专利名称：一种定量检测微囊藻的方法及其专用标准品的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种定量检测微囊藻的方法及其专用标准品。
背景技术：
由于大量氮、磷等污染物排放到水环境中，水体富营养化已成为全球公共卫生问 题，其直接后果是湖泊、水库等缓流水体形成大面积蓝藻水华。我国一些重要的淡水湖泊如 太湖、巢湖和滇池等每年都有不同程度的蓝藻水华爆发，其优势种主要是微囊藻。蓝藻水华 的大面积爆发，极大地危害水体生态系统的结构和功能，其最主要危害之一就是产生和释 放以微囊藻毒素为主要类型的蓝藻毒素。微囊藻属蓝藻门蓝藻纲色球藻目色球藻科，是我国很多淡水湖泊和水库富营养 化水体中的优势藻类。微囊藻毒素(Microcystins，简称MCs)是由在水体中生长并能形 成水华的几种蓝藻(blue-green algae，亦称为蓝细菌(cyanobacteria))，尤其是微囊藻 (Microcystis)产生的一类藻类毒素。微囊藻毒素是一种肝毒素，长期饮用含有微囊藻毒素 的水，会引发肝损伤甚至肝癌。因此，快速准确地检测水环境中的微囊藻，对于有效预警蓝 藻水华大规模爆发、保障水环境安全具有重要意义。目前，对微囊藻的鉴定方法主要是物理方法和分子生物学方法。1.物理学方法微囊藻鉴定的传统方法是物理方法，其原理是根据不同类的藻都有表明其身分的 特征，如形态学上的差别，色素、色素体、贮藏物质等的差别等等。微囊藻的物理方法分辨主 要是根据形态上的空间布局和群体的构型不同。目前从传统的碘量法发展了很多种方法。(1)离心沉降法取一定量的水样，离心去除上请液，收集藻体，加入少量生理盐 水混勻，用于下一步镜检。该方法快速，可在30min内检测到结果；由于活藻体，色素体等细 胞结构没有破坏，易鉴定，显微图像清晰；所需水样品量少(50 IOOmL)，且不需用化学药 品等(高锡伦，邱俊铎，马宜山.单细胞藻类的两种简易分离法.水产养殖，1992，(2) :9 10.)。(2)显微彩色图像识别法将制备的样本标明藻类的种类和数量后，在高倍显微 镜下，通过CCD摄像将获取的模拟图像信号输入图像采集卡中，并转换成数字图像，将待测 样品的特征信息与计算机中的图像信息进行对比(聂晶晶，李元，杨良.水华微囊藻鉴定技 术研究进展.环境科学导刊.2008，27 (5) :1-5;高建峰，翁天楚，陈琼洁.离心沉降法检测 水中藻类技术.西南给排水，2006，28 (2) :1-4)。该方法自动化程度高，克服了肉眼主观观 察引起的误差。上述方法耗时长、劳动强度大、效率低、需要丰富的经验，非专业人员无法从事；并 且环境对藻类的形态有很大的影响，鉴定出具体的种存在的困难较多，都需要从分子上找 出直接的证据以鉴别。2.分子生物学方法用分子生物学技术对藻类进行鉴定和检测是目前的研究热点之一，这种方法可能重建或证实基于形态学和生理学特征的分类和检测。NUbel等(1999)对底栖蓝细菌和硅 藻的分布进行了研究，发现用16S rRNA基因分析的累积数量是形态学分析的2倍。这说明 了一些形态学相似的类群通过16S rRNA分析可能呈现不同的基因型。研究发现，16S rRNA 能够较好的区别相同属内种间的株系，但对于种以下的株系则显出分辨率不足的缺陷，能 更准确地检测出特定种型的藻。聚合酶链反应(Polymerase chain reaction, PCR)技术在藻的分类和检测中应 用最为广泛，在普通PCR技术的基础上，经历了从相对定量到绝对定量的过渡，发展了定量 PCR(quantitative PCR)技术实时定量PCR(Real-Time Quantitative PCR)技术是Holland 等在1991年最先提出。该方法实现了 PCR从定性到定量质的飞跃，且具有引物和探针的双 重特异性，且在全封闭的状态下实现扩增及产物分析，结果稳定，可重复性好，同时还有效 减少了污染及对人体的危害，在大批量标本检测中能有效减少劳动量，成为分子生物学和 分子诊断的重要技术平台，广泛应用于环境样品中微生物的检测及研究中。由于定量PCR具有快速、灵敏的优点，因此，可以应用此技术可用于快速检测水环 境中少量的微囊藻，为快速预警提供技术支持。近年一些研究者已经采用real-timePCR技 术检测来水环境中的微囊藻，该技术的关键是对水环境中的微囊藻进行准确定量，其中不 同外标准品的构建成为研究的关键技术。一个单细胞的微囊藻，只含有一个16S基因。有研究表明，在实验室条件下培养的 微囊藻，藻细胞数与16S rRNA基因数一致。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测样品中微囊藻的标准品。本发明提供的检测样品中微囊藻的标准品，为含有16S rRNA基因的重组质粒或重 组菌或重组细胞；所述16S rRNA基因的序列是序列表中的序列1。序列表中的序列1有396个脱氧核糖核苷酸组成。所述重组质粒中的出发质粒是pMD-18T。本发明的另一个目的是提供检测样品中微囊藻的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤1)以重组质粒或重组菌或重组细胞为标准品模板，用PCR扩增的体系进行实时荧 光定量PCR扩增，建立标准品的浓度与临界循环数对应的一元线性回归曲线，即得到标准 曲线；2)用待测样品替换步骤1)中的标准品，进行实时荧光定量PCR扩增，根据扩增结 果的临界循环数和标准曲线，得到待测样品中16S rRNA基因的数量，即得到待测样品中微
囊藻的数量；所述PCR扩增的体系由实时荧光定量PCR扩增缓冲液、引物对和模板组成；所述引 物对中的各引物在体系中的浓度均为0. 1 μ mol/L，所述引物对中的一条引物为序列表中的 序列2，另一条引物为序列表中的序列3。所述标准品模板在所述PCR扩增的体系中的浓度为1. IXlO1拷贝/yL、l. IXlO2 拷贝 / μ L、1. 1 X IO3 拷贝 / μ L、1. 1 X IO4 拷贝 / μ L、1. 1 X IO5 拷贝 / μ L、1. 1 X IO6 拷贝 / μ LU. lX10l#W/yL、l. 1X IO8 拷贝 / μ L 或 1. IX IO9 拷贝 /yL。
所述PCR反应中的退火温度为59°C。所述重组质粒或重组菌或重组细胞为含有16S rRNA基因的重组质粒或重组菌或 重组细胞；所述16S rRNA基因的序列是序列表中的序列1。所述重组质粒中的出发质粒是pMD-18T。本发明的第三个目的是提供一种检测微囊藻的试剂盒。本发明提供的检测微囊藻的试剂盒，包括引物对，所述引物对中的一条引物为序 列表中的序列2，另一条引物为序列表中的序列3。本发明的第四个目的是提供一种PCR试剂。本发明提供的PCR试剂，包括实时荧光定量PCR扩增缓冲液、引物对；所述引物对 中各每个引物在试剂中的浓度均为0. 1 μ mol/L，所述引物对中的一条引物为序列表中的序 列2，另一条引物为序列表中的序列3。16S rRNA基因、引物对、重组质粒或重组细胞在检测样品中微囊藻中的应用也是 本发明保护的范围；所述16S rRNA基因的序列是序列表中的序列1 ；所述引物对中的一条引物为序列表中的序列2，另一条引物为序列表中的序列3 ；所述重组质粒或重组菌或重组细胞为含有16S rRNA基因的重组质粒或重组菌或 重组细胞，所述重组质粒中的出发质粒是PMD-18T。所述样品具体为水样。本发明的实验证明，上述外标准品pMD-18T-16S的制备方法中，微囊藻的DNA是从 培养的铜绿微囊藻中提取的。利用此外标准品，建立real-time PCR方法精确和灵敏，有序 列2和序列3组成的引物可以特异地检测多种微囊藻。本发明的定量检测微囊藻的标准品 具有广谱识别和特异性相结合的特点，敏感性高，制备方法简便，可以长期保存，纯度好，线 性检测范围宽，可以用于水环境样品中微囊藻的快速定量检测。
图1为利用引物(序列2和序列3)检测铜绿微囊藻、小球藻和硅藻图2为定量PCR扩增曲线图3为定量PCR标准曲线图4为定量PCR检测熔解曲线5为质粒标准品定量PCR扩增后凝胶电泳6为利用显微镜计数法和定量PCR方法检测铜绿微囊藻16S rDNA基因片段浓 度比较图7为实际水样定量PCR检测的熔解曲线
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、定量检测微囊藻的标准品pMD-18T-mcyA质粒标准品制备1.铜绿微囊藻的培养
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铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)编号为FACHB-905，购自中国科学院武汉 水生生物研究所。根据中国科学院水生生物研究所提供的培养方法，培养铜绿微囊藻。根据提供的 配方(表1)配置BGll培养基，即在IOOOmL去离子水中，分别加入以下物质，灭菌后4°C保存。表IBGll培养基配方
试剂重量H3BO32.86gMnCl2. H2O1.81gZnSO4. 7H200.222gCuSO4- 5 H2O0.079gNa2MoO4. 2H2〇0.390gCo(N03)2.6H200.049g藻种的培养，切忌将少量的藻种接种在大量的培养基中。培养藻种的整个过程要 求绝对的无菌操作，培养和转接所需要的实验工具必须灭菌，并在无菌的条件下保存；转接 藻种必须在超净台或无菌的接种箱内进行；藻种需要在密闭的无菌空间培养，不能在敞开 的空间培养；藻种培养的光暗周期为光暗=14h IOh0必须定期在显微镜下镜检藻种 是否污染。初次接种，将IOmL藻液接种在20mL培养基中，在弱光照下培养，可以帮助藻种 适应新的培养基和培养环境，待藻种适应后，随着藻种细胞密度的增加，可逐步提高光照， 扩大培养。2.针对微囊藻特异性引物设计在GenBank中下载微囊藻所有16S RNA的序列，将这些序列输入DNAMAN软件中进 行多序列比较分析其同源性，进行引物设计和合成，引物的GC含量在40-60%之间，PCR产 物长度为200-500bp。根据微囊藻(编号:AB012326. 1)设计引物，引物序列如下16S-F 5-TATTGGGCGTAAAGCGTCCT-3 (序列 2)；16S-R 5-AACCACATACTCCACCGCTT-3 (序列 3)。用无菌双蒸水将引物配制成200 μ M的储存液，分装，_20°C保存。3.微囊藻总基因组DNA的提取^lJffi Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver. 3. 0 (TaKaRa Code :DV811A) 试剂盒提取微囊藻的总DNA，操作步骤参考说明书，具体步骤为(1)取IOOyL培养的铜绿微囊藻905，梯度稀释后，加入650μ L的Solution A，室 温静置1分钟。(2)加入 400 μ L 的 Solution B,振荡混合。(3)加入ImL的4°C预冷的Solution C溶液，充分混勻后，12，OOOrpm离心2分钟。注Solution C溶液的制备方法首次使用前，请将1. ImL的Solution C原液移入125mL的Solution C空瓶中，然后加入68. 75mL的异丙醇、41. 25mL的异丁醇，混合均勻， 配制成Solution C溶液后使用。Solution C溶液请于4°C保存。(4)弃去上层有机相，再加入ImL的4°C预冷的Solution C溶液，充分混勻后， 12，OOOrpm离心2分钟。(5)弃去上层有机相，然后将水相溶液(无色下层)转移至置于Collection Tube 上的Filter Cup中，12，OOOrpm离心1分钟。注有机相(上层)带有颜色，请务必除尽，否则会阻碍DNA结合到DNA制备膜上。 相间沉淀不必考虑，在过滤时将被去除。(6)弃Filter Cup，在滤液中加入400 μ L的DB Buffer，混合均勻。(7)将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。将上述操作6混合 溶液转移至Spin Column中，12，OOOrpm离心1分钟，弃滤液。(8)将 500 μ L 的 Rinse A 加入至 Spin Column 中，12，OOOrpm 离心 30 秒钟，弃滤液。(9)将 700 μ L 的 Rinse B 加入至 Spin Column 中，12，OOOrpm 离心 30 秒钟，弃滤液。注)Rinse B在首次使用前，请添加56mL的100 %乙醇，混合均勻。请沿SpinColumn 管壁四周加入Rinse B，这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份。(10)重复操作步骤9。(11)将 Spin Column 安置于 Collection Tube 上，12，OOOrpm 离心 1 分钟。(12)将Spin Column安置于新的1. 5mL的离心管上，在Spin Column膜的中央处 加入50 μ L的灭菌蒸馏水或Elution Buffer,室温静置1分钟。注)把灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热至65°C使用时有利于提高洗脱效率。(13) 12，OOOrpm离心1分钟洗脱DNA，得到铜绿微囊藻905的总基因组DNA。4.质粒标准品制备A.目的片段的制备取20 μ L上述得到的铜绿微囊藻905的总基因组DNA作为PCR反应的模板，PCR 反应体系为150 μ L :4 μ L 20 μ M上游引物(序列2)，4yL 20 μ M下游引物(序列3)，4yL 10 μ M dNTP,7y L TaqDNA 聚合酶(5u/μ L), 12μ L 25 μ M MgC12,15 μ L 10XPCR 缓冲液， 84 μ L无菌双蒸水。PCR 反应程序为先 94°C 4min ；然后 94°C lmin，59°C 40s，72°C 1.5min，进行 35 个 循环；再72°C延伸lOmin。取5 μ L PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，结果表明扩增产物 大小为396bp。B. PCR产物纯化取140 μ L上述PCR产物经过2%琼脂糖凝胶电泳，切胶后利用TaKaRa切胶回收试 剂盒回收(TaKaRa Code :DV805A)，具体方法如下(1)使用TAE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，并在 紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应注意尽量 切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率。(2)切碎胶块，按照以Img= 1 μ L进行计算，向胶块中加入等体积的胶块融化液DR-I Buffer。(3)均勻混合后75°C加热融化胶块(低熔点琼脂糖凝胶只需在45°C加热)。此时 应间断振荡混合，使胶块充分融化(约6-lOmin)。(4)向上述胶块融化液中加入DR-I Buffer量的体积量的DR-II Buffer，均 勻混合。当分离小于400bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇。(5)将试剂盒中的 Spin Column 安置于 Collection Tube 上。(6)将上述操作4的溶液转移至Spin Column中，12，OOOrpm离心Imin,弃滤液。(7)将 500 μ L 的 Rinse A 加入 Spin Column 中，12，OOOrpm 离心 30 秒钟，弃滤液。(8)将 700 μ L 的 Rinse B 加入 Spin Column 中，12，OOOrpm 离心 30 秒钟，弃滤液。 重复操作步骤8。(9)将 Spin Column 安置于 Collection Tube 上，12，OOOrpm 离心 Imin0(10)将Spin Column安置于新的1. 5mL的离心管上，在Spin Column膜的中央处 加入25 μ L的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置lmin，得到纯化的PCR产物。C. PCR产物与质粒连接将上述纯化的PCR 产物与pMD 18-T Vector (TaKaRa Code :D101A)在 T4DNA 连 接酶及缓冲液的条件下连接，4°C连接过夜。操作步骤参考pMD 18-T Vector产品使用手 册，具体步骤如下(1)在微量离心管中配制下列DNA连接反应溶液(20yL) :pMD 18-Τ Vector 1 μ L, PCR 4 μ L, Solution I 5yL。(2) 16°C 反应 30min。(3)全量(20 μ L)连接溶液加入至100 μ L大肠杆菌感受态菌DH5a，冰中放置 30mino(4)42°C加热45s后，再在冰中放置lmin。(5)加入ImL LB液体培养基，37°C振荡培养60min。(6)8000rpm离心2min，弃去上清，混勻取适量涂布在含有Amp+的LB固体培养皿。(7)37°C过夜培养(12_16h)，形成单菌落。D. PCR鉴定阳性克隆在0.2mL PCR管中，预先加入10 μ L dH20，用灭菌牙签挑取单个菌落，在含有Amp 的LB固体培养基上留种，并蘸入dH20中，95°C热裂解lOmin，获得DNA。以此DNA为模版， 微囊藻特异性引物(16S-F和16S-R)为引物，进行扩增，结果为得到396bp片段的为阳性菌落。E.测序将上述D鉴定为阳性的菌落接种于3mL LB(Amp+)培养液中，在37°C培养10_12h， 取2mL菌液送测序公司测序。测序结果为该菌落的质粒中含有序列表中序列1所示的 核苷酸，且该质粒为将序列表中的序列1插入pMD 18-T Vector得到的质粒，命名为 PMD-18T-16S，将含 pMD-18T-16S 的菌命名 DH5a/pMD-18T_16S。进一步将序列1与NCBI中的微囊藻16S rRNA序列比对同源性，结果如下表2所 示，可以看出，序列1与Gene Bank中多种微囊藻的16S rRNA序列具有98%以上的同源性，与其它基因没有同源性，因此PMD-18T-16S为定量检测微囊藻的标准品。
表2.序列1与GenBank中微囊藻16S rRNA序列比对信息
递呈号详情同源 性AB012327.1Microcystis sp. gene for 16S rRNA, partial sequence, isolate: 4B3100%ABO 12326.1Microcystis sp. gene for 16S rRNA, partial sequence, isolate: 4A3100%FN678905.1Microcystis aeruginosa partial 16S rRNA gene, isolate MK10.10100%FN678904.1Microcystis aeruginosa partial 16S rRNA gene, isolate MAKR0205100%GU305833.1Uncultured bacterium clone YHW8 16S ribosomal RNA gene, partial sequence100%GU305813.1Uncultured bacterium clone YHS4 16S ribosomal RNA gene, partial sequence100%GU305810.1Uncultured bacterium clone YHS1 16S ribosomal RNA gene, partial sequence100%F.T595697.1Microcystis sp. CHAB726 16S ribosomal RNA gene, partial sequence100%FJ595696.1Microcystis sp. CHAB720 16S ribosomal RNA gene, partial sequence100%FJ595690.1Microcystis sp. CHAB1442 16S ribosomal RNA gene, partial sequence100%FJ595689.1Microcystis sp. CHAB1449 16S ribosomal RNA gene, partial sequence100%FJ595688.1Microcystis sp. CHAB1445 16S ribosomal RNA gene, partial sequence100%FJ595687.1Microcystis sp. CHAB1446 16S ribosomal100%
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权利要求
一种检测样品中微囊藻的标准品，为含有16S rRNA基因的重组质粒或重组菌或重组细胞；所述16S rRNA基因的序列是序列表中的序列1。
2.根据权利要求1所述的标准品，其特征在于所述重组质粒中的出发质粒是 PMD-18T。
3.—种检测样品中微囊藻的方法，包括如下步骤1)以重组质粒或重组菌或重组细胞为标准品模板，用PCR扩增的体系进行实时荧光定 量PCR扩增，建立标准品的浓度与临界循环数对应的一元线性回归曲线，即得到标准曲线；2)用待测样品替换步骤1)中的标准品，进行实时荧光定量PCR扩增，根据扩增结果的 临界循环数和标准曲线，得到待测样品中16S rRNA基因的数量，即得到待测样品中微囊藻 的数量；所述PCR扩增的体系由实时荧光定量PCR扩增缓冲液、引物对和模板组成；所述引物对 中的各引物在体系中的浓度均为0. 1 μ mol/L，所述引物对中的一条引物为序列表中的序列 2，另一条引物为序列表中的序列3。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述标准品模板在所述PCR扩增的体系 中的浓度为 1. IXlO1 拷贝 /yL、l. IX IO2 拷贝 /yL、l. IX IO3 拷贝 /yL、l. IX IO4 拷贝 / μ LU. IX IO5 拷贝 / μ L、1. 1 X IO6 拷贝 / μ L、1. 1 X IO7 拷贝 / μ L、1. 1 X IO8 拷贝 / μ L 或 1. IX IO9 拷贝 /yL。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述PCR反应中的退火温度为59°C。
6.根据权利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于所述重组质粒或重组菌或重组细胞为含有16S rRNA基因的重组质粒或重组菌或重组 细胞；所述16S rRNA基因的序列是序列表中的序列1。
7.根据权利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于所述重组质粒中的出发质粒是PMD-18T。
8.—种检测微囊藻的试剂盒，包括引物对，所述引物对中的一条引物为序列表中的序 列2，另一条引物为序列表中的序列3。
9.一种PCR试剂，包括实时荧光定量PCR扩增缓冲液、引物对；所述引物对中各每个引 物在试剂中的浓度均为0. 1 μ mol/L，所述引物对中的一条引物为序列表中的序列2，另一 条引物为序列表中的序列3。
10.16S rRNA基因、引物对、重组质粒或重组细胞在检测样品中微囊藻中的应用；所述16S rRNA基因的序列是序列表中的序列1 ；所述引物对中的一条引物为序列表中的序列2，另一条引物为序列表中的序列3 ；所述重组质粒或重组菌或重组细胞为含有16S rRNA基因的重组质粒或重组菌或重组 细胞，所述重组质粒中的出发质粒是PMD-18T。
全文摘要
本发明公开了一种定量检测微囊藻的方法及其专用标准品。本发明提供一种检测样品中微囊藻的标准品，为含有16S rRNA基因的重组质粒或重组菌或重组细胞；所述16S rRNA基因的序列是序列表中的序列1。所述重组质粒中的出发质粒是pMD-18T。本发明的定量检测微囊藻的标准品具有广谱识别和特异性相结合的特点，敏感性高，制备方法简便，可以长期保存，纯度好，线性检测范围宽，可以用于水环境样品中微囊藻的快速定量检测。
文档编号C12Q1/68GK101974633SQ201010525990
公开日2011年2月16日 申请日期2010年10月25日 优先权日2010年10月25日
发明者何苗, 刘丽, 施汉昌, 李丹 申请人:清华大学