专利名称：鱼翅实时荧光pcr鉴别的引物及探针、试剂盒和方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及用于鱼翅真伪鉴别的寡核苷酸引物及探针，包含本发明的寡核苷酸引物及探针的试剂盒，用于鉴别鱼翅真伪的实时荧光 PCR检测方法，以及所述特异性寡核苷酸引物和探针或试剂盒在鉴别鱼翅真伪中的应用。
背景技术：
鱼翅为中国的传统高档食品，列为八珍之一，有「鲍、参、翅、肚」之称，消费量逐年 提高。中国最迟自宋代就有食用鱼翅记载。《宋会要》有关于福建从海外输入鱼翅的记述。 到明代，食用已较广泛，《潜确类书》、《本草纲目》等书均有记载。鱼翅主要是鲨鱼鳍中的细 丝状软骨，其成分主要为胶原蛋白，此外还含有少量的脂肪、钙、磷、铁和维生素，民间认为 鱼翅具有滋补健身作用。由于制作鱼翅的鲨鱼种类较多，所用鱼鳍的大小不一致，长的超过1米，小的约10 公分，而且来源部位及形状差异很大，加之产地与分类习惯的差别等原因，鱼翅的名称很不 一致，而且至今没有通用的分类方法。例如按加工过程和成品形态，可分为生翅、明翅、翅 筋和翅饼。按来源于鲨鱼不同部位，可分为小脊翅、脊翅(背鳍)、勾翅(尾鳍)及翅片(胸 鳍)，其中脊翅、勾翅两面颜色相近，脊翅的翅筋较短；翅片则多呈长形，两面颜色不同。此 夕卜，也以来源于不同鲨鱼种类分为群翅(犁头鳐)、天九翅(姥鲨)、海虎翅(虎鲨)以及牙 拣翅(青鲨、鼠鲨和各种真鲨等)。由于天然鱼翅受资源的限制，价格昂贵，而随着人们生活水平的提高，对天然鱼翅 的消费量却越来越大。有关科研和水产加工部门在本世纪初开始了仿真鱼翅加工工艺的研 究，选用海藻酸钠、明胶为主原料，氯化钙等为凝固剂，研制出了仿真鱼翅。仿真鱼翅在外观 和口感方面与天然鱼翅非常相似，且价格低廉，采用鱼明胶为主原料生产的人造鱼翅，与真 鱼翅在味道上也很接近，因为鱼翅本身除了腥味外没有其它味道，食用时依靠汤料出味，所 以一般人难辨真伪。近年来，国内市场出现大量以仿真鱼翅冒充真鱼翅的行为，损害了消费 者的权益，扰乱了市场秩序。面对混乱的鱼翅市场，由于目前鱼翅产品缺乏相关标准、规范，给执法造成一定难 度，许多不法企业钻空子牟利。经查阅国内外文献，到目前为止，未见有成熟的鱼翅真伪鉴 别的方法。当前主要依靠个人经验，通过眼看、手摸、口尝等感官方法进行鱼翅的真伪鉴别。目前，国内外少见报道能快速、简单、特异且灵敏地检测鱼翅的方法。因此，本领域需要一种快速、特异性好、灵敏度高的鱼翅的真伪鉴别方法，进行鱼 翅真伪的鉴别。
发明内容
本发明的一个目的在于，提供用于快速鉴别鱼翅真伪的特异性寡核苷酸引物及探 针。本发明的另一个目的在于，提供用于快速鉴别鱼翅真伪的实时荧光PCR检测方法。本发明的再一 个目的在于，提供用于快速鉴别鱼翅真伪的试剂盒。
本发明的再一个目的在于，提供本发明的特异性寡核苷酸引物和探针在鉴别鱼翅 真伪中的应用。针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案根据本发明的一个实施方案，本发明提供用于PCR方法鉴别鱼翅真伪的特异性寡 核苷酸引物对和探针。本发明的寡核苷酸引物对和探针是根据不同鲨鱼纲和硬骨鱼类的 线粒体16s rDNA序列具有差异性的特点而设计的。在一个实施方案中，所述引物对由上 游引物和下游引物组成，所述上游引物为Cartil-Fll :GACCTGTATGAAAGGCACCACGAGAG(SEQ IDNo. 1)，所述下游引物为 Cartil-Rll :CCCTTGGTCACCCCAACCAAA(SEQID No. 2)；所述探针 为 Cartil-Pl :CGAGAAGACCCTATGGAGCTTCAAACAC(SEQ ID No. 3)，在探针的 3，端连接有一个 荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团HEX。使用本发明的引物对和探针的组 合，在样品量极少的情况下，相对于其他引物对仍能特异、灵敏地扩增出目的片段。根据本发明的另一个实施方案，本发明提供鉴别鱼翅真伪的实时荧光PCR检测方 法，所述方法包括使用针对鱼翅的特异性寡核苷酸引物对和探针，所述引物对是根据不同 鲨鱼纲和硬骨鱼类的线粒体16s rDNA序列具有差异性的特点而设计的。在一个实施方案 中，在本发明的鱼翅真伪鉴别的实时荧光PCR检测方法中，所使用的特异性寡核苷酸引物 对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序列为SEQ ID No. 1，所述下游引物的 碱基序列为SEQ ID No. 2 ；所述探针的碱基序列为SEQ ID No. 3，在探针的3’端连接有一个 荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团HEX。本发明的发明人通过大量的筛选 工作确定了本发明的特异性寡核苷酸引物对和探针，并建立了稳定的PCR体系，从而特异 且灵敏地鉴别鱼翅的真伪。在一个实施方案中，本发明的鉴别鱼翅真伪的实时荧光PCR检测方法还进一步包 括提取鱼翅样品总DNA的步骤。在一个实施方案中，在所述DNA提取步骤中，通过检测脊椎 动物线粒体16S rDNA序列，来测试样品总DNA的提取质量。在一个优选的实施方案中，检 测线粒体16S rDNA序列的通用引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序 列为M16S-F :GGTTTACGACCTCGATGTTGG(SEQ ID No. 4)，所述下游引物的碱基序列为M16S-R CGGTCTGAACTCAGATCACGTAG(SEQ ID No. 5)；所述探针的碱基序列为M16S-P :CGTTGAACAAACG AACCCTTAATARCGG(SEQ ID No. 6)，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连 接有一个荧光报告基团FAM。所述PCR扩增条件是95°C，IOmin ；95°C 15s ；60°C，lmin，40个 循环。根据本发明的另一个实施方案，本发明提供用于快速鉴别鱼翅真伪的试剂盒，所 述试剂盒包括本发明的用于实时荧光PCR方法鉴别鱼翅真伪的特异性寡核苷酸引物对以 及探针和使用说明书。在本发明的试剂盒的优选实施方案中，本发明的特异性寡核苷酸引 物对是根据不同鲨鱼纲和硬骨鱼类的线粒体16s rDNA序列具有差异性的特点而设计的。 在一个优选的实施方案中，所述试剂盒中包含的特异性寡核苷酸引物对由上游引物和下游 引物组成，所述上游引物的碱基序列为SEQ ID No. 1，所述下游引物的碱基序列为SEQ ID No. 2;所述试剂盒中包含的探针的碱基序列为SEQ ID No. 3，在探针的3’端连接有一个荧光 淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团HEX。在优选的实施方案中，所述试剂盒还包括用于样品DNA提取的试剂和用于PCR反应的试剂。在一个优选的实施方案中，所述试剂 盒的使用说明书中包括对用于快速鉴别鱼翅真伪的PCR扩增的条件的描述。在一个优选的 实施方案中，所述试剂盒的说明书中给出的PCR扩增条件是95°C，IOmin ；95°C 15s ；60°C, Imin, 40个循环。根据本发明的再一个实施方案，本发明提供本发明的特异性寡核苷酸引物对和探 针在鉴别鱼翅真伪中的应用。在根据本发明的应用的优选实施方案中，所述特异性寡核苷 酸引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序列为SEQ ID No. 1，所述下游 引物的碱基序列为SEQ IDNo. 2 ；所述探针的碱基序列为SEQ ID No. 3，在探针的3’端连接 有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团HEX。在另一个实施方案中，本 发明还提供本发明的试剂盒在鉴别鱼翅真伪和区分不同种类鱼翅中的应用。优选地，在本 发明的上 述应用中，所述试剂盒包括本发明的特异性寡核苷酸弓I物对和探针。本发明以鱼翅的DNA为检测基础，根据鲨鱼纲和硬骨鱼类的线粒体16S rDNA序 列，克隆了鲨鱼线粒体16S rDNA部分序列，根据这些序列设计引物及探针，利用实时荧光 PCR法鉴别鱼翅的真伪。实时荧光定量PCR即在常规PCR方法的基础上，加入荧光标记的探针或者荧光染 料，随着PCR产物的积累，探针或染料发出的荧光信号增强，而荧光监测系统可接收到荧光 信号，即每产生一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形 成完全同步。因此可以实时监控整个PCR反应过程，并最终检测出待测样品的初始拷贝数， 从而可检测待测鱼翅成分。本发明的实时荧光PCR检测方法采用完全闭管检测，无需PCR后处理，避免了交叉 污染和假阳性。本发明的方法巧妙地运用了 PCR技术的DNA高效扩增、核酸杂交的特异性和 荧光检测技术的快速和敏感性，具有操作简单、省时省力、结果可靠和准确灵敏等优点。使 用本发明的实时荧光PCR检测方法，其简单、快速、特异且灵敏的特点适合用于国内外市场 上鱼翅成分真伪的鉴别。
图1是显示待测样品DNA提取效果的实时荧光PCR结果，其中使用脊椎动物通用 引物对SEQ ID No.4和SEQ ID No. 5及探针SEQ ID No. 6检测，其中荧光曲线依次为1.大 青鲨；2.尖吻斜锯牙鲨；3.澳洲半沙条鲨；4.舒氏星鲨；5.鼠鲨；6.加勒比斜锯牙鲨；7.尖 吻鲭鲨；8.兔银鲛；9.叶吻银鲛；10.平鱼；11.龙俐鱼；12.鲳鱼；13.鳕鱼；14.偏口鱼； 15.红绸鱼；16.黄花鱼；17.草鱼；18.空白对照(ddH20)，空白对照的荧光曲线在基线位 置。图2是显示实时荧光PCR特异性检测鲨鱼的结果，其中使用特异性寡核苷酸引物 对SEQ ID No. 1和SEQ ID No.2及探针SEQ ID No. 3检测，其中荧光曲线依次为1.大青鲨； 2.尖吻斜锯牙鲨；3.澳洲半沙条鲨；4.舒氏星鲨；5.鼠鲨；6.加勒比斜锯牙鲨；7.尖吻鲭 鲨；8.兔银鲛；9.叶吻银鲛；10.平鱼；11.龙俐鱼；12.鲳鱼；13.鳕鱼；14.偏口鱼；15.红 绸鱼；16.黄花鱼；17.草鱼；18.空白对照(ddH20)。图3是以鱼翅为例，检测鱼翅特异性引物和探针组合的灵敏度的结果，其中1-7 为进行实时荧光PCR扩增的DNA溶液的浓度，依次为IOng/ μ L、lng/ μ L、IOOpg/ μ L、IOpg/yLUpg/uL.O. lpg/μ L以及空白对照。图4是以大青鲨、草鱼为例，确定鲨鱼特异性引物和探针组合的相对检测限，其中 1-6为用草鱼DNA将鱼翅DNA以10倍稀释，使其PCR反应体系中鱼翅DNA含量分别为10ng、 lng、lOOpg、10pg、lpg,然后进行检测的结果。图5是市售鱼翅样品检测结果，其中荧光曲线依次为1.大青鲨(阳性对照 )；2.翅 片1 ；3.翅片2 ；4.翅片3 ；5.排翅1 ；6.排翅2 ；7.排翅3 ；8.勾翅1 ；9.勾翅2 ；10.勾翅 3 ；11.空白对照(ddH20)。
具体实施例方式通过实施例的方式对本发明作进一步的说明，但是本发明并不仅仅局限于以下实 施例。实施例1本发明的发明人首次通过PCR克隆并测序了鲨鱼线粒体16S rDNA部分序列。本实施例为通过PCR克隆测序获得的鲨鱼线粒体16S rDNA部分序列。根据线粒体16S rDNA序列在不同鲨鱼纲和硬骨鱼类中具有差异性的特点，设计上 下游引物扩增星鲨。按照Wizard Gel Extraction Kit (Promega，美国)的操作说明对星 鲨PCR产物进行纯化、回收。按TaKaRa pMD19-TVector试剂盒(TaKaRa，日本)的说明书将 纯化产物与PMD19-T Vector连接，连接体系10 μ L，其反应组分为pMD19_T Vector 1 μ L、 PCR产物2 PLddH2O 2yL,Solution I 5 μ L，同时设置阳性和阴性对照。将连接体系置于 室温(22-37°C)反应30min，反应结束后，立即置于冰上。加连接产物于50 μ LTOP感受态 细胞中，轻弹混勻，冰浴30min，42°C准确热激90s，立即置于冰上2min，然后加入800 μ L已 灭过菌的脑心浸液，37°C、200r/min振荡培养lh。5000r/min低速离心lmin，弃600yL上 清，将沉淀混勻，取100 μ L混合液涂于Amp+、X-Gal和IPTG处理的营养琼脂平板上，37°C过 夜培养后置于4°C冰箱中4h。挑取单菌落白斑，在含有终浓度200μ g/mL的Amp的脑心浸 液中在37°C、200r/min振荡过夜培养。(1)阳性克隆鉴定挑取单个白色克隆，进行菌落PCR反应，体系为25yL，其组份 为反应IOXBuffer 2. 5μ L.dNTPs 1 μ L、上下游引物各0. 5 μ L、Taq酶0. 2 μ L，挑取单菌 落作为模板，加水补至25 μ L。反应程序为94°C 5min，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin，40个 循环。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定。(2)测序确定阳性克隆后，挑取该菌落，在含有终浓度200 μ g/mL Amp的5 μ L脑 心浸液中在37°C、200r/min振荡过夜培养。取ImL菌液送生物公司进行测序鉴定。PCR克隆测序得到的星鲨线粒体16S rDNA部分序列如下TCCCGCCTGCCCTGTGACAATGTTCAACGGCCGCGGTATTTTGACCGTGCAAAGGTAGCGTAATCATTT GTCTTTTAAATGAAGACCCGTATGAAAGGCACCACGAGAGTTTAACTGTCTCTATTTTCTAATCAATGAAATTGATC TATTCGTGCAGAAGCGAATATAATAACATTAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTTAAACACTTAAGTTAATTATGTA ACCATTTATTCCTCAGGGTATAAACAAAATATATAATACTTCTAACTTAACTGTTTTTGGTTGGGGTGACCGAGGGG GAAA-ACAAATCCCCCTCATCGATTGAGTACTCAGTAAAATCCTCAGCCTAAACTAGTTTTGGTAGCTTAACTTAAA AGCGTCGACCTTGTAAGTCGAAGATCGAGGGTTTAAACCCCTTCCAAAACACATCAGGGGAAGGAGGGTTAAACTCC TGCCCTTGGCTCCCAAAGCCAAGATTCTGCCTAAACTGCCCCCTGATAGCTG(SEQID No. 7)。
实施例2本实施例为通过使用鲨鱼纲和硬骨鱼类通用引物对及探针测试样品总DNA的提
取质量。通过检测线粒体16S rDNA序列，可以测试样品总DNA的提取质量。Taqman荧光 探针法=TaqMan技术是一种对单管PCR产物进行实时荧光定量检测的技术，在普通PCR扩 增系统中，加入一个与靶基因序列特异互补的双荧光标记探针，利用荧光信号积累实时监 测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。定量步骤①确定CT值(C 表示循环数(Cycle)，T表示荧光域值(Threshold)，即每个反应管内的荧光信号到达设定 的域值时所经历的循环数；②利用标准曲线对未知样品进行定量测定。获得未知样品的CT 值后，从标准曲线计算出该样品的起始拷贝数。每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的 对数存在线性关系，即起始拷贝数越多，CT值越小。反应体系为Mastermix 12.5yL;探 针(10 μ Μ) 0. 5 μ L ；上、下游引物(10 μ Μ)各0. 5 μ L ；模板DNA 5 μ L ；力口 ddH20至总体积为 25 μ L0 反应程序为 95°C IOmin ；95°C 15s ；60°C lmin，40 个循环。本实施例中所使用的用于检测鲨鱼纲和硬骨鱼类的通用引物对由上游引物和下 游引物组成，所述上游引物的碱基序列为SEQ ID No. 4，所述下游引物的碱基序列为SEQ ID No. 5 ；所使用的探针的碱基序列为SEQ IDNo. 6，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团 TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。在本实施例中，检测了 17份样本大青鲨、尖吻斜锯牙鲨、澳洲半沙条鲨、舒氏星 鲨、鼠鲨、加勒比斜锯牙鲨、尖吻鲭鲨、兔银鲛、叶吻银鲛、平鱼、龙俐鱼、鲳鱼、鳕鱼、偏口鱼、 红绸鱼、草鱼、黄花鱼。所使用的检测主要仪器微量移液器(10μ L、100 μ L、1000 μ L Eppendorf)、荧光定量 PCR 仪(ABI 7700 Applied Biosystems, USA))、高速台式离心机(Picol7 Thermo)、高速粉碎机(IKA-ffEARKE GERMANY)、核酸蛋白分析仪(DYY-6C北京六一仪器厂)等检测主要试剂氯仿、异丙醇分别购于北京六合通公司；CTAB裂解液(20g/L CTAB, 1. 4mol/L NaCl，0. lmol/L Tris、0. 02mol/L Na2-EDTA)、CTAB 沉淀液(5g/LCTAB，0. 04mol/L NaCl)、 1. 2mol/L NaCl 均为本实验自行配制；Fast Start Universal Probe Master Mix(Rox)购 于罗氏公司；引物及探针由上海奥科生物科技有限公司合成等。检测主要步骤IDNA 提取待测样品为大青鲨、尖吻斜锯牙鲨、澳洲半沙条鲨、舒氏星鲨、鼠鲨、加勒比斜锯 牙鲨、尖吻鲭鲨、兔银鲛、叶吻银鲛、平鱼、龙俐鱼、鲳鱼、鳕鱼、偏口鱼、红绸鱼、草鱼、黄花
佳.ο称取0. Ig磨碎的样品粉末至一洁净2. OmL离心管中，加入1. 5mLCTAB裂解液， 650C 2h，间期不断混勻几次；8000rpm 15min，取ImL上清液至1只洁净2. OmL离心管中，力口 入700 μ L氯仿，剧烈混勻30s，14500rpm IOmin,分别取650 μ L上清液至洁净2. OmL离心管 中，加入1300 μ L CTAB沉淀液，剧烈混勻30s，室温静置Ih ； 14500rpm 20min，弃上清液，加 入350 μ L 1. 2Μ NaCl，剧烈振荡30s，再加入350 μ L氯仿，剧烈混勻30s，14500rpm IOmin ；分别取上清液320 μ L，加入0. 8倍体积异丙醇，混勻后，"200C lh, 14500rpm 20min,弃上清液，加入500 μ L 70%乙醇，混勻后，14500rpm 20min，弃上清液，晾至风干，加入IOOyL ddH20溶解，4 °C储存备用。2实时荧光PCR检测所用引物和探针引物序列为SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5，探针序列为SEQ ID No. 6，3，端连接有 一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM3实时荧光PCR反应体系Fast Start Universal PCR Master Mix 12. 5μ L探针(10μΜ)0·5μ L上游引物(10μΜ)0·5μ L下游引物(10μ Μ) 0. 5 μ L模板 DNA 5μ L加ddH20至总体积为25 μ L注每次PCR检测均设立相应的空白对照(用配制反应体系的超纯水代替DNA模 板，检测试剂是否受到污染)；4实时荧光PCR反应参数95 "C IOmin95 "C 15s60 °C Imin40个循环。注不同仪器应将PCR各试剂及反应参数做适当调整。如图1所示，用鲨鱼纲和硬骨鱼类通用引物扩增待测样品的DNA时均能在基线以 上出现荧光扩增曲线，表明所有待测样品DNA提取成功。实施例3本实施例为通过如下试验对鲨鱼的引物对和探针进行了特异性和灵敏度验证。通过检测线粒体16S rDNA序列，可以确定鲨鱼引物和探针组合的特异性和 检测灵敏度。反应体系为Fast Start Universal PCR Master Mix 12.5yL;探针 (10μΜ)0· 5μ L ；上、下游引物(10 μ Μ)各0.5yL;模板DNA 5 μ L ；加ddH20至总体积为 25 μ L0 反应程序为 95°C IOmin ；95°C 15s ；60°C Imin, 40 个循环。所使用的检测鱼翅的引物及探针序列为引物序列为SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2，探针序列为SEQ ID No. 3，3，端连接有 一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团HEX。使用本发明的引物对和探针的组合，在样品量极少的情况下，相对于其他引物对 仍能特异、灵敏地扩增出目的片段。所使用的检测主要仪器微量移液器(10μ L、100 μ L、1000 μ L Eppendorf)、荧光定量 PCR 仪(ABI 7700 Applied Biosystems, USA))、高速台式离心机(Picol7 Thermo)、高速粉碎机(IKA-ffEARKE GERMANY)、核酸蛋白分析仪(DYY-6C北京六一仪器厂)等检测主要试剂
氯仿、异丙醇分别购于北京六合通公司；CTAB裂解液(20g/L CTAB, 1. 4mol/L NaCl，0. lmol/L Tris、0. 02mol/L Na2-EDTA)、CTAB 沉淀液(5g/LCTAB， 0. 04mol/L NaCl)、 1. 2mol/L NaCl 均为本实验自行配制；Fast Start Universal Probe MasterMix (Rox)购于 罗氏公司；引物及探针由上海奥科生物科技有限公司合成等。检测主要步骤IDNA 提取检测样本(1)大青鲨、尖吻斜锯牙鲨、澳洲半沙条鲨、舒氏星鲨、鼠鲨、加勒比斜 锯牙鲨、尖吻鲭鲨、兔银鲛、叶吻银鲛、平鱼、龙俐鱼、鲳鱼、鳕鱼、偏口鱼、红绸鱼、草鱼、黄 花鱼等样品用于特异性分析；(2)以大青鲨为例，将提取的DNA溶液用无菌水分别稀释为 IOng/ μ L、lng/ μ L、IOOpg/ μ L、IOpg/ μ L、lpg/ μ L、0. Ipg/ μ L 的浓度，用于分析引物和探 针组合的绝对检测限；(3)以大青鲨、草鱼为例，用大青鲨DNA将草鱼DNA以10倍稀释，使 其PCR反应体系中大青鲨DNA含量分别为10ng、lng、100pg、10pg、lpg,以确定鲨鱼特异性引 物和探针组合的相对检测限。称取0. Ig磨碎的样品粉末至一洁净2. OmL离心管中，加入1. 5mLCTAB裂解液， 650C 2h，间期不断混勻几次；8000rpm 15min，取ImL上清液至1只洁净2. OmL离心管中，力口 入700 μ L氯仿，剧烈混勻30s，14500rpm IOmin,分别取650 μ L上清液至洁净2. OmL离心管 中，加入1300 μ L CTAB沉淀液，剧烈混勻30s，室温静置Ih ； 14500rpm 20min，弃上清液，加 入350 μ L 1. 2Μ NaCl，剧烈振荡30s，再加入350 μ L氯仿，剧烈混勻30s，14500rpm IOmin ； 分别取上清液320 μ L，加入0. 8倍体积异丙醇，混勻后，-200C lh, 14500rpm 20min,弃上 清液，加入500 μ L 70%乙醇，混勻后，14500rpm 20min，弃上清液，晾至风干，加入IOOyL ddH20溶解，4 °C储存备用。2实时荧光PCR检测所用引物和探针引物序列为 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 ；探针序列为SEQ ID No. 3，3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个 荧光报告基团HEX。3实时荧光PCR反应体系Fast Start Universal PCR Master Mix 12. 5μ L探针(10μΜ)0·5μ L上游引物(10μΜ)0·5μ L下游引物(10μΜ)0·5μ L模板 DNA 5μ L加ddH20至总体积为25 μ L注每次PCR检测均设立相应的空白对照(用配制反应体系的超纯水代替DNA模 板，检测试剂是否受到污染)；4实时荧光PCR反应参数95 "C IOmin95 "C 15s60 °C Imin40个循环。
注不同仪器应将PCR各试剂及反应参数做适当调整。如图2所示，利用实时荧光PCR特异性检测鲨鱼的线粒体16s DNA序列时，7种 鲨鱼样品等均出现典型的扩增曲线，而其它样品兔银鲛、叶吻银鲛、平鱼、龙俐鱼、鲳鱼、鳕 鱼、偏口鱼、红绸鱼、草鱼、黄花鱼等及空白对照(ddH20)均未出现扩增曲线，充分说明本实 验设计的引物和探针对鲨鱼样品表现较好的特异性。为确定鲨鱼特异性引物和探针组合的绝对检测限，以大青鲨为例，将提取的DNA 溶液用无菌水分别稀释为 IOng/ μ L、lng/ μ L、IOOpg/ μ L、IOpg/ μ L、lpg/ μ L、0. Ipg/ μ L 的浓度，分别按上述条件进行实时荧光PCR扩增，结果如图3所示。鲨鱼DNA浓度为IOng/ μ L、lng/ μ L、IOOpg/ μ L、IOpg/ μ L、lpg/ μ L时有特异性扩增曲线，而浓度降至lpg/ μ L以 下时， 无特异性扩增曲线出现。实验结果表明建立的实时荧光PCR检测方法能够检出鲨鱼 成分的含量为lpg/yL。以大青鲨、草鱼为例，用草鱼DNA将大青鲨DNA以10倍稀释，使其PCR反应体系中 大青鲨DNA含量分别为10ng、lng、100pg、10pg、lpg,分别按上述条件进行实时荧光PCR扩 增，以确定鲨鱼特异性引物和探针组合的相对检测限(结果见图4)。实验结果说明该方法 检测鲨鱼成分的相对检测限非常低，为10pg。实施例4本发明的发明人通过如下试验对市售鱼翅样品进行了验证。选取9份鱼翅样品(取样于广州海鲜市场)，其中翅片3份、排翅3份、勾翅3份， 进行实时荧光PCR反应，以确定所建立的实时荧光PCR方法是否具有可行性。如图5所示，利用实时荧光PCR检测线粒体16s DNA序列时，大青鲨(阳性对照)、 9份鱼翅样品均在基线以上具有典型的荧光扩增曲线，空白对照扩增曲线均在基线位置，表 明该方法能有效检测出鱼翅成分。虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述，但是本领域技术人员应认识到， 在不偏离本发明的范围或精神的前提下可以对本发明进行多种改变与修饰。因而，本发明 意欲涵盖落在权利要求书及其同等物范围内的所有这些改变与修饰。
权利要求
核酸，其碱基序列如SEQ ID No.7所示。
2.用于实时荧光PCR方法鉴别鱼翅真伪的特异性寡核苷酸引物对及探针，所述引物对 和探针基于权利要求1所述的核酸设计，其中所述引物对由上游引物和下游引物组成，所 述上游引物的碱基序列为SEQ ID No. 1，所述下游引物的碱基序列为SEQ ID No. 2，所述探 针的碱基序列为SEQ ID No. 3，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有 一个荧光报告基团HEX。
3.用于实时荧光PCR方法鉴别鱼翅真伪的试剂盒，所述试剂盒包括根据权利要求2所 述的特异性寡核苷酸引物对及探针。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含另外的通用引物对和探针， 所述另外的通用引物对由碱基序列为SEQ ID No. 4的上游引物和碱基序列为SEQ ID No. 5 的下游引物组成，所述探针的碱基序列为SEQ ID No. 6，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭 基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。
5.鱼翅真伪鉴别的实时荧光PCR检测方法，所述方法包括使用权利要求2所述的特异 性寡核苷酸引物对及探针或权利要求3所述的试剂盒。
6.根据权利要求5所述的实时荧光PCR检测方法，还进一步包括提取鱼翅样品总DNA 的步骤。
7.根据权利要求6所述的实时荧光PCR检测方法，通过使用通用引物对及探针检测样 品DNA的提取质量，所述通用引物由碱基序列为SEQ ID No. 4的上游引物和碱基序列为SEQ ID No. 5的下游引物组成，所述探针的碱基序列为SEQ ID No. 6，在探针的3’端连接有一个 荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。
8.根据权利要求1所述的核酸在鉴别鱼翅真伪中的应用。
9.权利要求2所述的特异性寡核苷酸引物对及探针在鉴别鱼翅真伪中的应用。
10.权利要求3或4所述的试剂盒在鉴别鱼翅真伪中的应用。
全文摘要
本发明涉及用于鱼翅真伪鉴别的寡核苷酸引物及探针。本发明还涉及用于鱼翅真伪鉴别的实时荧光PCR检测方法，所述方法包括使用本发明的特异性寡核苷酸引物及探针。本发明还涉及用于鱼翅真伪鉴别的PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括本发明的特异性寡核苷酸引物和探针。本发明还涉及本发明的特异性寡核苷酸引物及探针在鉴别鱼翅真伪中的应用。使用本发明的PCR检测方法，能够简单、快速、特异且灵敏地鉴别鱼翅的真伪。
文档编号C12N15/11GK101974523SQ201010555570
公开日2011年2月16日 申请日期2010年11月23日 优先权日2010年11月23日
发明者邓婷婷, 陈颖, 韩建勋, 黄文胜 申请人:中国检验检疫科学研究院