专利名称：一种p75NTR-ECD在防治阿尔茨海默病药物中应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物医学领域，特别是一种防治阿尔茨海默病的药物。
背景技术：
阿尔茨海默病的英文词是Alzheimer，s disease，通常缩写简称为AD。是以痴呆为特征的进行性神经系统退行性疾病，是当前危害老年人健康和生命的重要疾病。目前全球有AD患者约沈00万人，每年新发病例500万，预计到2040-2050年全球将共有AD患者 1亿以上。AD已成为当前人口死亡的主要原因，65岁以上人群死亡的第4-5位原因。AD给家庭和社会带来的经济负担，在所有疾病中排位三，仅次于心脏病和癌症。中国面临着严峻的人口老龄化形势，是世界上老年人口最多的国家。中国目前约有AD患者500万，每年新发病例200万-300万；到2050年，我国将有AD患者800万-1200万，每年新发病例450 万-600万。在未来50年中，AD将成为中国一个非常沉重的经济和社会负担。目前还没有能够预防AD发生、延缓或阻止AD病情进展的方法和药物。在AD的临床治疗方面，迄今为止仅有几个药物被美国食品与药品管理局批准用于轻度和中度AD的治疗，但这些药物都是神经递质调节药物，仅能暂时改善部分患者的认知功能，不能延缓或阻止病情进展。Beta淀粉样肽(Amyloid-beta，通常缩写为Aβ )被认为是AD的致病物质。Αβ自身聚合能力强，形成比Αβ单体毒性更强的寡聚体和纤维。因此，如何抑制Αβ聚集、清除脑内Αβ和阻断Αβ的神经毒性作用已经成为研究人员丞待解决的问题。p75NTR是神经生长因子受体，其编码的核苷酸和氨基酸序列在Genbank中的编号为ΝΜ_002507。在AD患者脑内p75NTR表达增加。p75NTR是Αβ的受体，Aβ通过与p75NTR 结合而引起脑内神经元死亡和神经末梢变性。P75NTR在代谢过程中受到酶的切割，释放其胞外段(以下简称P75NTR-ECD)，该胞外段在阿尔茨海默病发病中的作用目前未见相关报道。实验证明，P75NTR-E⑶作为p75NTR的Αβ结合部位，具有抑制Αβ聚集成寡聚体和纤维、促进Αβ纤维解聚、清除脑内Αβ的作用；同时还能拮抗Αβ的神经毒性作用(包括神经元死亡和神经末梢变性)。目前已知，人免疫球蛋白IgG的Fc段能增强与其相融合的蛋白的稳定性。编码人Fc段的核苷酸和氨基酸序列在Genbank中的编号为ΧΜ_002348257. 1。实验证明，将 P75NTR-ECD和Fc段联接在一起构建成融合蛋白(以下简称p75NTR_ECD/Fc)，与p75NTR_ECD 相比，？75附1 4^汗(3抑制4 0聚集、促进Αβ纤维解聚和拮抗Αβ神经毒性的作用更强， 在体内的半衰期也更长。p75NTR-E⑶和p75NTR_E⑶/Fe在AD防治中的作用在全世界范围内未见报道，这两种蛋白质可作为预防和治疗AD的药物。
发明内容
本发明的目的就是把p75NTR-E⑶或p75NTR_E⑶/Fe应用在制备防治阿尔茨海默病的药物中，用P75NTR-E⑶或p75NTR-E⑶/Fe制备的药物可以抑制A β聚集、促进A β纤维的解聚，清除脑内Αβ ；同时还能够阻断Αβ的神经毒性作用(包括神经元死亡和神经末梢变性)。本发明的目的是通过这样的技术方案实现的，它包括有p75NTR受体的胞外段 P75NTR-E⑶，p75NTR-E⑶的核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO. 1所述的核苷酸序列， P75NTR-E⑶的氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO. 2所述的氨基酸序列。在本发明中，P75NTR-E⑶是按照如下的方法进行制备的
选用pet28a为原核表达载体，克隆位点选用Nde I和B10I酶切位点，构建 pet28a-p75NTR-ECD原核表达载体，步骤如下设计上游引物5’ -CCGCATATGGCACCTGAAC TCCTGGGGGGACC 和下游引物5，-CCGCTCGAGTCATTTACCCGGAGACAGGGAG-3，，以人 cDNA 为模板，PCR克隆p75NTR-E⑶基因。胶回收纯化目的产物p75NTR_E⑶。再用限制性内切酶 Nde I和BioI酶切pet28a质粒，胶回收大片段。同样酶切处理PCR产物p75NTR_E⑶，胶回收纯化酶切产物。用jM DNA连接酶连接p75NTR-E⑶和pet28a酶切产物，得到重组质粒 pet28a-p75NTR-E⑶，转化大肠杆菌Dffia感受态细胞，挑选阳性克隆，并测序验证，确认编码阅读框。P75NTR-ECD蛋白的诱导表达将鉴定正确的重组质粒pet28a-p75NTR_ECD转化 CaCl2法制备的五col . BL-21感受态细胞，挑取新鲜转化的单菌落，接种于IOml含50 μ g/ ml硫酸卡那霉素的LB培养基中，37° C振荡培养过夜。按1 100比例将过夜菌菌液转接于 200ml含50μ g/ml硫酸卡那霉素的LB培养基中，37° C振荡培养至0D600 0. 5 0. 6， 加IPTG至终浓度为0. 1-0. 5mmol/L，移至30° C继续培养4小时。离心收集菌体，菌体可进行纯化或冻存于-70° C。将诱导表达的菌体按原菌液1 / 10的体积重悬于PBS中，后加入50mmol/L PMSF 15 μ 1后超声破碎细胞(6 X 10秒X 40赫兹)，再加入终浓度为1%的 Triton X-100,轻轻振荡20min，于4° C，12000r/m离心15分钟，收集上清，0. 45微米孔径滤膜过滤，获得P75NTR-E⑶蛋白粗制样品。p75NTR-E⑶蛋白的纯化超声破碎获得的p75NTR_E⑶蛋白样品首先经离子交换层析纯化，方法如下(1) DEAE-纤维素的活化取IgDEAE32或52，加入蒸馏水浸泡过夜， 其间换几次水，每次除去细小颗粒。抽干，改用0. 5ml/LNa0H溶液浸泡1小时以上，抽干，用无离子水漂洗，使PH至8左右。再改用0. 5ml/LHCl溶液浸泡1小时以上，用无离子水洗至pH6左右。(2)装柱用0. 02mol/L, pH6. 7，磷酸盐缓冲溶液浸泡已处理好的DEAE—纤维素，并更换1 2次。然后搅拌均勻，灌入层析柱中。0.02mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲溶液平衡。(3)上样洗脱缓慢上样后，用0. 02mol/L, pH6. 7磷酸盐缓冲溶液洗脱，控制流速为 lml/min，收集洗脱液，在此条件下在收集液中首先出现的蛋白质即为p75NTR_ECD蛋白。将上述离子交换层析得到的p75NTR-ECD蛋白进一步用疏水柱纯化疏水填料为 Phenyl s印harose，纯化时所用缓冲液为Buffer A:50mM PBS,0. 6M 硫酸铵，ρΗ7· 0 ;Buffer B: 50mM PBS，pH7.0。使用Buffer A平衡柱子至^Onm处的吸收值达到基线位置且保持不变，再用Buffer A稀释样品，后上样；再用Buffer B行一个线性梯度(10倍柱体积)洗脱，流速:3ml/min，硫酸铵浓度从0.6M—直到0M。监测并收集蛋白。上述获得的样品再经 sephadex G200分子筛层析，首先用pH7. 5 PBS平衡s印hadex G200分子筛柱子，将约柱体积1%样品加入分子筛柱，后用相同缓冲液洗脱蛋白，流速15ml/min，监测并收集蛋白样品。
4液测定其蛋白含量、活性和纯度后，脱盐浓缩、分装，即得到P75NTR-E⑶蛋白，-20° C低温保存备用。Αβ在产生过程中因酶切不同，产生具有38-42个氨基酸的不同Αβ类型，其中含 42个氨基酸的A β 42是A β的一个重要类型，其聚集特性和神经毒性作用最强，常作为A β 的代表，因此本发明以Αβ 42为实验对象。经实验证明，P75NTR-E⑶具有抑制Αβ42单体形成寡聚体和纤维，并具有促进 Αβ 42纤维解聚的作用。将制备的P75NTR-ECD蛋白注射到大脑的海马中，1周以后检测，发现p75NTR-E⑶蛋白注射部位的A β水平减少25%，表明p75NTR_E⑶具有清除脑内A β的作用。同时，p75NTR-E⑶还能拮抗A β 42的神经毒性作用(包括神经元死亡和神经末梢变性)。 将制备的P75NTR-E⑶注射到小鼠静脉中，通过ELISA的方法检测其水平，发现p75NTR_E⑶ 血液半衰期为4小时。本发明也可以是这样的技术方案，它是将所述的P75NTR-E⑶基因与人免疫球蛋白Fc段基因相连接，形成编码P75NTR-E⑶/Fe的DNA，在以此为模板，形成p75NTR_E⑶/ Fc蛋白。P75NTR-E⑶/Fe的核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO. 3所述的核苷酸序列， P75NTR-E⑶/Fe的氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO. 4所述的氨基酸序列。所述的P75NTR-E⑶/Fe是按照如下的方法进行制备的
首先选用pet22-b(+)作为原核表达载体，克隆位点选用Nde I，BioI酶切位点，构建pet22-b(+)-p75NTR-E⑶/Fe融合基因。步骤如下利用重叠引物PCR方法构建融合基因 p75NTR-ECD/Fc。设计引物 1 :5，-CCGCATATGAAGGAGGCATGCCCCACAGGC,弓丨物 2 :5，-T GGGCACGGTGGGCATGTGTGAGTTTTGTCTGTAATCCAACGGCCAGGGATC ；引物 3 :5’ -GACAAAACTCAC ACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACC,和引物 4 :5’ -CCGCTCGAGTCATTTACCCGG AGACAGGGAG-3’。其中，引物2和引物3的5’端含有30个互补碱基，为加入的链接序列 GACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCA。以人cDNA为模板，引物1和引物2用于PCR克隆 P75NTR-E⑶基因片段，胶回收纯化；引物3和引物4用于PCR克隆Fc基因片段，回收纯化； 然后将纯化的P75NTR-E⑶和Fc基因产物按照1 1混合，加入到不含引物的PCR反应体系中反应94° C，30秒；68° C，2分钟；反应20个循环，然后以反应液为模板，加入引物1和引物4进行PCR反应，胶回收纯化目的产物p75NTR-ECD/Fc融合基因。再用限制性内切酶 Nde I和BioI酶切pet22-b(+)质粒，胶回收大片段。同时酶切处理p75NTR_ECD/Fc，胶回收纯化酶切产物。用jM DNA连接酶连接p75NTR-E⑶/Fe和pet22_b (+)酶切产物，得到重组载体pet22b+-p75NTR-ECD/Fc，转化大肠杆菌Dffia感受态细胞，挑选阳性克隆，并测序验证序列，确认编码框。P75NTR-E⑶/Fe融合蛋白的诱导表达与纯化将鉴定正确的重组质粒 pet22b+p75NTR-ECD/Fc转化CaC12法制备的五col . BL-21感受态细胞，挑取新鲜转化的单菌落，接种于IOml含50yg/ml硫酸卡那霉素的LB培养基中，37° C振荡培养过夜。按 1 100比例将过夜菌菌液转接于200ml含50 μ g/ml硫酸卡那霉素的LB培养基中，37° C振荡培养至0D600 0. 5 0. 6，加IPTG至终浓度为0. 1-0. 5mmol/L，移至30° C继续培养4 小时。离心收集菌体，菌体可进行纯化或冻存于-70° C。将诱导表达的菌体按原菌液1/10 的体积重悬于PBS中，后加入50mmol/L PMSF 15 μ 1后超声破碎细胞(6X 10secX40hz)，再加入终浓度为1%的Triton X-100,轻轻振荡20分钟，于4° C，12000r/m离心15分钟，收集上清，作为蛋白样品，0.45微米孔径滤膜过滤；将蛋白样品加入kpharose-SPA层析柱， 以20mM PBS, pH7. 4洗脱平衡，流速0. 5ml/min。p75NTR_ECD/Fc被柱上的SPA吸附住，其它蛋白质随洗脱液流出；再以PH4. 0柠檬酸缓冲液进行洗脱，即为提纯的p75NTR-ECD/Fc ； 将收集的P75NTR-E⑶/Fe液测定其蛋白含量、活性和纯度后，脱盐浓缩、分装、_20°C低温保存备用。实验证明，p75NTR-E⑶/Fe不仅具备前述p75NTR_E⑶所具有的作用，而且其在体内的半衰期比P75NTR-E⑶更长，在抑制A β 42聚集、促进A β 42纤维解聚、清除脑内A β沉积和拮抗A β神经毒性(包括神经元死亡和神经末梢变性)等方面的作用也比P75NTR-E⑶更强。由于采用了上述技术方案，本发明具有如下的作用
1.抑制Αβ聚集成寡聚体和纤维，促进A β纤维的解聚，并清除脑内Αβ。2.拮抗A β的神经毒性作用(包括神经元死亡和神经末梢变性)。本发明提供了发挥多重作用的AD防治新药物，具有广阔的临床应用前景。
本发明的
如下
图1是p75NTR-E⑶和p75NTR-E⑶/Fe抑制A β 42形成寡聚体的比较图。图2是p75NTR-ECD和p75NTR_ECD/Fc抑制A β 42形成纤维的比较图； 图3是p75NTR-ECD和p75NTR_ECD/Fc促进A β 42纤维解聚的比较图4是p75NTR-E⑶和p75NTR_E⑶/Fe海马注射后清除局部总A β的比较图； 图5是p75NTR-E⑶和p75NTR_E⑶/Fe阻断A β 42神经毒性作用的示意图； 图6是p75NTR-E⑶和p75NTR_E⑶/Fe减轻Αβ 42引起的神经突生长抑制的示意图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明
它包括有P75NTR-E⑶，p75NTR-E⑶的核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO. 1所述的核苷酸序列，P75NTR-E⑶的氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO. 2所述的氨基酸序列。在本发明中，p75NTR-E⑶是按照如下的方法进行制备的
选用pet28a为原核表达载体，克隆位点选用Nde I和B10I酶切位点，构建 pet28a-p75NTR-ECD原核表达载体，步骤如下设计上游引物5’ -CCGCATATGGCACCTGAAC TCCTGGGGGGACC 和下游引物5，-CCGCTCGAGTCATTTACCCGGAGACAGGGAG-3，，以人 cDNA 为模板，PCR克隆p75NTR-E⑶基因。胶回收纯化目的产物p75NTR_E⑶。再用限制性内切酶 Nde I和BioI酶切pet28a质粒，胶回收大片段。同样酶切处理PCR产物p75NTR_E⑶，胶回收纯化酶切产物。用jM DNA连接酶连接p75NTR-E⑶和pet28a酶切产物，得到重组质粒 pet28a-p75NTR-E⑶，转化大肠杆菌Dffia感受态细胞，挑选阳性克隆，并测序验证，确认编码阅读框。p75NTR-ECD蛋白的诱导表达将鉴定正确的重组质粒pet28a-p75NTR_ECD转化 CaCl2法制备的五col . BL-21感受态细胞，挑取新鲜转化的单菌落，接种于IOml含50 μ g/ ml硫酸卡那霉素的LB培养基中，37° C振荡培养过夜。按1 100比例将过夜菌菌液转接于200ml含50μ g/ml硫酸卡那霉素的LB培养基中，37° C振荡培养至0D600 0. 5 0. 6， 加IPTG至终浓度为0. 1-0. 5mmol/L，移至30° C继续培养4小时。离心收集菌体，菌体可进行纯化或冻存于-70° C。将诱导表达的菌体按原菌液1 / 10的体积重悬于PBS中，后加入50mmol/L PMSF 15 μ 1后超声破碎细胞(6 X 10秒X 40赫兹)，再加入终浓度为1%的 Triton X-100,轻轻振荡20min，于4° C，12000r/m离心15分钟，收集上清，0. 45微米孔径滤膜过滤，获得P75NTR-E⑶蛋白粗制样品。p75NTR-E⑶蛋白的纯化超声破碎获得的p75NTR_E⑶蛋白样品首先经离子交换层析纯化，方法如下(1) DEAE-纤维素的活化取IgDEAE32或52，加入蒸馏水浸泡过夜， 其间换几次水，每次除去细小颗粒。抽干，改用0. 5ml/LNa0H溶液浸泡1小时以上，抽干，用无离子水漂洗，使PH至8左右。再改用0. 5ml/LHCl溶液浸泡1小时以上，用无离子水洗至pH6左右。(2)装柱用0. 02mol/L, pH6. 7，磷酸盐缓冲溶液浸泡已处理好的DEAE—纤维素，并更换1 2次。然后搅拌均勻，灌入层析柱中。0.02mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲溶液平衡。(3)上样洗脱缓慢上样后，用0. 02mol/L, pH6. 7磷酸盐缓冲溶液洗脱，控制流速为 lml/min，收集洗脱液，在此条件下在收集液中首先出现的蛋白质即为p75NTR_ECD蛋白。将上述离子交换层析得到的p75NTR-ECD蛋白进一步用疏水柱纯化疏水填料为 Phenyl s印harose，纯化时所用缓冲液为Buffer A:50mM PBS,0. 6M 硫酸铵，ρΗ7· 0 ;Buffer B: 50mM PBS，pH7.0。使用Buffer A平衡柱子至^Onm处的吸收值达到基线位置且保持不变，再用Buffer A稀释样品，后上样；再用Buffer B行一个线性梯度(10倍柱体积)洗脱，流速:3ml/min，硫酸铵浓度从0.6M—直到0M。监测并收集蛋白。上述获得的样品再经 sephadex G200分子筛层析，首先用pH7. 5 PBS平衡s印hadex G200分子筛柱子，将约柱体积1%样品加入分子筛柱，后用相同缓冲液洗脱蛋白，流速15ml/min，监测并收集蛋白样品。 液测定其蛋白含量、活性和纯度后，脱盐浓缩、分装，即得到P75NTR-E⑶蛋白，-20° C低温保存备用。经实验证明，p75NTR-E⑶具有抑制A β 42单体形成寡聚体和纤维，并具有促进 Αβ 42纤维解聚的作用。将制备的P75NTR-ECD蛋白注射到大脑的海马中，1周以后检测， 发现p75NTR-E⑶蛋白注射部位的A β水平减少25%，表明p75NTR_E⑶具有清除脑内A β 的作用。同时，P75NTR-E⑶还具有拮抗A β 42的神经毒性作用(包括神经元死亡和神经末梢变性)。将制备的P75NTR-ECD注射到小鼠静脉中，通过ELISA的方法检测其水平，发现 P75NTR-E⑶血液半衰期为4小时。本发明也可以是这样的技术方案，它是将所述的P75NTR-E⑶基因与人免疫球蛋白Fc段基因相连接，形成编码P75NTR-E⑶/Fe的DNA，在以此为模板，形成p75NTR_E⑶/ Fc蛋白。P75NTR-E⑶/Fe的核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO. 3所述的核苷酸序列， P75NTR-E⑶/Fe的氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO. 4所述的氨基酸序列。所述的p75NTR-E⑶/Fe是按照如下的方法进行制备的
首先选用pet22_b(+)作为原核表达载体，克隆位点选用Nde I，XhoI酶切位点，构建pet22-b(+)-p75NTR-E⑶/Fe融合基因。步骤如下利用重叠引物PCR方法构建融合基因 p75NTR-ECD/Fc。设计引物 1 :5，-CCGCATATGAAGGAGGCATGCCCCACAGGC 和弓丨物 2 :5，-T GGGCACGGTGGGCATGTGTGAGTTTTGTCTGTAATCCAACGGCCAGGGATC ；引物 3 :5_GACAAAACTCAC ACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACC 和引物 4 :5，-CCGCTCGAGTCATTTACCCGGAGACAGGGAG-3’。其中，引物2和引物3的5’端含有30个互补碱基，为加入的链接序列 GACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCA。以人cDNA为模板，引物1和引物2用于PCR克隆 P75NTR-E⑶基因片段，胶回收纯化；引物3和引物4用于PCR克隆Fc基因片段，回收纯化； 然后将纯化的P75NTR-E⑶和Fc基因产物按照1 1混合，加入到不含引物的PCR反应体系中反应94° C，30秒；68° C，2分钟；反应20个循环，然后以反应液为模板，加入引物1和引物4进行PCR反应，胶回收纯化目的产物p75NTR-ECD/Fc融合基因。再用限制性内切酶 Nde I和BioI酶切pet22-b(+)质粒，胶回收大片段。同时酶切处理p75NTR_ECD/Fc，胶回收纯化酶切产物。用jM DNA连接酶连接p75NTR-E⑶/Fe和pet22_b (+)酶切产物，得到重组载体pet22b+-p75NTR-ECD/Fc，转化大肠杆菌Dffia感受态细胞，挑选阳性克隆，并测序验证序列，确认编码框。p75NTR-E⑶/Fe融合蛋白的诱导表达与纯化将鉴定正确的重组质粒 pet22b+p75NTR-ECD/Fc转化CaC12法制备的五col . BL-21感受态细胞，挑取新鲜转化的单菌落，接种于IOml含50yg/ml硫酸卡那霉素的LB培养基中，37° C振荡培养过夜。按 1:100比例将过夜菌菌液转接于200ml含50 μ g/ml硫酸卡那霉素的LB培养基中，37° C振荡培养至0D600 0. 5 0. 6，加IPTG至终浓度为0. 1-0. 5mmol/L，移至30° C继续培养4 小时。离心收集菌体，菌体可进行纯化或冻存于-70° C。将诱导表达的菌体按原菌液1/10 的体积重悬于PBS中，后加入50mmol/L PMSF 15 μ 1后超声破碎细胞(6X 10secX40hz)，再加入终浓度为1%的Triton X-100,轻轻振荡20分钟，于4° C，12000r/m离心15分钟，收集上清，作为蛋白样品，0.45微米孔径滤膜过滤；将蛋白样品加入kpharose-SPA层析柱， 以20mM PBS, pH7. 4洗脱平衡，流速0. 5ml/min。p75NTR_ECD/Fc被柱上的SPA吸附住，其它蛋白质随洗脱液流出；再以PH4. 0柠檬酸缓冲液进行洗脱，即为提纯的p75NTR-ECD/Fc ； 将收集的P75NTR-E⑶/Fe液测定其蛋白含量、活性和纯度后，脱盐浓缩、分装、_20°C低温保存备用。实验证明，p75NTR-E⑶/Fe不仅具备前述p75NTR_E⑶所具有的作用，而且其在体内的半衰期比P75NTR-E⑶更长，在抑制A β 42聚集、促进A β 42纤维解聚、清除脑内A β沉积和拮抗Αβ神经毒性(包括神经元死亡和神经末梢变性)等方面的作用也比P75NTR-E⑶更强。下面结合附图和实验例对发明作进一步说明
实验例1 :p75NTR-ECD和p75NTR_ECD/Fc抑制A β 42寡聚体形成将2. 5 μ g A β 42 (终浓度为20 mM)分别与p75NTR_ECD/Fc (终浓度为IOmM)、 P75NTR-E⑶(终浓度为IOmM)或人IgG (以下简称HulgG，终浓度为IOmM)混合，4 °C孵育 1天。以等量A β 42 (终浓度为20 mM)不孵育，或等量A β 42 (终浓度为20 mM)单独4 °C 孵育为对照。然后行蛋白电泳，采用6E10-biotin抗体作蛋白印记检测，测定Αβ42寡聚体条带的含量。如图1所示，与Αβ 42单独孵育组(Ab)比较(为方便比较，将此组的Aβ 42寡聚体含量作为100%)，HuIgG与Αβ 42共同孵育组(Ab+HuIgG)的Αβ 42寡聚体含量为78%， Aβ 42和p75NTR-ECD共同孵育组(Ab+p75NTR_ECD)的Αβ 42寡聚体含量为36%, Aβ 42和 p75NTR-ECD/Fc共同孵育组(Ab+p75NTR_ECD/Fc)的A β 42寡聚体含量为25%。上述结果表明p75NTR-ECD和p75NTR_ECD/Fc均具有抑制A β 42单体形成寡聚体的作用，p75NTR-ECD/Fc的作用效果强于p75NTR-E⑶。实验例2 p75NTR-ECD 和 p75NTR_ECD/Fc 抑制 A β 42 纤维形成
将2. 5 μ g A β 42 (终浓度为20 mM)分别与p75NTR_ECD/Fc (终浓度为IOmM)、 P75NTR-E⑶(终浓度为IOmM)或HuIgG (终浓度为IOmM)混合，37 °C孵育4天。以等量 Αβ42 (终浓度为20 mM)不孵育，或等量A β 42 (终浓度为20 mM)单独37 °C孵育为对照。 然后加入Thioflavine T，检测荧光强度(激发波长450nm，发射波长482nm)。荧光强度越高，表明Aβ纤维量越多。如图2所示，与Αβ单独孵育组(Ab)比较(为方便比较，将此组的荧光强度作为 100%)，HuIgG 与 Αβ 共同孵育组(Ab+HuIgG)荧光强度为 103%，Aβ 42 与 p75NTR_ECD 共同孵育组(Ab+p75NTR-ECD)的荧光强度为25%，Aβ 42与p75NTR_ECD/Fc共同孵育组 (Ab+p75NTR-ECD/Fc)的荧光强度 10%。上述结果表明p75NTR_ECD 和 p75NTR_ECD/Fc 均具有抑制A β 42纤维形成的作用，p75NTR-E⑶/Fe的作用效果强于p75NTR_E⑶。实验例3 :p75NTR-ECD 和 p75NTR_ECD/Fc 促进 A β 42 纤维的解聚
首先将2. 5 μ g A β 42溶于DMEM (终浓度20 mM),37 °C孵育4天，形成A β 42纤维。 将形成的Aβ 42纤维和p75NTR-ECD (终浓度10 μ Μ)、p75NTR_ECD/Fc (终浓度10 μ Μ)或 HuIgG (终浓度10 μ Μ)混合，37 °C孵育3天。然后加入Thioflavine T，检测荧光强度(激发波长450nm，发射波长482nm)。荧光强度越高，表明Αβ纤维量越多。如图3所示，结果显示，与A β纤维单独孵育组(Ab )比较(为方便比较，将此组荧光作为100%)，Aβ纤维与P75NTR-ECD共同孵育组(Ab+p75NTR_ECD)荧光强度为56%，Αβ纤维与p75NTR-ECD/Fc共同孵育组(Ab+p75NTR_ECD/Fc)后荧光强度为35%，A β纤维与HuIgG 共同孵育后(Ab+HuIgG)荧光强度为92%。上述结果表明p75NTR-E⑶和p75NTR_E⑶/Fe均具有促进A β 42纤维解聚的作用，p75NTR-E⑶/Fe的作用强于p75NTR_E⑶。4 海马注射p75NTR_ECD/Fc对Αβ的清除作用
采用9月龄Mo/Hu APPswe PSldE9 AD小鼠。该小鼠为双重转基因小鼠，载有人早老素蛋白-1 DeltaE9突变体和人APP瑞典突变体(APPSwe，KM 593/594 NL)嵌合基因，在脑内产生大量的Αβ沉积，是公认的AD动物模型。将小鼠随机分为4组，每组8只。小鼠麻醉后，在不同组小鼠左侧海马分别注入2μ 1 p75NTR-ECD (Inmol )，p75NTR_ECD/Fc (lnmol), HuIgG (lnmol)或PBS，右侧海马注入2 μ 1 PBS。1周后取双侧海马，采用ELISA方法测定左右两侧海马的Aβ含量。左侧海马Aβ相对含量=左侧海马Aβ含量/右侧海马Aβ含量。如图4所示，与对照组(PBS)比较(为方便比较，该组A β含量作为100%)， P75NTR-ECD 注射组(p75NTR_ECD)海马的 Αβ 含量为 67%，p75NTR_ECD/Fc 注射组 (p75NTR-ECD/Fc)海马Αβ含量为45%，而HuIgG注射组(HuIgG)海马A β含量为98%。上述结果表明p75NTR-E⑶和p75NTR-E⑶/Fe具有清除脑内A β的作用，p75NTR_E⑶/Fe的作用强于 P75NTR-ECD。实验例5 :p75NTR_E⑶和p75NTR_E⑶/Fe对A β致神经细胞死亡的拮抗作用
采用神经细胞株R2L1 (表达P75NTR)，于96孔板中培养，细胞密度为0.5X IO4 cells/ 孔。培养基DMEM中加入20 μ M A β 42，然后加入p75NTR_ECD (终浓度10 μ M)、p75NTR_ECD/ Fc (终浓度10 μ Μ)或HuIgG (终浓度10 μ Μ)。同时设立仅以DMEM培养基培养的细胞作为正常对照。三复孔。在37°C孵育20小时后，然后加入MTT，孵育4小时。在加入溶解液， 37° C再孵育12小时，600nm处读取光密度值。光密度值越高，表明细胞存活数越多。如图5所示，结果表明，与正常对照组比较(为方便比较，将此组的光密度值设为 100%)，HuIgG 组(Ab+HuIgG)的光密度值为 32%，p75NTR_ECD 组(Ab+p75NTR_ECD)的光密度值为 68%，p75NTR-ECD/Fc 组(Ab+p75NTR_ECD/Fc)的光密度值为 90%。表明 p75NTR_ECD 和p75NTR-E⑶/Fe具有拮抗A β 42神经毒性的作用，p75NTR_E⑶/Fe的作用效果强于 P75NTR-ECD。实验例6 :p75NTR_E⑶和p75NTR_E⑶/Fe对A β致神经突起变性的拮抗作用
采用神经细胞株SH-SY5Y，于M孔板中培养，细胞密度为0. 5 X IO3 cells/孔，在培养基DMEM中加入ΙΟμΜ all-trans retinoic acid, 37。C培养7天。然后在培养体系中加入 A β 42 (终浓度 1 μ Μ),同时加入 p75NTR-ECD (终浓度 1 μ M)、p75NTR_ECD/Fc (终浓度 1 μ Μ) 或HuIgG (终浓度ΙμΜ)。同时设立仅以DMEM培养基培养的细胞作为正常对照。三复孔。 在37°C孵育5天。去培养基，然后加入4%多聚甲醛固定细胞。用抗Beta-tubulin抗体， 行常规免疫组化染色。20倍镜下拍照，测量细胞突起长度。如图6所示，结果表明，与正常对照组比较(为方便比较，将正常对照组的细胞突起平均长度设为100%)，HuIgG组(Ab+HuIgG)的细胞突起长度为35%，p75NTR_ECD组 (Ab+p75NTR-ECD)的细胞突起长度为 61%，p75NTR-ECD/Fc 组(Ab+p75NTR_ECD/Fc)的细胞突起长度为82%。表明p75NTR-E⑶和p75NTR_E⑶/Fe具有拮抗A β 42引起的神经突起变性作用，p75NTR-ECD/Fc 的作用效果强于 p75NTR_ECD。实验例7 :p75NTR_E⑶和p75NTR_E⑶/Fe在体内半衰期的比较
将AD小鼠分两组，每组各5只，通过尾静脉注射，分别注入5nmol的p75NTR_E⑶或 p75NTR-ECD/Fc。分别与注射后0，1,2,4,8, 12，18和24小时取尾静脉血，通过ELISA方法， 检测血液中的P75NTR-ECD或p75NTR_ECD/Fc浓度，计算半衰期。结果表明，p75NTR_ECD在体内的半衰期为4小时，而p75NTR-E⑶/Fe的半衰期为10小时。
权利要求
1.一种具有序列表中SEQ ID NO. 1所述的核苷酸序列的P75NTR-ECD在制备防治阿尔茨海默病的药物中应用。
2.一种具有序列表中SEQ ID NO. 2所述的氨基酸序列的p75NTR-ECD在制备防治阿尔茨海默病的药物中应用。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于具有序列表中SEQID NO. 3所述的核苷酸序列的p75NTR-E⑶/Fe在制备防治阿尔茨海默病的药物中应用，所述的p75NTR_E⑶/Fe是将p75NTR-E⑶基因与人免疫球蛋白Fc段基因相连接，形成编码p75NTR_E⑶/Fe的DNA。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于具有序列表中SEQID NO. 4所述的氨基酸序列的p75NTR-E⑶/Fe在制备防治阿尔茨海默病的药物中应用，所述的p75NTR_E⑶/Fe是将p75NTR-E⑶基因与人免疫球蛋白Fc段基因相连接，形成编码p75NTR_E⑶/Fe的DNA，然后以此为模板，形成P75NTR-E⑶/ 的蛋白质。
全文摘要
一种防治阿尔茨海默病的药物，它可以包括有p75NTR-ECD，其核苷酸序列是序列表中SEQIDNO.1所述的核苷酸序列，其氨基酸序列是序列表中SEQIDNO.2所述的氨基酸序列。它也可以p75NTR-ECD/Fc，其核苷酸序列是序列表中SEQIDNO.3所述的核苷酸序列，其氨基酸序列是序列表中SEQIDNO.4所述的氨基酸序列。本发明不仅具有抑制Aβ聚集成寡聚体和纤维、促进Aβ纤维的解聚、清除脑内Aβ的作用，而且还具有拮抗Aβ神经毒性的作用。本发明提供了发挥多重作用的阿尔茨海默病治疗新药物，具有广阔的临床应用前景。
文档编号C12N15/62GK102233128SQ20101056128
公开日2011年11月9日 申请日期2010年11月26日 优先权日2010年11月26日
发明者周新富, 王延江 申请人:王延江