专利名称：一种基于pcr-elisa的结核分枝杆菌耐药基因检测方法
技术领域：
本发明涉及生物医药体外诊断试剂领域，更具体地讲，涉及一种基于PCR-ELISA 的结核分枝杆菌耐药基因检测方法。
背景技术：
长期以来结核分枝杆菌药敏试验一直是结核病细菌学诊断中十分重要的技术。但传统的结核病药敏检测方法为表型耐药检测方法，建立在结核分枝杆菌的培养基础之上，通常需要4到6周的时间，远不能满足临床治疗的需要。随着基于PCR技术的分子生物学诊断技术的发展及结核病耐药分子机制的逐步阐明，依据分子生物学技术检测结核杆菌耐药基因检测方法也得到了迅速的发展。目前， 特别是基于反向系列探针杂交技术的PCR-ELISA方法对临床结核杆菌进行快速药敏检测显示了极大的应用前景。与目前常规的实验室鉴定方法和其它分子鉴定方法相比，具有下列优势首先，它可以一次实验同时对多种耐药基因的多种基因位点进行快速基因型别鉴定，具有检测信息量大的特点。其次，它可以直接对临床痰标本进行检测，因此，实验室常规的结核杆菌药敏检测时间可以从目前的4 - 6周缩短至6个小时，真正可能起到对指导临床医生及早准确用药的作用。此外，同DNA序列测定和最近几年发展的DNA芯片技术相比， 该技术无需额外添置贵重仪器，即可以在大多数临床实验室进行推广应用。因此PCR-ELISA 方法是一项非常适合在发展中国家临床实验室开展使用的新型耐药基因快速检测技术。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种特异性好、准确度高且适用于大规模检测的基于PCR-ELISA的结核分枝杆菌耐药基因检测方法。为了解决上述问题，本发明提供一种基于PCR-ELISA的结核分枝杆菌耐药基因检测方法，包括以下步骤(1)针对rpoB基因突变位点(依据Genbank中结核分枝杆菌标准株 H37Rv的全基因序列和rpoB基因序列，GenBank登录号L27989)设计11个探针，且将所述探针点样于96微孔板；(2)每一个检测样本的DNA分3个反应管，每管中都加入rpoB-F和 rpoB-R两种引物，每对引物中的下游5’端均带有地高辛标记，经PCR扩增出大量含有所述地高辛标记的结核分枝杆菌相应的基因片段产物；(3)将所述扩增产物与所述探针进行特异性杂交，杂交后带有所述地高辛标记的目标基因与所述探针结合在一起，洗去未结合的片段，通过ELISA反应，测量OD值得出结果。步骤(1)中11个探针分别为
MTC :5，-CGCTGTCGGGGTTGACCCA- 3，，序列如 SEQ ID N0:1 所示； Rffl :5，-CAGCCAGCTGAGCCAATTCA-3，，序列如 SEQ ID NO:2 所示； RW2 :5，-AATTCATGGACCAGAACAACCC-3，，序列如 SEQ ID N0:3 所示； RW3 :5，-CCGCTGTCGGGGTTGACC-3，，序列如 SEQ ID N0:4 所示； RW4 :5，-GTTGACCCACAAGCGCCGA-3，，序列如 SEQ ID N0:5 所示； RW5 :5，-GACTGTCGGCGCTGGGGC- 3，，序列如 SEQ ID N0:6 所示；RM2 5' -AATTCATGGTCCAGAACAACCC -3，，序列如 SEQ ID NO:7 所示； RM4a :5，-GGTTGACCTACAAGCGCCGA- 3，，序列如 SEQ ID NO:8 所示； RM4b :5，-GTTGACCGACAAGCGCCGA- 3，，序列如 SEQ ID NO:9 所示； RM5a :5，-GACTGTTGGCGCTGGGGCC- 3，，序列如 SEQ ID NO: 10 所示； RM5b :5，-GACTGTGGGCGCTGGGGCC-3，，序列如 SEQ ID NO: 11 所示。步骤(2)中两种引物分别为
rpoB-F :5，-GTGGTCGCCGCGATCAAG-3，，序列如 SEQ ID N0:12 所示； rpoB-R :5，-CACGTCGCGGACCTCCAG-3，，序列如 SEQ ID N0:13 所示。其中，RWl — RW5覆盖了 rpoB耐药基因的81个碱基突变热点区，而RM2至RlKb的 5 条探针分别检测 R516 (GTC)、R526 (TAC)、R526 (GAC)、R531 (TTG)和 R531 (TGG) 5 个高频率耐药基因的突变位点。本发明的有益效果主要是
(1)特异性好扩增的特异性及探针杂交的特异性使本方法具有较高的特异性；(2) 准确度高采用PCR技术，数量极少的结核分枝杆菌耐药基因以几何倍数扩增，提高了灵敏度，同时特异性达到100% ； (3)价格低廉使用普通ELSIA设备即可完成，结果观察方便； (4)适用于大规模检测96微孔板使得一次性完成多次试验，可以同时对大量的不同结核分枝杆菌临床株进行检测。与常规PCR相比，不需要对产物进行电泳、避免使用溴化乙锭等毒性物质；检测中所用的耗材成本也较便宜，而且保证了较高的特异性和灵敏度等优点。操作快速简便又安全可靠，适用于对结核分枝杆菌耐药基因检测并对结核分枝杆菌进行初步菌种鉴定。本发明应用该方法设计了一个放置11条探针的多重寡核苷酸探针阵列，可以快速检测与RFP耐药相关的rpoB基因的碱基突变，并同时可对结核分枝杆菌复合群进行鉴别诊断。应用本发明建立的方法检测52株耐多药结核分枝杆菌，47株(90.4%)在rpoB突变热点区检出突变。与rpoB的PCR产物测序结果对比分析，探针阵列上野生型探针和突变型探针检测RFP耐药rpoB的序列与DNA测序的结果符合率均为是100%(52/52)。PCR-ELISA 杂交方法通过一次杂交实验即可同时快速获得结核分枝杆菌对多个临床分离株的药物耐受信息，使得结核分枝杆菌分离株耐药性检测从常规的4 - 6周的时间缩短到6 - 8h，充分显示了该方法的优越性。因此该方法有可能发展成为应用于临床快速耐药检测的新方法， 这种基于PCR-ELISA的反向系列探针杂交方法也可以用于耐多药结核病的流行病学调查和研究，为耐药结核病的控制起到重要作用。
图1为PCR-ELISA检测结核分枝杆菌耐药基因rpoB。列第1列Control为探针空白对照，第2-12列MTC - RlKb分别为探针名称；行第1-8行分别为待测的菌株标本号。
具体实施例方式下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
做详细说明。1、模板DNA的制备待测标本中结核分枝杆菌的DNA提取，取临床分枝菌株置于1. 5 ml离心管中，溶于0. 5 mlTE液，14000 r/min离心5 min，弃去上清液；加入100 μ L 1% TritonX-100裂解液，漩祸混匀，100°C水浴15 min，立即冰浴3 min ； 140000 r/min, IOmin,取上清液。2、PCR 反应
a、配制3X504 1^反应体系每反应管中引物印08寸、印08-1 各2 μ L, IOXBuffer 5 PL，模板DNA 0.5 μ L, dNTPs 2 μ L，Taq酶2U，总体积50 μ L。其中引物的靶基因为rpoB 基因(GenBank 登录号L27989)
其中下游引物的5丨端均用地高辛标记，引物序列分别为 rpoB-F 5’ -GTGGTCGCCGCGATCAAG-3’ rpoB-R 5’ -CACGTCGCGGACCTCCAG-3，
b、混勻反应体系，PCR反应程序设置如下预变性95°C，5min ；进入循环，94 V变性30s， 58°C退火30s，72°C延伸30s，共；35个循环；循环结束后72°C延伸15min，冷却至4°C备用。3、特异探针进行ELISA反应
①包被用链霉亲合素( ο μ g / ml)包被96孔酶标板，4°C过夜。②固定第1列设为空白对照，不加标记探针，其他操作相同。从第2列开始，每列分别加入生物素标记的探针(3 pmol / ml)。第2列加入1个用于菌种初步鉴定的探针，可以鉴定出是否是结核分枝杆菌复合群。从第3列开始，依次加入10个用于结核分枝杆菌耐药基因检测的探针。用于菌种初步鉴定的1个DNA探针命名为MTC，其探针序列为 MTC 5' -CGCTGTCGGGGTTGACCCA- 3'
结核分枝杆菌检耐药基因检测的探针分别为 Rffl5' -CAGCCAGCTGAGCCAATTCA-3‘
RW25’ -AATTCATGGACCAGAACAACCC-3’
RW35' -CCGCTGTCGGGGTTGACC-3‘
RW45' -GTTGACCCACAAGCGCCGA-3‘
RW55' -GACTGTCGGCGCTGGGGC- 3'
RM25’ -AATTCATGGTCCAGAACAACCC -3’
RM4a5' -GGTTGACCTACAAGCGCCGA- 3'
RM4b5’ -GTTGACCGACAAGCGCCGA- 3’
RM5a5' -GACTGTTGGCGCTGGGGCC- 3'
RM5b5’ -GACTGTGGGCGCTGGGGCC-3’。③变性将地高辛标记的PCR产物，95°C变性lOmin，然后迅速冰浴。④杂交将地高辛标记的PCR产物与5XSSC按1 :9混合均勻，每孔加入100 μ 1。 在58°C温水浴中杂交池。洗去未杂交的PCR产物。⑤加入酶标抗体每孔加入100 μ 1 (1 :1000)抗地高辛抗体标记的辣根过氧化氢酶，孵育30min。洗板。⑥显色检测每孔加入100 μ 1显色混合液(ΤΜΒ-Η202)，室温，lOmin，然后每孔加入100 μ 1 2Μ H2S04终止反应。4、用酶标仪测定OD值，观察结果Cut off值=阴性对照组OD值(450nm)的算术平均值+3倍标准差，凡检测孔的OD值 (450nm )大于Cut off值者判定为杂交阳性，小于Cut off值者为杂交阴性。实施例1
待测标本1例大肠杆菌株，1例结核分枝杆菌H37Rv株，3例非结核分枝杆菌分别为鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌和耻垢分枝杆菌；1例临床结核分枝杆菌rpoB基因野生型株、2例为临床结核分枝杆菌rpoB基因突变型株。1、模板DNA的制备
取分枝菌株置于1. 5 ml离心管中，溶于0. 5 mlTE液，14000 r/min离心5 min，弃去上清液；加入100 μ L 1% TritonX-100裂解液，漩涡混勻，100°C水浴15 min，立即冰浴3 min ； 140000 r/min，取上清液。2、PCR 反应
a、配制3X50 4 1^反应体系每反应管中引物印08呼、印08-1 各2 μ L, IOXBuffer 5 μ L，模板DNA 0. 5 μ L，dNTPs 2 μ L，Taq酶2U，总体积50 μ L。其中引物的靶基因为 rpoB基因的突变热点区。b、混勻反应体系，PCR反应程序设置如下预变性95°C，5min ；进入循环，94°C变性 30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，共；35个循环；循环结束后72°C延伸15min，冷却至4°C备用。3、特异探针进行ELISA反应
①包被用链霉亲合素(10μ g / ml)包被酶标板，4°C过夜。②固定从第2列开始加探针，第2列加入MTC探针，3-7列分别加入RW1、Rff2, Rff3, Rff4和RW5共5个野生型探针，8_12列分别加入冊2、RM4a、冊4b、RM5a和RM5b共 5个突变型探针。加入生物素标记探针浓度3 pmol / ml。③变性将地高辛标记的PCR产物，95°C变性lOmin，然后迅速冰浴。④杂交将地高辛标记的PCR产物与5 X SSC按1 :9混合均勻，每孔加入100 μ 1。 PCR产物加入的顺序第1行加入大肠杆菌株，第2行结核分枝杆菌H37Rv株，第3_5行加入分类上属于非结核分枝杆菌的鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌和耻垢分枝杆菌；第6行加入临床结核分枝杆菌rpoB基因野生型菌株、第7-8行分别加入临床结核分枝杆菌rpoB基因突变型菌株。在58°C温水浴中杂交池。⑤加入酶标抗体每孔加入100 μ 1 (1 :1000)抗地高辛抗体标记的辣根过氧化氢酶，孵育30min。⑥显色检测每孔加入100 μ 1显色混合液(ΤΜΒ-Η202)，室温，lOmin，然后每孔加入100 μ 1 2Μ H2S04终止反应。4、用酶标仪测定OD值，观察结果
结果见附图1，第1行，所有各列的检测结果均为杂交阴性；第2行，第1列对照检测阴性，第2列阳性，3-7列RffU Rff2, Rff3, RW4和RW5共5个野生型探针均检测阳性，8-12列 RM2、RM4a、RM4b、RM5a和RlKb共5个突变型探针均检测阴性；第3_5行的三个非结核分枝杆菌，第1列对照检测阴性，第2列阴性，3-12无明显杂交显色结果，检测阴性；第6行的1例临床结核分枝杆菌rpoB基因野生型，第1列对照检测阴性，第2列阳性，3-7列RW1、 Rff2, Rff3, RW4和RW5共5个野生型探针均检测阳性，8-12列RM2、RM4a、RM4b、RM5a禾口
6RM5b共5个突变型探针均检测阴性，经DNA测序验证，结果吻合；第7行的1例临床结核分枝杆菌rpoB基因突变型，第1列对照检测阴性，第2列阳性，3-6列RW1、Rff2, Rff3, RW4共 4个野生型探针均检测阳性，第7列RW5野生型探针检测阴性，但第11列RMfe突变型探针阳性，说明该菌株在rpoB的531氨基酸位点发生碱基突变，为耐药株，经DNA测序验证，结果吻合；第8行的1例临床结核分枝杆菌rpoB基因突变型，第1列对照检测阴性，第2列阳性，3-7列中的RW1、RW2、RW3、RW5共4个野生型探针均检测阳性，而第6列的RW4野生型探针检测阴性，但第10列的RM4b突变型探针阳性。说明该菌株在rpoB的5 氨基酸位点发生碱基突变，为耐药株，经DNA测序验证，结果吻合。说明该探针阵列可以很好工作，用于结核分枝杆菌耐药检测和初步菌种鉴定。实施例2
1、细菌DNA的制备156株结核分枝杆菌临床分离株来源于临床住院患者，依《全国结核病诊断细菌学检验规程》进行结核分枝杆菌培养，并对结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌进行初步鉴定和药敏分析。取临床分枝菌株置于1.5 ml离心管中，溶于0.5 mlTE 液，14000 r/min离心5 min，弃去上清液；加入100 μ L 1% TritonX-100裂解液，漩涡混勻，100°C水浴15 min，立即冰浴3 min ； 140000 r/min，取上清液。2、PCR 扩增
a、配制3X50 4 1^反应体系每反应管中引物印08寸、印08-1 各2 μ L, IOXBuffer 5 PL，模板DNA 0.5 μ L, dNTPs 2 μ L，Taq酶2U，总体积50 μ L。其中引物的靶基因为rpoB 基因的突变热点区。b、混勻反应体系，PCR反应程序设置如下预变性95°C，5min ；进入循环，94°C变性 30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，共；35个循环；循环结束后72°C延伸15min，冷却至4°C备用。3、特异探针进行ELISA反应
①包被用链霉亲合素(10μ g / ml)包被酶标板，4°C过夜。②固定从第2列开始，每列分别加入生物素标记探针(3 pmol / ml)。③变性将地高辛标记的PCR产物，95°C变性lOmin，然后迅速冰浴。④杂交将地高辛标记的PCR产物与5XSSC按1 :9混合均勻，每孔加入100 μ 1。 在55°C温浴中杂交池。⑤加入酶标抗体每孔加入100 μ 1 (1 :1000)抗地高辛抗体标记的辣根过氧化氢酶，孵育30min。⑥显色检测每孔加入100 μ 1显色混合液(ΤΜΒ-Η202)，室温，lOmin，然后每孔加入100 μ 1 2Μ H2S04终止反应。4、用酶标仪测定OD值，观察结果
应用寡核苷酸探针阵列鉴定结核分枝杆菌临床分离株156例，经培养初步鉴定为结核分枝杆菌复合群的139株临床分离株均与群特异探针MTC杂交阳性；经培养初步鉴定为非结核分枝杆菌的17株临床分离株除均与群特异探针MTC杂交阴性。应用寡核苷酸探针阵列检测结核分枝杆菌临床分离株156例，112结核分枝杆菌药敏检测结果为敏感的菌株中，所有菌株均为野生型探针杂交阳性，耐药型探针杂交阴性。 检测27例耐药菌株的rpoB的突变热点区，25株(92. 6%)检出突变。仅2株未检出rpoB基
7因突变，但经测序验证，此两种菌株的rpoB基因未发生突变，说明二者结果一致。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种基于PCR-ELISA的结核分枝杆菌耐药基因检测方法，其特征在于，包括以下步骤(1)针对rpoB基因突变位点设计11个探针，且将所述探针点样于96微孔板；(2)每一个检测样本的DNA分3个反应管，每管中都加入rpoB-F和rpoB-R两种引物，每对引物中的下游引物5’端均带有地高辛标记，经PCR扩增出大量含有所述地高辛标记的结核分枝杆菌相应的基因片段产物；(3)将所述扩增产物与所述探针进行特异性杂交，杂交后带有所述地高辛标记的目标基因与所述探针结合在一起，洗去未结合的片段，通过ELISA反应，测量 OD值得出结果。
2.根据权利要求1所述的一种基于PCR-ELISA的结核分枝杆菌耐药基因检测方法，其特征在于，步骤(1)中11个探针分别为MTC5' -CGCTGTCGGGGTTGACCCA- 3'Rffl5' -CAGCCAGCTGAGCCAATTCA-3‘RW25’ -AATTCATGGACCAGAACAACCC-3’RW35' -CCGCTGTCGGGGTTGACC-3‘RW45' -GTTGACCCACAAGCGCCGA-3‘RW55' -GACTGTCGGCGCTGGGGC- 3'RM25’ -AATTCATGGTCCAGAACAACCC -3’RM4a5' -GGTTGACCTACAAGCGCCGA- 3'RM4b5’ -GTTGACCGACAAGCGCCGA- 3’RM5a5' -GACTGTTGGCGCTGGGGCC- 3'RM5b5’ -GACTGTGGGCGCTGGGGCC-3’。
3.根据权利要求1所述的一种基于PCR-ELISA的结核分枝杆菌耐药基因检测方法，其特征在于，步骤(2)中两种引物分别为rpoB-F 5’ -GTGGTCGCCGCGATCAAG-3’ rpoB-R 5’ -CACGTCGCGGACCTCCAG-3，。
全文摘要
本发明提供一种基于PCR-ELISA的结核分枝杆菌耐药基因检测方法，包括以下步骤(1)针对rpoB基因突变位点设计11个探针，并将之点样于96微孔板；(2)每一个检测样本的DNA均分3个反应管同时扩增，每管加入rpoB-F和rpoB-R两种引物，每对引物中的下游引物5’端均用地高辛标记，经PCR扩增出大量含有地高辛标记的结核分枝杆菌相应的基因片段产物；(3)将扩增产物与探针进行杂交，杂交后带有地高辛标记的目标基因与探针结合在一起，洗去未结合的片段，通过ELISA反应，测量OD值得出结果。本方法提供了一次杂交实验即可快速获得结核分枝杆菌对多个临床分离株的药物耐受信息，使得结核分枝杆菌分离株耐药性检测缩短到6－8h，充分显示了该方法的优越性。
文档编号C12Q1/68GK102465177SQ20101054136
公开日2012年5月23日 申请日期2010年11月12日 优先权日2010年11月12日
发明者唐神结, 孙战强, 张舒林, 张颖, 王洪海, 郭晓奎 申请人:上海交通大学医学院