙酰基团转移到蛋白质氨基末端的α-氨基上。NH2-Plotehi + Ac-CoA NAT, Ac-NH-Plotrin + CoASH细胞内存在多种N-末端乙酰转移酶，分别负责不同类型氨基酸序列多肽的乙酰 化修饰。迄今酵母细胞的N-末端乙酰转移酶研究较多。酵母有三类不同的N-末端乙酰转移 酶NatA、NatB、NatC，分别催化不同的底物群体(Polevoda B and Sherman F. N-terminal Acetyltransferases and Sequence Requirements for N-terminalAcetyIation of Eukaryotic Proteins. J Mol Biol，2003，325 :595_622.)。NaU 催化 Ser、Ala、Gly 和 Thr 残基为末端的蛋白质乙酰化修饰，NatB催化Met-Glu、Met-Asp以及部分Met-Asn、Met-Met 为末端残基的蛋白质乙酰化修饰，NatC催化Met-Ile、Met-Leu、Met-Trp和Met-Phe为末 端残基的乙酰化修饰。真核生物的NATs都由二个或以上不同亚基组成。NatA至少有两个 亚基 Ardlp (27kDa)、Natlp (99kDa)，NatB 也有两个亚基 Nat3p (23kDa)和 Mdm20p (92kDa)， NatC由三个亚基组成:Mak3p (20kDa) ,MaklOp (84kDa)和Mak31p (IOkDa)。高等真核生物中 也存在上述三种酶的催化亚基Ardlp、Nat3p和Mak3p的同源序列，但单个亚基没有催化乙 酰转移的活性。大肠杆菌中已知的N-末端乙酰转移酶有RimI、RimJ和RimL，分别与核糖体蛋白 S18 (N-Ala)、S5 (N-Ala)和 L12 (N-Ser)的 N-末端的 Ala 或 Ser 残基乙酰化有关(Yoshikawa A, Isono S, Sheback A, Isono K. Cloning and nucleotide sequencingof the genes riml and rimj which encode enzymes acetylating ribosomal proteinsS18 and S5 of Escherichia coli K12. Mol Gen Genet,1987,209 :481-488. TanakaS, Matsushita Y, Yoshikawa A, Isono K. Cloning and molecular characterizationof the gene rimL which encodes an enzyme acetylating ribosomal protein L12 ofEscherichia coli K12.Mol Gen Genet，1989，217，289-293·)。此外，根据生物信息学分析，大肠杆菌基因组 中一些未知功能基因可能也具有乙酰转移酶活性。现有的研究表明，与真核细胞的NATs 不同，原核细胞的NATs可能只需要一种亚基蛋白组成。2005年Vetting等报道鼠伤寒沙 门氏菌的RimL具有二聚体结构，并可在体外对其底物进行乙酰化修饰反应(Vetting MW, de Carvalho LPS, Roderick SL, andBlanchard JS. A Novel Dimeric Structure of the RimL Na-acetyltransferase fromSalmonella typhimurium. J Biol Chem,2005,280(23) 22108-22114)。根据晶体结构及计算机模拟结果，显示原核生物的NATs不同于真核生物 NATs，推测只能催化一种蛋白底物。最近文献报道来自嗜盐古细菌的乙酰化酶具有多种 底物(Dale Τ. Mackay, Catherine H. Botting, Garry L. Taylor and Malcolm F. White. An acetylasewith relaxed specificity catalyses protein N-terminal acetylation inSulfolobus solfataricus. Molecular Microbiology, 2007，64 :1540-1548)。我们最新 研究结果发现，RimJ可以催化T α 1的乙酰化，但不能使T β 4乙酰化(Fang，H.，Zhang, X.， Shen, L. , Si, X. , Ren, Y. , Dai, H. , Li, S. , Zhou, C. , Chen, H. , 2009. RimJ is responsible for Na-acetylation of thymosin α 1 in Escherichia coli. Appl.Microbiol. Biotechnol. 84,99-104) 从进化关系看，古细菌更接近于真核生物(图1)，我们推测该细 菌的乙酰化酶可以催化来自真核生物的多肽的N-末端乙酰化修饰。将该酶基因与胸腺素 基因共表达，结果显示T α 1和T β 4在工程菌体内获得了乙酰化修饰。

发明内容
本发明的目的是提供一种能产生N-末端乙酰化的蛋白质或多肽的方法及其专用 工程菌。本发明所提供的产生N-末端乙酰化的蛋白质或多肽的专用重组工程菌，是将表 达来自古生菌的乙酰化酶的表达盒整合到宿主菌染色体上，得到在染色体上表达古生菌乙 酰化酶的重组菌。所述古生菌的乙酰化酶可来自Sulfolobus solfataricus, Sulfolobus tokodaii, Sulfolobus acidocaldarius, Metallosphaera sedula, Hyperthermus butylicus, Pyrobaculum arsenaticum, Pyrobaculum islandicum, Pyrobaculum calidifontis, Caldivirga maquilingensis 等■生物。 /[尤 ife Jfe 自 Sulfolobus solfataricus, Sulfolobustokodaii, Sulfolobus acidocaldarius。 M it ife 自 Sulfolobus solfataricus。所述乙酰化酶氨基酸序列如序列表中序列2所示或与它具有80%以上的同源性， 并不影响其活性。所述表达乙酰化酶的表达盒包括启动子和连接于启动子下游的编码古生菌乙酰 化酶的结构基因以及终止子序列，其中编码古生菌乙酰化酶的结构基因的序列为与序列表 中序列1自5'端第4-501位核苷酸序列具有80%以上的同源性的核苷酸序列，优选为序 列表中序列1自5'端第4-501位核苷酸序列所示的核苷酸序列。所述宿主菌为大肠杆菌，优选为大肠杆菌BL21 (DE3)。所述表达乙酰化酶的表达盒中，所述启动子可以采用组成型启动子、热诱导型启 动子、或化学诱导型启动子，优选采用T7启动子；T7启动子可进行高效可控表达。所述表达乙酰化酶的表达盒中还可以包括筛选标记基因，如卡那霉素抗性基因， 便于筛选。本发明所提供的制备N-末端乙酰化多肽或蛋白的方法，是将表达目的多肽或蛋 白的载体转入所述的重组工程菌中诱导表达，得到N-末端乙酰化多肽或蛋白。所述方法中，所述表达目的多肽或蛋白的载体中含有表达所述多肽或蛋白的表达 盒，所述表达盒中含有启动子和所述多肽或蛋白的编码基因，所述启动子可以采用组成型 启动子、热诱导型启动子、或化学诱导型启动子，优选采用T7启动子。上述方法适用于制备多种N-末端乙酰化多肽或蛋白，如制备N-末端乙酰化胸腺 素，是构建胸腺素的表达载体。可以将胸腺素与内含肽融合表达，即是将表达胸腺素融合蛋 白的载体转入上述的重组工程菌中诱导表达，得到N-末端乙酰化胸腺素融合蛋白。N-末端 乙酰化胸腺素融合蛋白可以通过温度诱导切割、DTT或巯基乙醇诱导切割、Cys诱导切割。 温度诱导切割可以避免添加一些试剂增加成本。DTT或巯基乙醇诱导效率高，可以获得具有 完整结构的N-末端乙酰化胸腺素(Ta 1和Τβ4，氨基酸序列为自序列表中序列7的氨基端 第2-44位氨基酸残基序列或者自序列表中序列5的氨基端第2-29位氨基酸残基序列)。 用Cys诱导切割，可以在T a 1和T β 4的C端增加一个Cys残基，便于进行化学修饰，改善 Ta 1和Τβ 4的性质，如延长体内半衰期等。融合蛋白及胸腺素的纯化可以通过亲和层析、离子交换、疏水层析、反相层析等方 法。
本发明构建可以乙酰化修饰多种多肽的大肠杆菌宿主。人工合成了来自嗜盐古细 菌Sulfolobus solfataricus的乙酰化酶基因，并通过质粒转入大肠杆菌细胞内，或利用重 组技术将该基因整合到大肠杆菌的染色体上获得了本发明的工程菌。该酶基因可以通过诱 导表达，或组成性表达，从而使目的多肽获得乙酰化修饰。用本发明工程菌可以直接获得完全N-末端乙酰化的蛋白或者多肽，如胸腺素α 1 和胸腺素β 4，克服了传统基因工程技术中不能乙酰化或仅部分乙酰化的缺点，彻底实现了 通过基因工程技术获得N-末端乙酰化胸腺素，具有很强的实际用途。实验证明，用本发明工程菌制备得到的Τα 1和Τβ 4，全部是N-末端乙酰化的，克 服了传统技术中不能N-末端乙酰化、部分N-末端乙酰化、乙酰化效率不高的缺点，彻底的 实现了通过基因工程技术获得N-末端乙酰化胸腺素。因此，本发明工程菌及方法在制备 N-末端乙酰化胸腺素领域具有广阔的应用前景，并有可能用于其他需要进行乙酰化修饰多 肽的表达和制备。


图1生命系统的三界
图2辅助质粒pKDS
图3含有Spl Intein基因的质粒
图4 Ardl在质粒上的表达
图5一步法染色体整合过程示意图
图6染色体整合打靶质粒
图7 Ardl染色体整合PCR鉴定
图8 Ardl在染色体上整合表达
图9融合蛋白AS的表达
图10重组T α 1的纯化
图11重组Tdl的分子量测定
图12化学合成T α 1 (日达仙)的分子量测定
图13重组Ta 1的一级序列测定结果
图14融合蛋白BS的表达
图15重组Τβ 4的纯化
图16重组Τβ 4的分子量测定
图17重组Τβ 4的N端序列测定
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的酶试剂均购自TaKaRa公司。实施例1、表达嗜盐古细菌的乙酰化酶的大肠杆菌宿主构建1、嗜盐古细菌的乙酰化酶ssArdl基因设计与合成根据文献报道的氨基酸序列(DaleΤ. Mackay, Catherine H. Botting,Garry L.Taylor and Malcolm F. White. An acetylase with relaxed specificity catalysesprotein N—terminal acetylation in Sulfolobus solfataricus. MolecularMicrobiology, 2007,64 1540-1548)及大肠杆菌基因密码子的偏嗜性，设计了 如下基因序列并送上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成的ssArdl基因序列，在 两侧分别增加了 NdeI和HindIII酶切位点，具体序列如序列1所示(序列表中序列1的 5'端第4-501位核苷酸序列为编码序列)，其编码的氨基酸序列如序列表中序列2所示。 该合成基因克隆在质粒PGH-X047G (上海生工生物工程技术服务有限公司)上(图3)。2、表达载体构建及表达用NdeI和HindIII (购自宝生物工程(大连)有限公司)双酶切将上述基因从载 体pGH-X047G上切下，然后连接到pET22b载体(购自Novagen公司，目录号69337-3)的 NdeI和HindIII酶切位点之间，转化大肠杆菌DH5 α，筛选得到阳性克隆，再进行测序鉴定， 得到表达ssArdl的载体pET-ssArdl。为了今后与目的多肽基因共表达，用NdeI和XhoI双酶切(购自宝生物工程(大 连)有限公司)pET-ssArdl回收ssArdl片段，用NdeI和XhoI双酶切载体pACYCDuet-1 (购 自Novagen公司，目录号71147-3)，连接，转化大肠杆菌DH5 α，筛选得到阳性克隆，再进行 测序鉴定，获得表达ssArdl的载体pACYC-ssArdl (该质粒与pET系列载体可共存于细胞 内)，在此载体上ssArdl基因的表达也是由T7启动子控制。将载体pACYC-ssArdl转化表达宿主大肠杆菌BL21 (DE3)，筛选，得到表达ssArdl 的工程菌。首先挑取单菌落接入含有25mg/L氯霉素的2ml LB培养基(酵母粉5g/L，蛋 白胨10g/L，氯化钠10g/L ；pH 7. 0)中，30°C培养12小时(未诱导)。然后转接到50ml的 含有25mg/L氯霉素的FML培养基中(酵母粉12g/L，蛋白胨15g/L，Na2HPO4 · 2H203g/L, KH2PO4 ·3Η20 7g/L, NaCl 2. 5g/L，0. 2% 葡萄糖，2mM 乳糖，0. 05% MgSO4 · 7H20)于 37°C振荡 培养10小时(诱导)，取样进行SDS-PAGE分析，有目的蛋白表达(图4)。图4中，M为分 子量Marker，LB为未诱导全菌蛋白电泳，FML为诱导表达后的全菌蛋白电泳。3、整合载体 pBRSS-LPLR-Kan-Ardl 的构建3. 1 构建 pBRS(1)以pBR322(宝生物工程(大连)有限公司)为模板，PBR5/PBR3为引物，PCR 扩增包含Tet基因和复制子的PBR322骨架，得PBR。(2)EcoRI/XhoI 双酶切 PBR 回收 3000bp 左右片段 I，(3)合成的下列片段(上海生工生物工程有限公司合成)5 ’ -gGAATTCATATGCCCTTTAGGGATAACAGGGTAATGCGGCCGCATGCAGGAGCGATCCTCCTGCAT AC-3'5 ’ -ccgCTCGAGGATTGCCTTATTACCCTGTTATCCCTAACGCGTATGCAGGAGGATCG-3’将两片段等摩尔混合，变性退火延伸，条件94°C，30s ；50°C, 30s ；72°C，延伸10s。 反应30循环；胶回收约IOObp处条带。用EcoRI/XhoI双酶切并回收IOObp片段II。(4)将⑵得到的片段I和(3)得到的片段II连接，转化，挑选转化子，直接通过 测序得到阳性克隆，命名为PBRS。3. 2 构建 pBRSS(1)以枯草芽孢杆菌基因组(1. 1391，中国普通微生物菌种保藏管理中心)为模板，SP5/SP3为引物，PCR扩增sacB基因。SP5和SP3弓丨物序列为SP5 :5’ -CCGGAATTCTAGTTCTTTAGGCCCGTA-3，SP3 5' -TGCTCTAGATATGGGATTCACCTTTATG-3'PCR反应体系为=IOXTransHiFi Buffer 5 μ l，dNTP 4μ 1,SP51 μ 1，SP3 1 μ 1，枯 草芽孢杆菌基因组 0. 5 μ 1，TransHiFi DNA polymerase 0· 5 μ 1，ddH20 38 μ 1。PCR 反应条件94°C，30s ;60°C—55°C，30s。72°C，延伸 2min，反应 10 个循环每 个循环退火温度降0. 5 °C，94°C，30s ;55 °C，30s。72 °C，延伸2min，反应20循环；72 V延伸 300s，4°C，10h。胶回收 2000bp 处条带。(2)使用EcoRI/Xbal双酶切载体pBRS和sacB基因，两者连接后转化大肠杆菌 DH5a感受态细胞。(3)以SP5/SP3为引物，PCR鉴定阳性重组；PCR鉴定正确后，使用含有5%蔗糖的 固体LB平板验证sacB功能。在含有蔗糖固体LB平板上不长的菌落为所需菌落。成功构 建质粒pBRSS。3. 3 构建 pBRSS-LPLR(1)以大肠杆菌BL21(DE3)基因组为模板，以PL-1/PL-2为引物扩增L，以PL-3/ PL-4为引物扩增R ；以L，R为模板，以PL-1/PL-4为引物扩增得LR片段。引物序列如下PL-I :5’ -GGCCATGATTGGCGTAGATTACCTG-3，PL-2 :5’ -TACGAGAGCGGCCGCGTGTCTAGAAATCCAGCCGTATAAGCG-3，PL-3 :5’ -TAGACACGCGGCCGCTCTCGTAGCTTTTCCAGTTTCGGATAAGG-3’PL-4 :5’ -CGCGACACCTGGGAAGTGTCTCG-3’(2)用T4DNA聚合酶和dTTP处理LR片段，然后电泳回收。T4DNA聚合酶反应体系LR片段 10μ 1,10ΧΤ4 DNA polymerase buffer 2μ 1，BSA 2 μ 1，T4DNA polymerase 1 μ 1，IOOmMdATP 0. 5μ 1, ddH20 4. 5 μ 1, ,g、体禾只 20 μ 1。以上反应体系37°C反应30min后，直接纯化回收DNA片段。(3)用Notl/Mlul双酶切载体pBRSS，然后电泳回收。(4)连接pBRSS与LR并转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞。用PBR+/PBR-为引物， 菌液PCR筛选阳性重组子，测序正确后得到pBRSS-LPLR。引物序列如下PBR+:5，-GTGGAACGAAAACTCACGT-3，PBR-:5，-GTTAGATTTCATACACGGTG-3，3. 4 构建 pBRSS-LPLR-Kan-Ardl(1)以pET-ssArdl为模板，以P5/P6为引物扩增得ssArdl表达盒片段。引物序列如下P5 :5’ -AGACACGCGGCCTCCCGCGAAATTAATACGAC-3，AR3 :5’ -CGGATATAGTTCCTCCTTTC-3’PCR反应体系如下10XTransHiFi Buffer 5 μ l,dNTP 4μ1，Ρ5 1 μ 1,AR3 1 μ 1, SSARDl 0. 5μ 1, TransHiFi DNA polymerase 0. 5μ 1, Ckffl2O 38 μ 1。
PCR 反应条件94°C，30s ;60°C—55°C，30s。72°C，延伸 lmin，反应 10 个循环每 个循环退火温度降0. 5°C，94°C，30s ；55°C，30s。72°C，延伸lmin，反应20循环；72°C延伸 300s，4°C，10h。胶回收 800bp 处条带。(2)以pET_28a(购自北京欣经科生物技术有限公司)为模板，KN5/KN3为引物， PCR扩增Kan基因表达盒。PCR 反应体系如下10 X TransHiFi Buffer 5 μ 1，dNTP 4 μ 1，KN5 1 μ 1，ΚΝ3 1 μ 1，PET-28a 0. 5μ 1, TransHiFi DNA polymerase 0. 5μ 1, ddH20 38 μ 1。PCR 反应条件94°C，30s ;60°C—55°C，30s。72°C，延伸 lmin，反应 10 个循环每 个循环退火温度降0. 5°C，94°C，30s ；55°C，30s。72°C，延伸lmin，反应20循环；72°C延伸 300s，4°C，10h。胶回收 IOOObp 处条带。引物序列如下KN5 :5’ -GAAAGGAGGAACTATATCCGCAGCAGATTACGCGCAG-3，KN3 :5’ -ACGAGAGCGGCCTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAG-3，(3)以(1)和⑵得到的片段为模板，P5/KN3为引物，PCR扩增得到融合片段 Kan-Ardl。PCR 反应体系10 X TransHiFi Buffer 5 μ 1，dNTP 4 μ 1，P51 μ 1，KN3 1 μ 1，Kan 0. 5μ 1, ssArdl 0. 5μ 1, TransHiFi DNA polymerase 0. 5μ 1, Ckffl2O 37. 5 μ 1。PCR 反应条件94°C，30s ;60°C—55°C，30s。72°C，延伸 2min，反应 10 个循环每 个循环退火温度降0. 5°C，94°C，30s ；55°C，30s。72°C，延伸2min，反应20循环；72°C延伸 300s，4°C，10h。胶回收 2000bp 处条带。(4)用T4DNA聚合酶和dATP处理融合片段Kan-Ardl。T4DNA 聚合 Sl 反应体系=Kan-Ardl 10 μ 1,10ΧΤ4 DNA polymerase buffer 2μ 1, BSA 2 μ 1，Τ4 DNA polymerase 1 μ 1，IOOmMdATP 0· 5 μ 1，ddH20 4. 5 μ 1，总体积 20 μ 1。以上反应体系37°C反应30min后，直接纯化回收DNA片段。(5)使用NotI单酶切pBRSS-LPLR胶回收后，再用T4DNA聚合酶和dTTP处理；酶切反应体系pBRSS-LPLR8μ 1, IOXH buffer 2 μ 1, BSA 2 μ 1, NotI 1 μ 1, ddH20 7 μ 1。以上体系在37°C下反应过夜，琼脂糖凝胶电泳回收5000bp酶切片段。T4DNA 聚合酶反应体系pBRSS-LPLR (NotI 切)8 μ 1，10 X T4 DNA polymerasebuffer 2 μ 1，BSA 2μ 1，Τ4 DNA polymerase 1 μ 1,IOOmMdTTP 0·5 μ 1，ddH20 6. 5 μ 1，总体积20 μ 1。以上反应体系37°C反应30min后，直接纯化回收。(6)将步骤(4)和(5)得到的片段连接，然后转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞。直 接在含有25mg/L的卡那霉素固体LB平板上筛选阳性克隆，并以P5/KN3为引物进行PCR验 证，然后用通用引物T7和T7t引物对阳性克隆进行测序，表明ssArdl基因序列及其表达控 制序列完全正确。至此，完成载体pBRSS-LPLR-Kan-Ardl (图6)构建。4、ssArdl在染色体上整合表达应用本实验室建立的一步法(图5)将ssArdl基因及其表达调控元件整合到大肠 杆菌染色体上(周军智等.大肠杆菌PtsHIcn 操纵子的快速敲除及敲除菌生长性能测定， 微生物学通报，2010，37 1146-1152)。具体方法如下所述首先，应用常规酶切连接方法按步骤3构建如图6所示的染色体整合打靶质粒pBRSS-LPLR-KanArdl (图 6)。低拷贝pKDS质粒(图2)含有exo、bet、gam以及归巢内切酶I-Sce I基因，均受 阿拉伯糖启动子控制(见周军智等.大肠杆菌PtsHIcn 操纵子的快速敲除及敲除菌生长 性能测定，微生物学通报，2010，37 1146-1152)(中国人民解放军军事医学科学院生物工 程研究所)。然后将打靶质粒PBRSS-LPLR-KanArdl和辅助质粒pKDS共同转化到大肠杆菌 BL21 (DE3)中，将转化子在25mg/L氯霉素和卡那霉素双抗平板上培养，挑取单菌落，接种到 5ml氯霉素和卡那霉素双抗液体LB培养基中，过夜培养。次日，取500 μ 1共转菌菌液接种 到50ml含有25mg/L氯霉素的LB中，200rpm 30°C培养到OD600 ^ 0. 4。加入终浓度0. 2% L-阿拉伯糖诱导，诱导5h后，取菌液200 μ 1，涂布Kan/蔗糖平板(含有25mg/L卡那霉素 和5%蔗糖的固体LB平板)。37°C过夜培养。在Kan/蔗糖平板只长出1个单菌落。菌液PCR鉴定从Kan/蔗糖平板上挑取单菌落到LB无抗培养基中，培养4_5h 后，以菌液为模板，PL-7/PLlpxmR为引物，PCR鉴定。阳性重组菌应为4000bp，非重组 菌为3000bp。PCR验证正确后(图7，图7中样品是阳性重组菌，阳性对照是打靶质粒 pBRSS-LPLR-KanArdl,阴性对照是未重组的大肠杆菌BL21 (DE3))，进行测序，得到含有辅助 质粒的BL21 (DE3) IpxM: :Kan-Ardl。将该菌株涂布四环素抗性平板，不能生长，说明打靶质 粒已不存在。引物 PL-7 5，AGACATTAAGACTGCGGCGT 3，引物 PLlpxmR 5，ACTCTCCTGGACATTAACCG 3，辅助质粒剔除取50 μ 1含有辅助质粒的BL21 (DE3) IpxM: Kan-Ardl菌液接种到 5ml含有25mg/L卡那霉素液体LB培养基中，42°C过夜培养。次日将过夜菌稀释到10_6，涂 布含有25mg/L卡那霉素的固体LB平板，37°C温孵过夜。次日，挑取卡那霉素平板生长的单 菌落到卡那霉素液体LB培养基中，培养4-5h后，将菌液编号，对应点到含有25mg/L氯霉素 的固体LB平板，不能在氯霉素平板生长的菌株为辅助质粒pKDS丢失株，保存该菌种，得到 去除辅助质粒的菌株BL21 (DE3) IpxM: Kan-Ardl。诱导表达ssArdl 将去除辅助质粒的BL21 (DE3) IpxM: :Kan_Ardl在卡那霉素平 板上划线，37°C温孵12h，次日挑取单菌落到5ml液体LB培养基中，37°C震荡培养过夜。取 50 μ 1过夜培养菌液分别接种到2只试管中，每管含有5ml液体LB培养基。37°C震荡培养 到OD6qq^ 0.4，一支试管加入终浓度0.5mmol IPTG诱导，另一支作为对照。诱导6h后，以 诱导前样品为对照，进行SDS-PAGE分析，结果表明有ssArdl表达(图8)。至此，我们获得了在染色体上表达ssArdl的大肠杆菌BL21 (DE3) IpxM: Kan-Ardl，简称 BDArd。实施例2、重组N-末端乙酰化T α 1的制备Τα 1分子量较小，难以在细胞内直接表达，需要与其它蛋白基因融合表达。为获得 完整结构的Ta 1，需要对融合蛋白进行切割。切割方法可采用酶裂解法、化学裂解法，以及 内含肽介导的切割方法。本实施例介绍利用内含肽切割获得N-末端乙酰化修饰的胸腺素 Tal01、表达Ta 1与内含肽的融合蛋白工程菌I的构建编码Spl DnaX内含肽的基因序列如序列表中序列3所示，由上海生工生物工程技
11术服务有限公司合成。用限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切上述编码Spl DnaX内含肽的基因，再用 限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切pET22b载体(购自Novagen公司，目录号69337-3) 回收载体片段，与切上述编码Spl DnaX内含肽连接，获得重组载体，将鉴定正确的含有Spl DnaX内含肽的编码基因的重组载体命名为pET-S。设计两条寡核苷酸片段TA和TAS，如下所示TA :5，-GM TTC CAT ATG TCA GAT GCA GCA GTA GAT ACT AGC TCT GM ATC ACTACC AAA GAC CTG AAG GAG AAG AAG-3'TAS 5' -GCT GCT ACT TAA GCA GTT CTC AGC CTC TTC GAC AAC TTC CTT CTT CTCCTT CAG GTC-3，将两条片段通过自身退火延伸得到约IOObp的产物，将其用NdeI和Afl II双酶 切后插入到PET-S的酶切位点之间，从而获得表达T α 1与Spl内含肽融合蛋白AS (AS氨基 酸序列如序列表中序列5所示，编码AS的基因序列如序列表中序列4所示)的载体，将鉴 定正确的载体命名为pET-AS。TA和TAS的自身退火延伸反应条件如下反应体系(总体积 50μ L) :10XPyrobest Buffer 5μ L ；dNTP 4 μ L ；PrimerTA 1 μ L ；Primer TAS 1 μ L ；Pyrobest DNA Polymerase 0. 3 μ L ；ddH20 38. 7 μ L0PCR反应条件先95°C预变性5min ；再94°C变性30sec，56°C退火30sec，72°C延伸 lOsec，反应30个循环，最后72°C延伸lOmin。构建工程菌I 将表达载体pET-AS转化到大肠杆菌BDArd中，在添加终浓度 100mg/L氨苄青霉素LB平板上筛选，并经过PCR检测和测序鉴定，得到含有pET_AS的工程 菌I，即BDArd/pET-AS。这样，在工程菌I内AS(位于质粒上)和ssArdl (位于染色体上) 的表达都由T7启动子控制，可以用IPTG诱导同时表达。2、工程菌I发酵培养及重组T α 1的纯化与鉴定摇瓶发酵将工程菌BDArd/pET-AS接入添加终浓度100mg/L氨苄青霉素的2mlLB 培养基(酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L;pH 7.0)中，30°C培养12小时。然后转 接到50ml的相同培养基中，30°C振荡培养10小时，作为种子。将种子接入1升FML培养基 中(酵母粉 12g/L，蛋白胨 15g/L，Na2HPO4 · 2H20 3g/L，KH2PO4 · 3H207g/L，NaCl 2. 5g/L，葡 萄糖2g/L，2mM乳糖，MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，lOOmg/L氨苄青霉素)，37°C振荡诱导培养10小 时(振荡速度为250rpm/min)，离心，收集菌体。对全菌蛋白进行SDS-PAGE分析，以未诱导 培养的菌体为对照，结果表明，诱导培养后AS有表达(图9中箭头示)。分离纯化1)镍柱亲和层析取IL诱导培养发酵液所得的BDArd/pET-AS菌体(湿重约IOg)，加入200ml镍柱 亲和层析A缓冲液(50mM磷酸盐、0. 5M NaClUOOmM咪唑、ρΗ7. 0)，混勻后超声破菌30min， 离心(12000r/min，4°C，30min)，收集上清，在上清中加入终浓度为1 %的曲拉通-100，将上 清液首先用0. 8 μ m的滤膜过滤，再用0. 45 μ m的滤膜过滤后上样镍柱(已经用A液平衡)， 上样后，用镍柱亲和层析B缓冲液(50mM磷酸盐、0. 5M NaCl、20mM咪唑、10%甘油、pH7. 0) 漂洗，最终用镍柱亲和层析的C缓冲液(50mM磷酸盐、0. 5M NaCl、400mM咪唑、ρΗ7. 0)直接
12洗脱，收集洗脱峰。2)切割在经镍柱亲和层析后所得到的AS融合蛋白溶液中添加终浓度为300mM的β -巯 基乙醇，放置在42°C水浴中温育切割24h。3)疏水层析在经过诱导切割的蛋白溶液中加入等量的初浓度为2M的(NH4)2SO4溶液，使溶液 中所含的(NH4)2SO4浓度为1M，用0. 22 μ m的滤膜过滤后上样Phenyl Sepharose 6FastFlow column (high sub) (GE Healthcare)柱进行疏水层析，该柱子已经用疏水层析平衡液 D(50mM磷酸盐，lM(NH4)2S04，pH7. 0)平衡，进行疏水层析，根据先前预实验结果，目的蛋白在 穿过峰中，收集穿过液。4)反相层析经过疏水层析的蛋白溶液再进行反相层析，上样反相柱S0RCE30 RPC column (GEHealthcare)后用E液平衡(0. 1 %磷酸)，再用F液(0. 1 %磷酸，25 %乙腈)进 行梯度洗脱，洗脱条件为4ml/min，0 100% F，100ml，分管收集，每管10ml，将收集到的目 的蛋白管混合。5)离子交换层析将反相层析所得到的含有目的蛋白的样品管混合后，调节PH至7.0，上样 QSepharose Fast Flow column (GE Healthcare)柱，进行阴离子交换层析，平衡液 G (50mM 磷酸酸盐，PH7.0)，洗脱液为H(G+1M NaCl, pH7.0)，洗脱条件为:4ml/min，0 100 % G, 100ml，分管收集。每管10ml，将收集到的目的蛋白管混合。各步骤样品SDS-PAGE分析结果如图10所示，表明通过上述步骤后可以获得比较 纯的重组T α 1。6)反相-高效液相色谱(RP-HPLC)分析目的蛋白T α 1得率与纯度反相-高效液相系统大连依利特分析仪器有限公司柱填料=Hypersil300Α C18 5 μ m在分析了系统适应性及重复性的基础上利用该系统及柱填料对本研究所得到的 Tal进行得率及纯度分析洗脱程序为
权利要求
重组工程菌，是将表达古生菌的乙酰化酶的表达盒整合到宿主菌染色体上，得到在染色体上表达古生菌的乙酰化酶的重组菌。
2.根据权利要求1所述的重组工程菌，其特征在于所述宿主菌为大肠杆菌。
3.根据权利要求1或2所述的重组工程菌，其特征在于所述古生菌为 Sulfolobussolfataricus, Sulfolobus tokodaii, Sulfolobus acidocaldarius, Metallosphaerasedula, Hyperthermus butylicus， Pyrobaculum arsenaticum， Pyrobaculum islandicum,Pyrobaculum calidifontis，或aldivirga maquilingensis ；优 选为 Sulfolobussolfataricus, Sulfolobus tokodaii 或 Sulfolobus acidocaldarius, ^ 优选为 Sulfolobussolfataricus。
4.根据权利要求3所述的重组工程菌，其特征在于所述古生菌的乙酰化酶的氨基酸 序列为与序列表中序列2具有80%以上的同源性的氨基酸序列；优选为序列表中序列2所 示的氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的重组工程菌，其特征在于所述编码古生菌乙酰化酶的结构 基因的序列为与序列表中序列1的5'端第4-501位核苷酸序列具有80%以上的同源性的 核苷酸序列，优选为序列表中序列1的5'端第4-501位核苷酸序列所示的核苷酸序列。
6.一种制备N-末端乙酰化多肽或蛋白的方法，是将表达目的多肽或蛋白的载体转入 权利要求1-5中任意一项所述的重组工程菌中诱导表达，得到N-末端乙酰化多肽或蛋白。
7.一种制备N-末端乙酰化胸腺素的方法，是将表达胸腺素融合蛋白的载体转入权利 要求1-5中任意一项所述的重组工程菌中诱导表达，得到N-末端乙酰化胸腺素融合蛋白。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述胸腺素融合蛋白的氨基酸序列为序 列表中序列5或者序列表中序列7。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述胸腺素融合蛋白的编码基因的核苷 酸序列为序列表中序列4或者序列表中序列6。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述方法中还包括将诱导表达获得的 N-末端乙酰化胸腺素融合蛋白进行切割获得N-末端乙酰化胸腺素；所述N-末端乙酰化胸 腺素的氨基酸序列为自序列表中序列7的氨基端第2-44位氨基酸残基序列或者自序列表 中序列5的氨基端第2-29位氨基酸残基序列。
全文摘要
本发明公开了一种能产生N-末端乙酰化的蛋白质或多肽的方法及其专用工程菌。该重组工程菌，是将表达来自古细菌的乙酰化酶的表达盒整合到宿主菌染色体上，得到在染色体上表达古细菌乙酰化酶的重组菌；所述表达古细菌乙酰化酶的表达盒包括启动子和连接于启动子下游的古细菌乙酰化酶基因；所述古细菌乙酰化酶基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。用本发明工程菌可以直接获得完全N-末端乙酰化的蛋白或者多肽，如胸腺素α1和胸腺素β4，克服了传统基因工程技术中不能乙酰化或仅部分乙酰化的缺点，彻底实现了通过基因工程技术获得N-末端乙酰化胸腺素，具有很强的实际用途。
文档编号C12N15/70GK101979505SQ20101052184
公开日2011年2月23日 申请日期2010年10月21日 优先权日2010年10月21日
发明者任元涛, 司信喜, 周长林, 孙旭, 戴红梅, 方宏清, 李树龙, 陈惠鹏 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所