专利名称：即用型沙门菌鉴定平板的试剂盒、制备及使用方法
技术领域：
本发明涉及肠道病原菌中沙门菌的特异性酶-底物表型和血清分型同步进行的 鉴定方法，特别涉及利用酶-反应底物产生的典型菌落形态和同时针对沙门菌“0” “H”抗 原进行培养从而利于沙门菌血清型鉴定的组合的试剂盒和使用方法。
背景技术：
现阶段使用的沙门菌生化表型和血清表型鉴定的方法要求繁琐、敏感性和特 异性低，对疑似菌落鉴定所用自动化生化反应试剂材料的费用昂贵。中国专利申请 200810047994. 7公开了“一种同时快速检测沙门菌和志贺菌的方法”，该发明属于食源性致 病菌的快速检测技术，具体说是一种对沙门菌和志贺菌同时进行检测的环介导等温DNA扩 增(LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION, LAMP)检测方法。包括由样品处理试剂、 LAMP反应试剂、BST DNA聚合酶的大片段、琼脂糖、溴酚蓝上样缓冲溶液、溴化乙锭溶液组 成的试剂的配制，以及扩增产物的检测和沉淀产生的检测程序。其步骤是首先设计特异 性引物；其次是提取样品DNA ；第三是配制反应体系。该法较之目前采用的传统细菌培养方 法、免疫检测方法和其它分子生物学方法具有操作简单、快速且灵敏特异的优点。可应用于 食品和其它样品中沙门菌和志贺菌的同时快速检测。但是该方法筛选病原菌还存在一定 局限性，即筛选到的阳性结果可能无法通过细菌学方法分离到；也可能因为存在死菌而获 得假阳性结果；另外，需设计特异性引物及提取DNA步骤较为复杂，筛选结果判断还不够直 观。本发明是基于利用沙门菌特异性酶-底物反应产生的典型菌落形态和同时针对沙门菌 “0”“H”抗原进行培养从而利于沙门菌血清型鉴定的试剂盒和筛选方法，较之现阶段使用的 传统分离平板和鉴定技术单纯依赖生化鉴定为主的方法更具有综合成本低、操作简单、快 速、无需依赖特殊仪器且有特异性、准确性及阳性预期值高的优点，而且能大大简化传统的 沙门菌血清分型的流程，缩短鉴定时间，有利于血清分型方法的标准化流程的建立和应用。 适用临床医疗、出入境检验检疫、畜牧兽医、食品卫生、疾病预防控制及相关实验室开展沙 门菌血清型的双相抗原的同步鉴定和沙门菌特异性酶-底物反应鉴定。更在原理设计、操 作人员与实验室要求方面和分子生物学方法有本质的区别，且使用针对性更强，所以与中 国专利申请200810047994. 7不存在相似性与可比性。发明内容
本发明的目的是公开一种即用型沙门菌鉴定平板的试剂盒、制备及使用方法。主 要解决现有沙门菌鉴定步骤繁复且成本较高、抗原诱导或培养材料不统一导致的血清鉴定 结果偏倚、报告时间拖沓筛等技术难题。本发明用1种同时预制有沙门菌特异性酶-底物、 沙门菌特异性“0”相抗原生长、特异性“H”相抗原生长的选择性培养基的组合平板，使用一 步接种-培养法达到能同时观察沙门菌特异性酶-低物反应并同时进行双相抗原的血清型 鉴定，达到对沙门菌简易鉴定、快速分型的效果。
本发明的技术方案为即用型沙门菌鉴定平板的试剂盒，包括沙门菌特异性酶-底物筛选培养基成分琼脂17. 0g，胰化酪蛋白胨10. 0g，蛋白胨 10. Og,酵母浸出物3. Og,氯化钠5. Og, 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-吡喃半乳糖苷250mg，辛 酸盐250mg，磺胺吡啶0.5g，蒸馏水1000ml。沙门菌特异性酶-底物筛选培养基的配制取 琼脂粉17. 0克、胰化酪蛋白胨10. 0g、蛋白胨10. 0g、酵母粉3. 0g、氯化钠5. Og置990ml蒸 馏水中加热溶解煮沸2次后，称取5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-吡喃半乳糖苷250mg溶解 于^ilTri. HCl (pH8. 0)，称取辛酸盐250mg溶解于細1蒸馏水中，再称取磺胺吡啶0. 5g溶 解于2ml0. 01摩尔浓度NaOH中，待加热培养基冷却至50°C—并加入后混勻，调整pH至7. 2 (按冷却至25°C后测量值为标准)。倾注Iml于专用无菌一次性平板的“B”位置，备用。
针对沙门菌特异性“0”相抗原生长的选择性培养基成分胰化酪蛋白胨12. Og, 蛋白胨5. 0g，酵母粉3. 5g，淀粉1. 0g，氯化钠5. 0g，琼脂14. 0g，蒸馏水1000ml，加热溶解后 矫正pH至7. 1 士0. 1 (按冷却至25°C后测量值为标准)。经15磅15分钟(121°C )灭菌后倾 注6ml于专用无菌一次性平板的“C”位置，备用。
针对沙门菌特异性“H”相抗原生长的选择性培养基成分胰化酪蛋白胨17. Og, 植物蛋白胨3. Og,氯化钠5. 0g, K2HPO4 2. 5g，葡萄糖2. 5g，去氧胆酸盐0. 3g，琼脂6. Og,蒸馏 水1000ml，加热溶解后矫正pH至7. 3士0. 2 (按冷却至25°C后测量值为标准)。经15磅压 力15分钟(121°C )灭菌后倾注6ml于专用无菌一次性平板的“A”位置，备用。
本发明的有益效果是改进传统的沙门菌抗原诱导的血清鉴定流程，使用标准 化的配方培养基对沙门菌的两相抗原进行针对性的培养，有利于减少操作者个体和不同 品牌的沙门菌分型血清之间的随机误差，缩短鉴定报告时间，并创造性的将沙门菌特异性 酶-底物培养基整合进去，达到同时对酶生化表型和双相血清同步进行的鉴定效果，避免 了肠杆菌科中生化特征和抗原性与沙门菌特别涉及利用酶-反应底物产生的典型菌落形 态和同时针对沙门菌“0”、“H”抗原进行培养从而利于沙门菌血清型鉴定的组合的试剂盒和 使用方法。主要解决现有沙门菌鉴定步骤繁复且成本较高、抗原诱导或培养材料不统一导 致的血清鉴定结果偏倚、报告时间拖沓筛等技术难题，达到对沙门菌简易鉴定、快速分型的 效果。同时，操作过程简便也极大提高了单位时间的工作效率，使操作者更易掌握和接受， 减少试验过程中人为因素造成的个体差异。
图1为本发明试剂盒结构示意中1-针对沙门菌特异性“H”相抗原生长的选择性培养基；2-沙门菌特异性酶-底 物筛选培养基；3-针对沙门菌特异性“0”相抗原生长的选择性培养基。
具体实施方式
参照附图1，即用型沙门菌鉴定平板的试剂盒，包括沙门菌特异性酶-底物筛选培养基2 成分琼脂17. 0g，胰化酪蛋白胨10. 0g，蛋白胨 10. Og,酵母浸出物3. Og,氯化钠5. Og, 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-吡喃半乳糖苷250mg，辛 酸盐250mg，磺胺吡啶0.5g，蒸馏水1000ml。沙门菌特异性酶-底物筛选培养基的配制取 琼脂粉17. 0克、胰化酪蛋白胨10. 0g、蛋白胨10. 0g、酵母粉3. 0g、氯化钠5. Og置990ml蒸 馏水中加热溶解煮沸2次后，称取5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-吡喃半乳糖苷250mg溶解于^ilTri. HCl (pH8. 0)，称取辛酸盐250mg溶解于細1蒸馏水中，再称取磺胺吡啶0. 5g溶 解于2ml0. 01摩尔浓度NaOH中，待加热培养基冷却至50°C—并加入后混勻，调整pH至7. 2 (按冷却至25°C后测量值为标准)。倾注Iml于专用无菌一次性平板的“B”位置，备用。
针对沙门菌特异性“0”相抗原生长的选择性培养基3 成分胰化酪蛋白胨12. Og, 蛋白胨5. Og,酵母粉3. 5g，淀粉1. Og,氯化钠5. Og,琼脂14. Og,蒸馏水IOOOml，加热溶解后 矫正PH至7. 1 士0. 1 (按冷却至25°C后测量值为标准)。经15磅15分钟(121°C )灭菌后倾 注6ml于专用无菌一次性平板的“C”位置，备用。
针对沙门菌特异性“H”相抗原生长的选择性培养基1 成分胰化酪蛋白胨 17. Og,植物蛋白胨3. Og,氯化钠5. 0g, K2HPO4 2. 5g，葡萄糖2. 5g，去氧胆酸盐0. 3g，琼脂 6. Og,蒸馏水1000ml，加热溶解后矫正pH至7. 3 士 0. 2(按冷却至25°C后测量值为标准)。经 15磅压力15分钟(121°C )灭菌后倾注6ml于专用无菌一次性平板的“A”位置，备用。
即用型多功能沙门菌鉴定平板使用方法疑似沙门菌培养物分别接种于即用型多功能沙门菌鉴定平板“A”、“B”、“C”三个区域， 36°C培养18-24h后，所有的沙门菌(包括伤寒沙门菌与非伤寒沙门菌)在B区域均呈现为中 等大小、湿润、边缘光滑的酒红色菌落；C区域为白色培养物；A区域为蔓延生长培养物，如 果连续3代(次)培养未见蔓延生长者考虑报告为沙门菌某一单相菌变种。
血清分型鉴定方法挑取C区域的培养物进行“0”相因子血清的玻片凝集反应鉴 定特异性O抗原；挑取A区域的边缘培养物进行“H”因子相血清的玻片凝集反应鉴定特异 性Hl和H2抗原。根据抗原鉴定的结果报告沙门菌分型结果。根据上海市疾病预防控制中 心微生物实验室许学斌等使用来自临床腹泻株、食品株和环境株共计1078株沙门菌，分别 比较使用即用型多功能沙门菌鉴定平板和传统手工配置平板的H相位诱导方法的分型结 果99%的菌株经过即用型多功能沙门菌鉴定平板培养3代后均能得到明确的血清型结果； 而传统方法前3代培养仅能得到83%的血清型结果。见表1。
表1即用型多功能沙门菌鉴定平板和传统方法鉴定沙门菌(1078株)结果比较
权利要求
1.即用型沙门菌鉴定平板的试剂盒，其特征是包括1)、沙门菌特异性酶-底物筛选培养基琼脂17.0g，胰化酪蛋白胨10. 0g，蛋白胨 10. Og,酵母浸出物3. Og,氯化钠5. Og, 5-溴-4"氯-3"吲哚-β -D-吡喃半乳糖苷250mg, 辛酸盐250mg，磺胺吡啶0. 5g，蒸馏水IOOOml ；2)、针对沙门菌特异性“0”相抗原生长的选择性培养基胰化酪蛋白胨12.0g，蛋白胨 5. Og,酵母粉3. 5g，淀粉1. Og,氯化钠5. Og,琼脂14. Og,蒸馏水IOOOml ；3)、针对沙门菌特异性“H”相抗原生长的选择性培养基胰化酪蛋白胨17.0g，植物 蛋白胨3. Og,氯化钠5. 0g, K2HPO4 2. 5g，葡萄糖2. 5g，去氧胆酸盐0. 3g，琼脂6. Og,蒸馏水 1000ml。
2.权利要求1所述的即用型沙门菌鉴定平板的试剂盒的制备方法，其特征是1)、沙门菌特异性酶-底物筛选培养基制备取琼脂粉17.0克、胰化酪蛋白胨10. 0g、 蛋白胨10. 0g、酵母粉3. 0g、氯化钠5. Og置990ml蒸馏水中加热溶解煮沸2次后，称取 5-溴-4-氯-3-吲哚- β -D-吡喃半乳糖苷250mg溶解于4mlTri. HCl，ρΗ8· 0 ；称取辛酸盐 250mg溶解于細1蒸馏水中，再称取磺胺吡啶0. 5g溶解于2ml0. 01摩尔浓度NaOH中，待加 热培养基冷却至50°C—并加入后混勻，调整pH至7. 2，按冷却至25°C后测量值为标准，倾注 Iml于专用无菌一次性平板的“B”位置，备用；2)、针对沙门菌特异性“0”相抗原生长的选择性培养基制备将胰化酪蛋白胨12.Og, 蛋白胨5. Og,酵母粉3. 5g，淀粉1. Og,氯化钠5. Og,琼脂14. Og,蒸馏水1000ml，加热溶解后 矫正PH至7. 1 士0. 1，经加热加压灭菌后倾注6ml于专用无菌一次性平板的“C”位置备用；3)、针对沙门菌特异性“H”相抗原生长的选择性培养基制备将胰化酪蛋白胨17.Og, 植物蛋白胨3. Og,氯化钠5. 0g, K2HPO4 2. 5g，葡萄糖2. 5g，去氧胆酸盐0. 3g，琼脂6. Og,蒸馏 水1000ml，加热溶解后矫正pH至7. 3 士0. 2，经加热加压灭菌后倾注6ml于专用无菌一次性 平板的“A”位置备用。
3.权利要求1所述的即用型沙门菌鉴定平板的试剂盒的使用方法，其特征是包括以 下步骤疑似沙门菌培养物分别接种于无菌一次性平板“A”、“B”、“C”三个区域，A为点种、B和 C为划线接种，36°C培养18-24h后，所有的沙门菌在B区域均呈现为中等大小、湿润、边缘光 滑的酒红色菌落；C区域为白色培养物；A区域为蔓延生长培养物，如果连续3代培养未见 蔓延生长者报告为沙门菌某一单相菌变种。
4.权利要求1所述的即用型沙门菌鉴定平板的试剂盒的使用方法，其特征是包括以 下步骤挑取无菌一次性平板C区域的培养物进行“0”相因子血清的玻片凝集反应鉴定特异 性0抗原；挑取无菌一次性平板A区域的边缘培养物进行“H”相因子血清的玻片凝集反应 鉴定特异性Hl和H2抗原，最后根据抗原鉴定的结果报告沙门菌分型结果。
全文摘要
本发明涉及肠道病原菌中沙门菌的特异性酶-底物表型和血清分型同步进行的鉴定方法，主要解决现有沙门菌鉴定步骤繁复且成本较高、抗原诱导或培养材料不统一导致的血清鉴定结果偏倚、报告时间拖沓筛等技术难题。即用型沙门菌鉴定平板的试剂盒，包括1)沙门菌特异性酶-底物筛选培养基，2)针对沙门菌特异性“O”相抗原生长的选择性培养基，3)针对沙门菌特异性“H”相抗原生长的选择性培养基。本发明利用酶-反应底物产生的典型菌落形态和同时针对沙门菌“O”“H”抗原进行培养从而利于沙门菌血清型鉴定。
文档编号C12Q1/04GK102031282SQ20101055037
公开日2011年4月27日 申请日期2010年11月19日 优先权日2010年11月19日
发明者许学斌 申请人:上海市疾病预防控制中心