专利名称：一种弓形虫检测试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种弓形虫检测试剂盒及其应用。
背景技术：
弓形虫病是由刚地弓形虫引起的一种人畜共患的原虫病。弓形虫可感染多种动 物45种哺乳动物，70种鸟类和5种冷血动物。猫和猫科动物是弓形虫的终末宿主，在终末 宿主体内弓形虫主要侵袭小肠上皮细胞，造成肠道疾病。而在中间宿主(如猪、牛、羊等)体 内，弓形虫侵入肠壁经血液或淋巴进入单核巨噬细胞系统的细胞内寄生，并扩散到全身各 处组织器官，如脑、淋巴结、肝、心、肺、肌肉等，造成全身多器官性的病变，对中间宿主的危 害相当大。猪是弓形虫的主要易感动物，据有关报道显示，我国猪场的弓形虫感染率最高， 约26. 6%，最高可达60%。现有的弓形虫检测方法很多，大致可以分为三大类，即病原学诊断方法、血清学诊 断方法和分子生物学诊断法。病原学诊断方法包括组织学诊断、动物接种试验和细胞培养 法。病原学诊断需要一定数量实验动物，而且实验周期较长。血清学诊断方法包括美蓝染 色试验(DT)、间接荧光抗体试验(IFAT)、凝集试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)。分子生物 学诊断方法主要是聚合酶链式反应(PCR)，该方法比前两种方法快速，灵敏，但需要使用特 殊的PCR仪，不适于基层应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种弓形虫检测试剂盒及其应用。本发明提供的试剂盒基于 环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术，可以快速检测 弓形虫。本发明提供了检测弓形虫的专用引物，由以下三对环介导等温扩增所用引物 组成；一对引物是与弓形虫基因组中GenBank Accession Number AF146527基因(核 苷酸序列如序列表的序列1所示)结合的内侧引物对，一对引物是与弓形虫基因组中 GenBankAccession Number AF146527基因结合的外侧引物对，一对引物是与弓形虫基因组 中GenBank Accession Number AF146527基因结合的环形引物对。所述专用引物的靶区域具体可为序列表的序列1自5’末端第301-511位核苷酸 所示的DNA。所述内侧引物对由上游引物FIP和下游引物BIP组成，所述上游引物FIP的核苷 酸序列具体可为序列表中的序列4，所述下游引物BIP的核苷酸序列具体可为序列表中的 序列5 ；所述外侧引物对由上游引物F3和下游引物B3组成，所述上游引物F3的核苷酸序 列具体可为序列表中的序列2，所述下游引物B3的核苷酸序列具体可为序列表中的序列3 ； 所述环形引物对由上游引物LF和下游引物LB组成，所述上游引物LF的核苷酸序列具体可 为序列表中的序列6，所述下游引物LB的核苷酸序列具体可为序列表中的序列7。F3 :5，-TGGGAAGCGACGAGAGTC-3，(序列表的序列 2)；
B3 :5，-TGGATTCCTCTCCTACCCCT(序列表的序列 3)；FIP :5，-CCGGTGTCTCTTTTTCCACCCTTTTTTCGGAGAGGGAGAAGATGTTT-3，(序列表的序 列4)；BIP :5，-TCGTGGTGATGGCGGAGAATTTTCCTCCTCCCTTCGTCCAA-3，(序列表的序列 5)；LF :5，-GGAAAAGCAGCCAAGCCG-3，(序列表的序列 6)；LB :5，-GAATTGAAGAGTGGAGAAGAGGGCG-3，(序列表的序列 7)。应用所述专用引物检测弓形虫的原理如下根据弓形虫GenBank Accession Number AF146527基因(序列表的序列1)部分 区域(序列1自5’末端第301-511位核苷酸)设计一组用于环介导等温扩增的引物，即内 侧引物对(内侧上游引物FIP和内侧下游引物BIP)、外侧引物对(外侧上游引物F3和外侧 下游引物B3)和环形引物对(环形上游引物LF和环形下游引物LB)。三对引物和所述区域 变异区域的八个特定区域的序列完全配对(见表1)，可以确保反应的彻底进行，也保证了 检测方法的特异性。表1专用引物与序列1所示基因的结合区域
权利要求
1.一种检测弓形虫的专用引物，由以下三对环介导等温扩增所用引物组成；一对引物 是与弓形虫基因组中GenBank Accession Number AF146527基因结合的内侧引物对，一对 引物是与弓形虫基因组中GenBank Accession Number AF146527基因结合的外侧引物对， 一对引物是与弓形虫基因组中GenBank Accession Number AF146527基因结合的环形引物对。
2.如权利要求1所述的专用引物，其特征在于所述内侧引物对由上游引物FIP和下 游引物BIP组成，所述上游引物FIP的核苷酸序列是序列表中的序列4，所述下游引物BIP 的核苷酸序列是序列表中的序列5 ；所述外侧引物对由上游引物F3和下游引物B3组成，所 述上游引物F3的核苷酸序列是序列表中的序列2，所述下游引物B3的核苷酸序列是序列表 中的序列3 ；所述环形引物对由上游引物LF和下游引物LB组成，所述上游引物LF的核苷 酸序列是序列表中的序列6，所述下游引物LB的核苷酸序列是序列表中的序列7。
3.权利要求1或2所述的专用引物在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒用于检测待测 样本中是否含有弓形虫和/或辅助鉴定弓形虫。
4.一种含有权利要求1或2所述的专用引物的试剂盒；所述试剂盒用于检测待测样本 中是否含有弓形虫和/或辅助鉴定弓形虫。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括溶液B；所述溶液B由溶 剂和溶质组成；所述溶剂为水；所述溶质及其浓度如下所述上游引物F3为2. 4-3. 6pmol/ μ 1，所述下游引物Β3为2. 4-3. 6pmol/μ 1，所述上游引物FIP为20-28pmol/μ 1，所述下 游引物BIP为20-28ρπιΟ1/μ 1，所述上游引物LF为IO-Hpmol/μ 1，所述下游引物LB为 10-14pmol/y 1。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述溶液B中，所述上游引物F3为3pmol/ μ 1，所述下游引物Β3为3ρπι01/μ 1，所述上游引物FIP为24ρπι01/μ 1，所述下游引物BIP 为24ρπι01/μ 1，所述上游引物LF为12pm0l/l·! 1，所述下游引物LB为12pmol/y L·
7.如权利要求4或5或6所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括溶液A；所述 溶液A由溶剂和溶质组成；所述溶剂为水；所述溶质及其浓度如下KC1为16. 67nmol/yl, MgSO4 · 7H20 为 13. 33nmol/y 1，(NH4)2SO4 为 16. 67nmol/y 1，钙黄绿素为 0. 083nmol/y 1， MnCl2 · 4H20 为 lnmol/μ 1，四种脱氧核苷酸各 2. 33nmol/y 1，甜菜碱为 0. 33ymol/y 1，IM pH8. 8Tris-HCl 为 33· 33nmol/y 1，Tween-20 为 0. (体积百分含量)，Bst DNA 聚合酶 为 0. 80U/y 1。
8.—种检测来自死亡动物的样品中是否携带弓形虫的方法，是用权利要求1或2所 述专用引物对来自死亡动物的样品的总DNA进行环介导等温扩增反应，检测扩增产物，确 定来自死亡动物的样品中是否携带弓形虫；所述环介导等温扩增反应的条件为60-65°C、 30-90min。
9.权利要求1或2所述专用引物或权利要求4至7中任一所述试剂盒在检测待测样本 中是否含有弓形虫中的应用。
10.权利要求1或2所述专用引物或权利要求4至7中任一所述试剂盒在辅助鉴定弓 形虫中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种弓形虫检测试剂盒及其应用。本发明提供的试剂盒，包括三对引物，即与弓形虫基因组中Gen Bank Accession Number AF146527基因结合的内侧引物对、外侧引物对和环形引物对。本发明的弓形虫检测试剂盒，检测灵敏度高，最低可检测出10个拷贝的靶DNA，操作简单方便，特别适于养猪场的常规体检，基层临床医学检测工作及现场即时检测。
文档编号C12Q1/68GK102002531SQ20101056117
公开日2011年4月6日 申请日期2010年11月23日 优先权日2010年11月23日
发明者吴文学, 朱引洁, 索勋, 邹杰, 郭盼盼 申请人:中国农业大学