专利名称：浓香型白酒窖泥微生物菌群分子扩增用引物及检测方法
技术领域：
本发明属于酿酒技术领域，具体涉及一种浓香型白酒窖泥微生物菌群分子扩增用 引物及检测方法。
背景技术：
浓香型白酒是中国是三大典型香型白酒之一，其独特的工艺造就了浓香型白酒独 特的风味特征。浓香型白酒的特征之一是窖香浓郁，窖泥微生物正是酿造过程中窖香物质 的主要来源。不同窖龄的窖池，随着发酵过程的不断进行，其微生物菌群及数量不断趋于平 衡与稳定，最终达到其特定的微生物菌群结构，从而使出酒品质趋于稳定，使酒更加富有窖 香浓郁感。浓香型白酒的酿造过程是通过自然界中微生物的网罗与聚集，酿酒微生物的种群 结构极为复杂。对于酿酒微生物的研究，由于酿酒微生物的多样性及复杂性，传统的研究方 法并不能完全揭示浓香白酒的酿造机理。目前针对窖泥微生物的研究，主要是采用传统的 微生物学方法进行分离培养，由于样品运输、储存以及分离培养条件等因素的影响(窖泥 中的产香微生物中厌氧微生物种类较多)，故只能分离其中很小的一部分。浓香型白酒酿造 过程中涉及到的微生物种类繁多，为深入研究浓香型白酒的酿造机理，就需要采用更为先 进的技术方法对窖泥微生物菌群进行研究。随着分子生物学技术的发展，可通过对区系中微生物的分子水平的差异，来研究 窖泥微生物菌群的多样性及差异性，以及在不同时间和条件下的变化趋势。目前已有一些 针对土壤微生物16S rDNA的研究方法，并有采用分子生物学的方法研究糟醅微生物的报 道。然而由于窖泥中腐殖质含量较高，并且其微生物种类与糟醅相比有较大的差异性，对于 浓香型白酒窖泥微生物的16S rDNA进行的相关研究尚未见相关报道。目前采用DGGE方法主要是对土壤和糟醅微生物的研究，相关研究报道主要是对 原核微生物16S rDNA中V3高变区的进行扩增，研究菌群结构的差异性。但由于其扩增产 物仅为240bp，反映出来的微生物种群信息量较少，即DGGE图谱中条带较少，不能很好的反 映窖泥微生物菌群结构及丰富度。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种浓香型白酒窖泥微生物16S rDNA扩增用引 物对；使用该引物对扩增窖泥原核微生物16S rDNA片段的方法；以及对扩增出的窖泥原核 微生物16S rDNA片段进行DGGE电泳，以便于进行浓香型白酒窖泥微生物群落分析的方法。本发明首先提供了一种浓香型白酒窖泥微生物菌群16S rDNA扩增用引物对。该 引物对的序列为引物 I (SEQ ID No. 1) 5'-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGGGAA CGC GAA GAA CCT TAC-3，，引物 II (SEQ ID No. 2) :5，-ACG GGC GGT GTG TAC-3，。
本发明还提供了一种扩增浓香型白酒窖泥微生物菌群16S rDNA片段的方法，该方 法是使用上述的引物对进行扩增。进一步的，该方法包括以下步骤a、提取窖泥微生物菌群总DNA ；b、使用权利要求1所述的引物对提取的总DNA进行PCR扩增。其中，上述PCR扩增的扩增程序为95°C预变性4min ；采用降落PCR，65°C开始退 火，每一轮循环降1°C，95°C变性45s，退火45s，共计16个循环，72°C延伸Imin ；以后采用 95 °C变性45s，49 °C退火45s，72 °C延伸lmin，共计20个循环；最后在72°C延伸5min ；所 述PCR扩增的扩增体系为50yL体系，其中Taq酶(5U/ μ L) 1. 0 μ L, 10 X buffer5. OyL, MgCl2(25mM)3. 0μ L, dNTPs Mixture (各 2. 5mM)4. 0μ L,引物 I 与引物 II 各 1· 0μ L，模板 DNA(1 OOng/ μ L) 1. 0 μ L，灭菌双蒸水 34 μ L。其中，提取窖泥微生物菌群总DNA可采用omega公司D5625E. Ζ. N. A. soiIDNA kit型号试剂盒。本发明同时还提供了一种浓香型白酒窖泥微生物菌群16S rDNA片段条带分离方 法。该方法包括以下步骤a、以上述的扩增浓香型白酒窖泥微生物菌群16S rDNA片段的方法扩增出16S rDNA片段产物；b、将扩增出的16S rDNA片段产物进行变性梯度凝胶电泳；变性梯度凝胶电泳的 条件聚丙烯酰胺胶的变性范围40 % 70 %，聚丙烯酰胺胶的浓度6 % 10 % ；电泳液温度 60°C，先用200V电压，电泳lOmin，再用85v电压，电泳15. 5h ；C、将上述变性梯度凝胶电泳后得到的胶进行银染色，保存以供凝胶成像分析使用。可以使用凝胶成像系统及其分析软件(如BI0-1D)分析上述方法中DGGE图谱中 条带的差异性，得出不同窖泥样品微生物群落结构的差异。其中，上述聚丙烯酰胺胶的浓度优选8%。具体而言，本发明提供了以下浓香型白酒窖泥微生物群落分析方法(1)窖泥微生物总DNA提取。可采用Ε. Z. N. A. TM soil DNA kit提取微生物总 DNA。(2)原核微生物16S rDNAV6-V8区的扩增得到PCR产物PCR反应体系为50 μ L LOyLTaq 酶(5U/μ L)，5. 0 μ L 10 X buffer, 3. 0 μ L MgC12 (25mmol/L), 4. 0 μ L dNTPs Mixture (各 2. 5mmol/L)，引物(10 μ mol/L)各 1· 0 μ L，1· 0 μ L 模板 DNA (100ng/L)，34. 0 μ L 灭菌双蒸水。PCR扩增程序95°C预变性4min ；95°C变性45s，应用降落PCR，65°C开始退火，每 一轮次降1°C，最终降至49°C，退火45s，72°C延伸lmin，共计16个循环；以后采用95°C变 性45s，49°C退火45s，72°C延伸lmin，最后在72°C延伸5min，共计20个循环。所用引物序列引物 I (SEQ ID No. 1) 5'-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAACGC GAA GAA CCT TAC-3，，引物 II (SEQ ID No. 2) :5，-ACG GGC GGT GTG TAC-3，。
(3)将上述PCR产物进行DGGE电泳，电泳条件为胶的变形范围为40% 70%， 胶的浓度为8%。电压条件为先用200V电压，电泳lOmin，再用85v电压，电泳15. 5h。(4)将上述不同窖池样品DGGE电泳图谱进行银染色，并用BIO ID软件进行成像分 析比对，即能找出分析窖池微生物的多样性及不同窖池窖泥微生物的差异性。本发明首次公开了利用分子生物学DGGE的手段，对浓香型白酒在酿造过程中窖 泥微生物变化的研究方法，进而得以能够分析酿酒微生物菌群种类及其数量的变化。本方 法是通过窖泥原核微生物中16S rDNA中V6-V8高变区的差异，结合DGGE的技术优化出了 适合酿酒微生物的研究方法。该方法将使微生物的研究变得更加简捷、高效，同时为中国固 态白酒的酿造机理提供了新的研究手段。使用本发明上述方法对窖泥微生物的研究与常规方法进行研究的对比有如下特占.
^ \\\ ·通过DGGE电泳图谱能反映出窖泥微生物的多样性，根据条带的差异能找出酿酒 微生物的差异性。与传统技术相比较，采用本方法能够将难以分离培养的微生物群落，直接 用于比较不同样品微生物菌群种类及数量的差异性；与目前土壤和糟醅微生物相关的分子 生物学研究相比，本方法中随着扩增序列的增加其生物信息量的表达上也更为丰富(即表 现出的条带也更为丰富)，能够更客观的反映出微生物菌群结构的特征；此外能够在较短 的时间内分析出微生物变化的趋势，作为浓香型白酒酿造过程中微生物的研究提供了一种 有效的研究手段。本发明中优选设计的引物是对16S rDNA的V6-V8高变区扩增，其产物约为470bp。 本引物扩增产物接近DGGE最适片段长度，能很好的反应出微生物的菌群结构的信息量(表 现出很好的丰富度)，这与本方法建立过程中的实验结果相符。针对含有GC夹头的引物而言，其扩增片段长度越长，越不易扩增。本方法的建立 过程中，通过梯度PCR优化出了本方法中所用引物特定的扩增体系与条件。同时通过对该 扩增产物DGGE条件的摸索，优化出了变性梯度凝胶电泳的条件，其中包括胶的配置、电压 及时间的控制。此外在本方法的建立过程中，还比较了 V3与V6-V8高变区扩增产物的DGGE 图谱，其结果为V6-V8区扩增产物较前者具有更好的条带分离效果，即能够更好的反映出 微生物菌群结构的差异性。该方法是采用分子生物学的技术对浓香型白酒生产中，窖泥原核微生物进行免培 养研究。其特点是提高了现有DGGE技术在土壤和糟醅微生物应用中检测限度，进一步提高 了研究样品微生物种群的丰富度；克服了现有常规分析方法的不足，能很好的将酿酒微生 物中的优势菌群得以分离，为酿酒微生物的进一步研究提供高效、快捷的技术方法。本发明的有益效果在于本发明方法能够检测出窖泥中优势菌群(大于菌群总数 1%)0本发明方法所扩增出的窖泥微生物的16S rDNA在DGGE图谱中的差异，可用于研究 窖泥微生物菌群的多样性及差异性，以及发酵过程中的微生物菌群结构变化趋势。可以在 短时间内了解到窖泥微生物菌群的差异，进而为窖泥微生物的研究提供一种高效、快捷的 实现酿酒微生物及时监测的方法。
图1 窖泥微生物菌群V3区PCR产物，图中A为老窖窖底样品；B为老窖窖壁样品；
5C为新窖窖底样品；D为新窖窖壁样品；E为老窖窖底与窖壁混合样品。图2 窖泥微生物菌群V6-V8区PCR产物，图中A为老窖窖底样品；B为老窖窖壁样 品；C为新窖窖底样品；D为新窖窖壁样品；E为老窖窖底与窖壁混合样品。图3 :V6-V8高变区PCR扩增产物的DGGE垂直电泳图谱，从左到右的垂直胶变性梯 度为0% 100%。图4 =DGGE条件优化电泳图谱，在图中的A、B、C、D分别为不同电泳条件下的电泳 条带，表明不同电泳条件对DGGE电泳条带有较大的差异性。其中A采用的电泳条件为先用 200V，IOmin,再用 160V, 6h ；B 条件为先用 200V, IOmin,再用 120V, 9h ；C 条件为先用 200V, IOmin,再用 100V, 12h ；D 条件为先用 200V, IOmin,再用 85V, 15. 5h。图5 相同样品不同扩增产物DGGE电泳图谱。A与B，A'与B'为相同窖泥DNA的 样品，A与A'为V3高变区扩增产物的DGGE电泳图谱，B与B'为V6-V8高变区扩增产物的 DGGE电泳图谱。图6 凝胶电泳图，A(窖底)、A'(窖壁)与B(窖底)、B'(窖壁)分别代表同 一窖池中窖壁和窖底相同部位的不同样品的条带。图7:凝胶电泳图，A(老窖窖壁)、A'(老窖窖底)与B(新窖窖壁)、B'(新窖 窖底)分别代表老窖与新窖中的窖壁和窖底不同样品条带。图8 凝胶电泳图，A(窖壁)、A'(窖底)与B(窖壁)、B'(窖底)分别代表窖 龄相同且产酒能力相近的两口百年窖池窖窖壁和窖底样品条带。图9:凝胶电泳图，A、A'与B、B'均为相同综合窖泥样品，前两个样品与后两个样 品为不同批次的DGGE电泳条带，以检测本方法的准确性与重复性。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明 上述主题的范围不仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的 范围。实施例一本发明方法的建立1、引物的选择在本方法的建立过程中，采用了对16S rDNA的V6-V8高变区扩增的引物，其产物 约为470bp，接近DGGE最适片段长度。此外还使用了目前使用较多的用于扩增V3区的引 物，两对引物扩增的PCR产物分别约为240bp和470bp。针对不同的引物序列分别进行扩 增，V3区扩增参考现有文献资料，V6-V8区的扩增通过梯度PCR进行条件的优化。2、扩增条件的优化V3高变区的扩增条件参考现有文献(王奇赞，徐秋芳，姜培坤等.天目山毛竹入 侵阔叶林后土壤细菌群落16S rDNA V3区片段PCR的DGGE分析.土壤学报，2009，46 (4) 662-668) ；V6-V8高变区引物通过扩增条件的优化，得出最优扩增条件如下PCR 扩增反应体系50μ L 体系，其中 Taq 酶(5U/ μ L) 1. 0μ L, 10Xbuffer5. 0 μ L, MgCl2(25mM)3. 0μ L, dNTPs Mixture (各 2. 5mM)4. 0μ L,引物 I 与引物 II 各 1· 0μ L，模板 DNA (lOOng/ μ L) 1· 0 μ L，灭菌双蒸水 34 μ L。PCR扩增程序95°C预变性4min ；95°C变性45s，应用降落PCR，65°C开始退火，每
6一轮次降11，最终降至491，退火45s，72°C延伸lmin，共计16个循环；以后采用95°C变 性45s，49°C退火45s，72°C延伸lmin，最后在72°C延伸5min，共计20个循环。通过对PCR电泳条件的优化得出的扩增产物，如图1和图2所示两对引物分别按 上述的该引物对应的条件进行扩增不同窖泥样品，琼脂糖胶电泳图谱可以看出，扩增产物 分别为240bp和470bp，均与目的片段长度相符，即为所要扩增的目的片段。3、DGGE电泳条件的优化3.1胶变性范围的确定在DGGE分析中，变性范围的确定是通过垂直电泳图谱进行确定的。V6-V8高变区 PCR扩增产物的DGGE垂直电泳图谱，如图3所示图3中垂直胶变性梯度为0% 100%，DNA片段在垂直胶中染色后呈S形曲线。 在胶的左侧，变性剂浓度低，DNA片段为双链形式，因此沿着电泳方向一直迁移。在胶的右 侧，由于变性剂浓度高，DNA进入胶就立刻发生了部分解链，因此迁移很慢。在胶中间，DNA 片段有不同程度的解链。当变性剂浓度临界于DNA片段最低解链区域时，DNA迁移速率有 急剧变化。本研究中，聚丙烯酰胺胶总体宽度为18. 0cm，通过垂直电泳3可以看出胶分 别在7. 6cm和11. 5cm处出现拐点，故目的片段的实际变性范围确定为40% -70%。本方法中，变性剂采用尿素与去离子甲酰胺，变性范围是通过调整胶中变性剂添 加的量而实现的。如本实验中，采用16x20cm的玻璃板，配置16ml变性浓度为40%的 胶溶液添加尿素2. 688g，添加去离子甲酰胺2. 56ml ；配置16ml，变性浓度为70%的胶溶 液添加尿素4. 704g，添加去离子甲酰胺4. 48ml ；在使用梯度生成器，进行制备变性范围为 40% -70%的胶。 3. 2电泳电压及时间的优化优化过程在图4中反映，在图4中的A、B、C、D分别为不同电泳条件下的电泳条带， 表明不同电泳条件对DGGE电泳条带有较大的差异性。其中A采用的电泳条件为先用200V， IOmin,再用 160V, 6h ；B 条件为先用 200V, IOmin,再用 120V, 9h ；C 条件为先用 200V, IOmin, 再用100V，12h ；D条件为先用200V，lOmin，再用85V，15. 5h。结果表明不同电泳条件对窖泥 微生物的分离效果影响很大，总体趋势为电压越低、时间越长，其条带分离效果越来越好; 但电压太低时，电泳时间太长，达不到快捷的检测原则。通过对电泳条件的优化得出，当电 压为85V时，电泳超过16h有部分DNA条带就会跑出聚丙烯酰胺胶。故本方法最终确定的 电压和时间确定为先用200V, IOmin,再用85V，15. 5h。3. 3聚丙烯酰胺胶浓度的优化本方法建立过程中，聚丙烯酰胺凝胶的浓度分别采用6%、8%、10%、12%，实验结 果表明胶浓度为6%、8%、10%时，使用上述优化出的电泳条件均可电泳出较好的条带， 并且其相似性基本一致；胶浓度为12%电泳条带较差。但当胶浓度为6%时，其柔韧度较 差，不利于后续的银染色操作，故本方法在胶浓度为6% 10%均有较好的操作性，其中最 优胶浓度为8%。4、优化的结果A、优化得到了浓香型白酒窖泥微生物16S rDNA扩增用引物对引物 I :5’ -CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAA CGC GAA GAACCT TAC—3，，
引物 II :5，-ACG GGC GGT GTG TAC-3，。B、优化得到了扩增浓香型白酒窖泥微生物16S rDNA片段的方法。a、提取窖泥微生物总DNA ；b、使用上述的引物对提取的总DNA进行PCR扩增。其中，提取窖泥微生物总DNA可采用omega公司D5625E. Ζ. N. A. soil DNA kit 型号试剂盒，按其手册操作。其中，步骤b的PCR扩增的扩增程序为95°C预变性4min ；采用降落PCR，65°C开始 退火，每一轮循环降1°C，95°C变性45s，退火45s，共计16个循环，72°C延伸Imin ；以后采用 951变性458，491退火45s，72°C延伸lmin，共计20个循环；最后在72°C延伸5min ；步骤b的PCR扩增的扩增体系为50 μ L体系，其中Taq酶(5U/ μ L) l.OyL, 10Xbuffer5. 0μ L, MgCl2 (25mM) 3. 0 μ L, dNTPs Mixture (各 2. 5mM)4.0yL，引物 I 与引物 II 各 1· 0 μ L，模板 DNA (lOOng/ μ L) 1· 0 μ L，灭菌双蒸水 34 μ L。C、优化得到浓香型白酒窖泥微生物群落分析方法，该方法包括以下步骤a、该方法是以扩增出的浓香型白酒窖泥微生物群落的16S rDNA产物进行变形梯 度凝胶电泳；b、聚丙烯酰胺胶变性范围40% 70%，胶浓度6% 10%，优选8% ；DGGE电 泳装置的电泳条件电泳液温度60°C，先用200V电压，电泳lOmin，再用85v电压，电泳 15. 5h ；C、将上述DGGE电泳胶进行银染色，并使用BI0-1D分析DGGE图谱中条带的差异 性，就可得出不同窖泥样品微生物群落结构的差异。其中，步骤b中的扩增浓香型白酒窖泥微生物16S rDNA片段的方法为提取窖泥微生物总DNA后使用上述的引物对提取的总DNA进行PCR扩增；引物 I 5' -CGCCCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAA CGC GAA GAA CCT TAC-3’，引物 II :5，-ACG GGC GGT GTG TAC-3’。其中，PCR 扩增的扩增程序为95 °C 预 变性4min ；采用降落PCR，65 V开始退火，每一轮循环降1 °C，95 V变性45s，退火45s，共 计16个循环，72°C延伸Imin ；以后采用95°C变性45s，49°C退火45s，72°C延伸lmin，共计 20个循环；最后在72°C延伸5min。PCR扩增的扩增体系为50 μ L体系，其中Taq酶(5U/ μ L) 1. 0 μ L，10 X buffer5. OyL, MgCl2 (25mM) 3. 0 μ L, dNTPs Mixture (各 2. 5mM) 4· 0 μ L，引 物I与引物II各1. 0 μ L，模板DNA(1 OOng/ μ L) 1. 0 μ L，灭菌双蒸水34 μ L。其中，提取窖泥微生物总DNA可采用omega公司D5625E. Ζ. N. A. soil DNA kit 型号试剂盒，按其手册操作。5、两对引物对相同样品扩增产物的DGGE电泳图谱的对比V3高变区的DGGE电泳条件参考现有文献的条件，V6-V8高变区采用优化出的条件 进行变形梯度凝胶电泳。其电泳图谱如图5所示图5中，A与B，A'与B'为相同窖泥DNA的样品，A与A'为V3高变区扩增产物 的DGGE电泳图谱，B与B'为V6-V8高变区扩增产物的DGGE电泳图谱。通过图谱可以看 出B与B'得图谱条带表现的更为丰富，即表现的微生物菌群结构的信息量更大。因此本 方法优化能更好的反映窖泥原核微生物的菌群结构，该方法适用于浓香白酒窖泥微生物的 快速检测。
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以下四个实例不仅是对不同窖泥样品中微生物菌群的检测，同时是对本方法准确 度，精密度，重复性等方法学指标的验证。实施例二用本发明方法对同一窖池不同部位窖泥进行对比检测(1)窖泥微生物总DNA提取，采用Ε. Z. N. A. TM soil DNA kit提取微生物总DNA。(2)扩增16S rDNA的引物序列引物 I :5’ -CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAA CGC GAA GAACCT TAC-3，，引物 II :5，-ACG GGC GGT GTG TAC-3，。(3)原核微生物16S rDNA V6-V8区的扩增PCR反应体系为50 μ L l.OyL Taq 酶(5υ/μ L)，5· 0μ L 10 X buffer, 3. 0μ L MgC12 (25mmol/L), 4. 0 μ L dNTPs Mixture (各 2. 5mmol/L),引物(10ymol/L)各 1· 0 μ L，1· 0 μ L 模板 DNA (100ng/L)，34. 0 μ L 灭菌双蒸水。PCR扩增程序95°C预变性4min ；95°C变性45s，应用降落PCR，65°C开始退火，每 一轮次降l°c，最终降至49°C，退火45s，72°C延伸lmin，共计16个循环；以后采用95°C变 性45s，49°C退火45s，72°C延伸lmin，最后在72°C延伸5min，共计20个循环。(4)上述PCR产物进行DGGE电泳，电泳条件为胶的变形范围为40% 70%，胶 的浓度为8%。电压条件为先用200V电压，电泳lOmin，再用85v电压，电泳15. 5h。(5)将上述不同窖池样品DGGE电泳图谱进行银染色，并用BIO ID软件进行比对。 找出分析窖池微生物的多样性及不同窖池窖泥微生物的差异性。结果见图6，A(窖底)、A'(窖壁)与B(窖底)、B'(窖壁)分别代表同一窖池 中窖壁和窖底相同部位的不同样品的条带从图6的电泳图谱可以看出相同窖池不同部位的窖泥微生物具有很高的相似性， 通过BI0-1D软件分析，两者的不同部位窖泥微生物中DNA条带的相似度均超过90%。故本 方法对于窖泥原核微生物的研究具有很好的重复性。实施例三用本发明方法对产酒品质差异较大的不同窖龄窖泥进行对比检测(1)窖泥微生物总DNA提取，采用Ε. Z. N. A. TM soil DNA ktt提取微生物总DNA。(2)扩增16S rDNA的引物序列引物 I :5’ -CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAA CGC GAA GAACCT TAC-3，，引物 II :5，-ACG GGC GGT GTG TAC—3，。(3)原核微生物16S rDNAV6-V8区的扩增PCR反应体系为50 μ L l.OyL Taq 酶(5υ/μ L)，5· 0μ L 10 X buffer, 3. 0μ L MgC12 (25mmol/L), 4. 0 μ L dNTPs Mixture (各 2. 5mmol/L),引物(10ymol/L)各 1· 0 μ L，1· 0 μ L 模板 DNA (100ng/L)，34. 0 μ L 灭菌双蒸水。PCR扩增程序95°C预变性4min ；95°C变性45s，应用降落PCR，65°C开始退火，每 一轮次降l°c，最终降至49°C，退火45s，72°C延伸lmin，共计16个循环；以后采用95°C变 性45s，49°C退火45s，72°C延伸lmin，最后在72°C延伸5min，共计20个循环。(4)上述PCR产物进行DGGE电泳，电泳条件为胶的变形范围为40% 70%，胶 的浓度为8%。电压条件为先用200V电压，电泳lOmin，再用85v电压，电泳15. 5h。
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(5)将上述不同窖池样品DGGE电泳图谱进行银染色，并用BIO ID软件进行比对。 找出分析窖池微生物的多样性及不同窖池窖泥微生物的差异性。结果见图7，图7中A(老窖窖壁)、A'(老窖窖底)与B(新窖窖壁)、B'(新窖 窖底)分别代表老窖与新窖中的窖壁和窖底不同样品条带。从图7的电泳图谱可以看出不同年代的窖池不同部位的窖泥微生物具有较大的 差异性，在图中表现为条带数目及条带位置的差异性。通过BI0-1D软件分析，两者的窖壁 中窖泥微生物的优势菌群相似度仅为30%，窖底中窖泥微生物的优势菌群相似度为65%。 并且表现出老窖窖泥微生物菌群比新窖窖泥微生物菌群更为丰富，并且其中占绝对优势的 微生物菌群具有较高的相似性。故利用本方法可以确定不同窖龄的窖泥中原核微生物菌群 的差异性。实施例四用本发明方法对相同窖龄的产酒品质相近的窖池进行对比检测(1)窖泥微生物总DNA提取，采用Ε. Z. N. A. TM soil DNA ktt提取微生物总DNA。(2)扩增16S rDNA的引物序列引物 I :5’ -CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAA CGC GAA GAACCT TAC-3，，引物 II :5，-ACG GGC GGT GTG TAC—3，。(3)原核微生物16S rDNAV6-V8区的扩增PCR反应体系为50 μ L l.OyL Taq 酶(5υ/μ L)，5· 0μ L 10 X buffer, 3. 0μ L MgC12 (25mmol/L), 4. 0 μ L dNTPs Mixture (各 2. 5mmol/L),引物(10ymol/L)各 1· 0 μ L，1· 0 μ L 模板 DNA (100ng/L)，34. 0 μ L 灭菌双蒸水。PCR扩增程序95°C预变性4min ；95°C变性45s，应用降落PCR，65°C开始退火，每 一轮次降l°c，最终降至49°C，退火45s，72°C延伸lmin，共计16个循环；以后采用95°C变 性45s，49°C退火45s，72°C延伸lmin，最后在72°C延伸5min，共计20个循环。(4)上述PCR产物进行DGGE电泳，电泳条件为胶的变形范围为40% 70%，胶 的浓度为8%。电压条件为先用200V电压，电泳lOmin，再用85v电压，电泳15. 5h。(5)将上述不同窖池样品DGGE电泳图谱进行银染色，并用BIO ID软件进行比对。 找出分析窖池微生物的多样性及不同窖池窖泥微生物的差异性。结果见图8，图8中A(窖壁)、A'(窖底)与B(窖壁)、B'(窖底)分别代表窖 龄相同且产酒能力相近的两口百年窖池窖窖壁和窖底样品条带从图8的电泳图谱可以看出，产酒能力相近的百年老窖池窖泥微生物菌群结构更 为复杂，菌群数量也更为丰富。并且窖池窖壁和窖底不同部位的窖泥原核微生物都具有较 高的相似性，在图中表现为共有条带数目较多。通过BI0-1D软件分析，两者的窖壁中窖泥 微生物的优势菌群相似度为79%，窖底中窖泥微生物的优势菌群相似度为76%，且其中占 绝对优势的微生物菌群具有较高的相似性。故利用本方法对产酒能力相近的窖泥中原核微 生物菌群相似性与产酒能力表现为一致性。表明该方法可以通过条带的相似性与差异性， 研究窖泥微生物的种类相似性与差异性，进而研究不同窖池产酒生香能力的差异性。实施例五用本发明方法对相同窖泥原核微生物综合样品进行重复性检测(1)窖泥微生物总DNA提取，采用Ε. Z. N. A. TM soil DNA kit提取微生物总DNA。(2)扩增16S rDNA的引物序列
引物 I :5’ -CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAA CGC GAA GAACCT TAC-3，(SEQ ID No. 1)，引物 II :5，-ACG GGC GGT GTG TAC—3，(SEQ ID No. 2)。(3)原核微生物16S rDNA V6-V8区的扩增PCR反应体系为50 μ L l.OyL Taq 酶(5υ/μ L)，5· 0μ L 10 X buffer, 3. Ομ L MgC12 (25mmol/L), 4. O μ L dNTPs Mixture (各 2. 5mmol/L),引物(10ymol/L)各 1· O μ L，1· O μ L 模板 DNA (100ng/L)，34. O μ L 灭菌双蒸水。PCR扩增程序95°C预变性4min ；95°C变性45s，应用降落PCR，65°C开始退火，每 一轮次降11，最终降至491，退火45s，72°C延伸lmin，共计16个循环；以后采用95°C变 性45s，49°C退火45s，72°C延伸lmin，最后在72°C延伸5min，共计20个循环。(4)上述PCR产物进行DGGE电泳，电泳条件为胶的变形范围为40% 70%，胶 的浓度为8%。电压条件为先用200V电压，电泳lOmin，再用85v电压，电泳15. 5h。(5)将上述不同窖池样品DGGE电泳图谱进行银染色，并用BIO ID软件进行比对。 找出分析窖池微生物的多样性及不同窖池窖泥微生物的差异性。结果见图9，图9中A、A'为与B、B'分别代表相同综合窖泥样品两个批次的DGGE 电泳条带。从图9的电泳图谱可以看出，综合窖泥样品中原核微生物菌群种类极为丰富，并 且在其不同批次的DGGE电泳操作中原核微生物菌群结构具有高度相似性，在图中表现为 共有条带数目几乎完全相同。通过BI0-1D软件分析，A、A'与B、B'的四个样品，其中占绝 对优势的微生物菌群相似性接近100%。故利用本方对研究窖泥原核微生物菌群结构具有 很好的重复性。
权利要求
浓香型白酒窖泥微生物菌群16S rDNA扩增用引物对，其特征在于所述的引物对的序列为引物I5’ CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAA CGC GAA GAACCT TAC 3’，引物II5’ ACG GGC GGT GTG TAC 3’。
2.扩增浓香型白酒窖泥微生物菌群16SrDNA片段的方法，其特征在于使用权利要求 1所述的引物对进行扩增。
3.扩增浓香型白酒窖泥微生物菌群16SrDNA片段的方法，其特征在于包括以下步骤a、提取窖泥微生物菌群总DNA；b、使用权利要求1所述的引物对提取的总DNA进行PCR扩增。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述PCR扩增的扩增程序为95°C预变性4min ；采用降落PCR，65°C开始退火，每一轮 循环降1°C，95°C变性45s，退火45s，共计16个循环，72°C延伸Imin ；以后采用95°C变性 45s，49°C退火45s，72°C延伸lmin，共计20个循环；最后在72°C延伸5min ；所述PCR扩增的扩增体系按50 μ L体系计，其中5U/μ L Taq酶1. 0 μ L，10 X缓冲液 5. 0μ L,25mM MgCl23. 0 μ L，各 2. 5mM dNTPs 混合物 4. 0 μ L,引物 I 与引物 II 各 1· 0μ L， IOOng/ μ L 模板 DNA1. OyL,灭菌双蒸水 34 μ L。
5.浓香型白酒窖泥微生物菌群16SrDNA片段条带分离方法，其特征在于a、以权利要求2 5项所述的方法扩增出16SrDNA片段产物；b、将扩增出的16SrDNA片段产物进行变性梯度凝胶电泳；变性梯度凝胶电泳的条件 聚丙烯酰胺胶的变性范围40 % 70 %，胶的浓度6% 10% ；电泳液温度60°C，先用200V 电压，电泳lOmin，再用85v电压，电泳15. 5h ；c、将上述变性梯度凝胶电泳后得到的胶进行银染色，保存以供凝胶成像分析使用。
全文摘要
本发明属于酿酒技术领域，具体涉及一种浓香型白酒窖泥微生物分子检测用引物对及分子检测方法。本发明还提供一种浓香型白酒窖泥微生物的分子检测方法，其特点是利用免培养的方法提取窖泥微生物中原核微生物原基因组，对其中微生物16S rDNA的V6-V8高变区进行PCR扩增，并进行变性梯度凝胶电泳(DGGE)。通过电泳图谱，可分析出微生物的多样性及菌群结构的变化。利用本发明可以快速准确的扩增浓香白酒酿酒过程中不同窖泥的微生物的16S rDNA；并用DGGE进一步检测浓香白酒酿酒过程中不同窖泥微生物菌群的差异性，实现对酿酒窖泥微生物在发酵过程中变化的及时监测。
文档编号C12N15/11GK101974519SQ201010537999
公开日2011年2月16日 申请日期2010年11月9日 优先权日2010年11月9日
发明者卢中明, 敖宗华, 敖灵, 易彬, 沈才洪, 陕小虎, 韩光 申请人:泸州品创科技有限公司