专利名称：一种体外人胚胎干细胞诱导分化为视网膜色素上皮细胞的试验方法
技术领域：
本发明涉及一种胚胎干细胞定向分化技术，特别涉及一种体外人胚胎干细胞诱导分化为视网膜色素上皮细胞的试验方法。
背景技术：
人胚胎干细胞(human Embnyonic Stem Cell, ES细胞)是属于全能肝细胞，具有分化三个胚层的各种人体组织细胞的潜能。如何能诱导ES细胞定向分化为单一的，特定的细胞是目前研究的焦点，它将为组织工程和器官的替代治疗带来新的希望。目前，体外可诱导璞玉动物(小鼠、大鼠、豚鼠等)ES细胞分化为神经元、造血细胞、成肯细胞、软骨细胞、心肌细胞、血管肉皮等多种类型的细胞。由于人ES细胞建系成功率低，知道1998年美国的 Thomson才首次建立人的ES细胞系，所以有关人ES细胞的定向分化研究，目前仍很少。
发明内容
本发明的目的在于提供一种方法，具体为一种将体外人胚胎干细胞诱导分化为视网膜色素上皮细胞的试验方法。为了实现上述目的，本发明所提供的技术方案是一种体外人胚胎干细胞诱导分化为视网膜色素上皮细胞的试验方法，其特征在于，具体步骤为A)将0. 25%胰酶和0. lmg/mL的胶原酶iv配制在含有ImM CaCl2和20% KSR的 PBS溶液中，用其消化ES克隆，使其成为5-10个细胞的ES细胞团。消化后悬浮在含有WNT 抑制剂DKKl (100ng/mL)和NODAL抑制剂LEFTY-A (500ng/mL)的无血清培养基中。B)将ES克隆短期孵育在明胶包被的培养皿中以去除饲养层细胞C)ES细胞团在非粘附细菌培养皿中以每毫升6. 7X IO2个细胞团的浓度在连续分化培养基中培养作为本发明的优选方案，步骤C中所述连续分化培养基包括(1)DMEM/F12,20% KSR, 0. ImM NMAA, 2mM L-glutamine 培养基；(2)G-MEM,20% KSR，0. ImM NMAA, ImM pyruvate, 0. ImM BME 培养基；(3)G-MEM, 15% KSR，0. ImM NMAA, ImM pyruvate,0. ImM BME 培养基；作为本发明的优选方案，ES细胞团在所述(1)培养基中培养2天；在所述(2)培养基中培养4天；在所述(3)培养基中培养8天；在所述(4)培养基中培养6天；接着，添力口 WNT 的抑制剂 DKK-I (100ng/mL)和 NODAL 的抑制剂 LEFTY-A (500ng/mL)。进一步的，每平方厘米10-15个ES细胞簇重新铺在含有多聚赖氨酸、层粘连蛋白和纤维连接蛋白的8孔培养玻片上，在含有10% KSR的ES分化培养基(G-MEM，0. ImM NMAA, ImM pyruvate,0. ImM BME)中培养。本发明的有益效果是具有方法简便、重复性好、成功率高，全性好，来源丰富经济等优点。
具体实施例方式下面结合附图
对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。一种体外人胚胎干细胞诱导分化为视网膜色素上皮细胞的试验方法，具体步骤为A)将0. 25%胰酶和0. lmg/mL的胶原酶iv配制在含有ImM CaCl2和20% KSR的PBS 溶液中，用其消化ES克隆，使其成为5-10个细胞的ES细胞团。消化后悬浮在含有WNT抑制剂DKKl (100ng/mL)和NODAL抑制剂LEFTY-A (500ng/mL)的无血清培养基中；B)将ES克隆短期孵育在明胶包被的培养皿中以去除饲养层细胞；C)ES细胞团在非粘附细菌培养皿中以每毫升6. 7X102个细胞团的浓度在以下连续分化培养基中培养(1)在DMEM/F12， 20% KSR, 0. ImM NMAA,2mM L-glutamine 培养基中培养 2 天；(2)在 G-MEM，20% KSR，0. ImM NMAA, ImM pyruvate, 0. ImM BME 培养基中培养 4 天；(3)在 G-MEM，15 % KSR，0. ImM NMAA, ImM pyruvate, 0. ImM BME 培养基中培养 8 天；(4)在 G-MEM，10 % KSR, 0. ImM NMAA, ImM pyruvate，0. ImM BME培养基中培养6天；20天后，添加WNT的抑制剂DKK-1 (100ng/mL)禾口 NODAL的抑制剂LEFTY-A (500ng/mL)。每平方厘米10-15个ES细胞簇重新铺在含有多聚赖氨酸、层粘连蛋白和纤维连接蛋白的8孔培养玻片上，在含有10% KSR的ES分化培养基 (G-MEM, 0. ImM NMAA，ImM pyruvat e，0. ImMBME)中培养。在第25天，能够观察到Rx (神经视网膜祖细胞标记)阳性克隆；在第50天，将出现丰富的Mitf (RPE祖细胞标记)和1^x6阳性克隆(30. 6士4. 7% )；在第60天，有鳞片状和六角形样的色素细胞出现；在第120天，抗Z0-1抗体显示来源于人ES细胞的色素细胞形成紧密的连接。以上所述，仅为本发明的具体实施方式
，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域的技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
权利要求
1.一种体外人胚胎干细胞诱导分化为视网膜色素上皮细胞的试验方法，其特征在于， 具体步骤为A)将0.25%胰酶和0. lmg/mL的胶原酶iv配制在含有ImM CaCl2和20% KSR的PBS 溶液中，用其消化ES克隆，使其成为5-10个细胞的ES细胞团。消化后悬浮在含有WNT抑制剂DKKl (100ng/mL)和NODAL抑制剂LEFTY-A (500ng/mL)的无血清培养基中；B)将ES克隆短期孵育在明胶包被的培养皿中以去除饲养层细胞；OES细胞团在非粘附细菌培养皿中以每毫升6. 7X IO2个细胞团的浓度在连续分化培养基中培养。
2.根据权利要求1所述的一种体外人胚胎干细胞诱导分化为视网膜色素上皮细胞的试验方法，其特征在于，步骤C中所述连续分化培养基包括(1)DMEM/F12,20%KSR, 0. ImM NMAA,2mM L-glutamine 培养基；(2)G-MEM,20%KSR，0. ImM NMAA, ImM pyruvate, 0. ImM BME 培养基；(3)G-MEM,15% KSR，0. ImM NMAA, ImM pyruvate,0. ImM BME 培养基；
3.根据权利要求2所述的一种体外人胚胎干细胞诱导分化为视网膜色素上皮细胞的试验方法，其特征在于，在所述(1)培养基中培养2天；在所述( 培养基中培养4天；在所述C3)培养基中培养8天；在所述(4)培养基中培养6天；接着，添加 WNT 的抑制剂 DKK-I (100ng/mL)和 NODAL 的抑制剂 LEFTY-A (500ng/mL)。
4.根据权利要求3所述的一种体外人胚胎干细胞诱导分化为视网膜色素上皮细胞的试验方法，其特征在于，每平方厘米10-15个ES细胞簇重新铺在含有多聚赖氨酸、层粘连蛋白和纤维连接蛋白的8孔培养玻片上，在含有10% KSR的ES分化培养基(G-MEM，0. ImM NMAA, ImM pyruvate, 0. ImM BME)中培养。
全文摘要
本发明提供一种体外人胚胎干细胞诱导分化为视网膜色素上皮细胞的试验方法，其步骤为A)将0.25％胰酶和0.1mg/mL的胶原酶iv配制在含有1mM CaCl2和20％KSR的PBS溶液中，用其消化ES克隆，使其成为5-10个细胞的ES细胞团；B)将ES克隆短期孵育在明胶包被的培养皿中以去除饲养层细胞；C)ES细胞团在非粘附细菌培养皿中以每毫升6.7×102个细胞团的浓度在连续分化培养基中培养。本发明具有方法简便、重复性好、成功率高，全性好，来源丰富经济等优点。
文档编号C12N5/073GK102465111SQ20101055048
公开日2012年5月23日 申请日期2010年11月19日 优先权日2010年11月19日
发明者范国平, 薛志刚 申请人:范国平, 薛志刚