专利名称：一种用于诊断或检测胃癌的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种试剂盒，尤其涉及一种用于诊断或检测胃癌的试剂盒。
背景技术：
胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，发病率居各类肿瘤之首，每年约有17万人死 于胃癌，几乎接近全部恶性肿瘤死亡人数的1/4，而且胃癌的预后较差，严重威胁人类的生 命健康。微小RNA (microRNAs, miRNAs)是一类长度约为20 25 nt的内源性非编码RNA 分子，普遍存在于真核生物中，它不编码蛋白质或多肽，而是与靶基因的信使RNA CmRNAs ) 3'非翻译区互补结合，诱导靶mRNA降解或抑制靶mRNA的翻译，从而实现转录后基因调 控作用。研究表明，大约50%的miRNAs在基因组上定位于肿瘤相关基因区域或脆性位点 (fragile site)。miRNAs作为一类新的癌基因或抑癌基因，其表达失衡与多种肿瘤的发生 密切相关。许多证据表明，miRNAs的表达谱在胃癌组织中常出现异常，miRNAs参与了胃癌 的发生、发展和转移，提示它们在胃癌的诊断、预后和治疗中具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于诊断或检测胃癌的试剂盒。本发明提供的用于诊断或检测胃癌的试剂盒，主要包含=M-MLV逆转录酶及逆转 录反应缓冲液、miR-30b逆转录引物、Taq DNA聚合酶及聚合反应缓冲液、miR_30b定量PCR 引物。其中miR_30b基因由发明人利用基因芯片技术从胃上皮细胞中筛选而得(见申请 号为=200910104765. 9，名称为“miR-146a在制备治疗胃炎药物中的应用”发明专利申请)。所述miR_30b的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示 5' -UGUAAACAUCCUACACUCAGCU-3‘ 。 (SEQ ID N0:1) 所述miR-30b逆转录引物如SEQ ID N0:2所示:
5' -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGCTGAG-3' 。(SEQ ID NO:2) 所述miR-30b定量PCR引物如SEQ ID NO: 3-4所示 5' -GCCCGC TGTAAACATCCTACA-3‘ (SEQ ID NO:3) 5' - GTGCAGGGTCCGAGGT-3‘ (SEQ ID N0:4)。所述逆转录反应缓冲液可以包含Tris-HCl、MgCl2, KCl和DTT。其中，Tris-HCl WpH 可以为 8. 3，MgCl2、KCl、DTT 的用量分别为 15mM MgCl2,375 mM KCl、50mM DTT。所述聚合反应缓冲液包含=MgCl2、dNTPs和SYBR Green。优选地，聚合反应可以使用商购的PCR mix。利用本发明所述的试剂盒，对患者的胃癌组织和正常胃组织的miR_30b的水平进 行检测，结果表明，在胃癌组织中，miR-30b的表达量也要显著低于对照正常胃粘膜组织，这与miR-30b在胃癌细胞株中的表达水平相一致。使用该试剂盒，可以快速、方便、灵敏地诊 断或检测胃癌。为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例， 并配合附图，作详细说明如下。
图1表示荧光定量PCR技术检测miR_30b在胃癌细胞株中的表达水平； 图2表示胃癌组织和正常胃粘膜组织的miR-30b的表达分析；
图3表示miR-30b在诊断胃癌中的敏感性分析。
具体实施例方式实施例1 肿瘤细胞/正常细胞的总RNA的提取方法
Trizol法抽提细胞总RNA，IX IO7细胞加入1 ml Trizol，用枪头反复剧烈吹打，漩涡 器上充分振荡使细胞完全裂解，室温静置5 min;按0.2 ml氯仿/1 ml Trizol的比例加 入氯仿，充分漩涡，室温静置10 min ;4°C, 12000Xg离心15 min，取上层无色液体于新的 1.5 ml离心管中；按0.5 ml异丙醇/1 ml Trizol的比例加入异丙醇，充分混合，室温放置 5-10 min，以形成RNA沉淀；4°C，12000 Xg离心10 min，弃上清；加至少1 ml 75%乙醇/1 ml Trizol，悬浮RNA沉淀；4°C，7500 Xg离心5 min，弃上清；空气干燥5-10 min后，用30 μ 无RNA酶的水溶解。实施例2 肿瘤组织/正常组织的总RNA的提取方法
在抽提组织RNA前，先把研钵预冷，往研钵内反复加入液氮，至少4飞次，使研钵充分预 冷。从液氮罐中取出样本后，把组织块放入已预冷的研钵中进行研磨，边研磨边加液氮，整 个过程都不要使液氮挥干。一次研磨的组织块重量不要超过300 mg。研磨到组织成粉末 状后，待液氮基本挥发完时，在每个研钵中加纩3 ml Trizol试剂。此时，Trizol加入后会 冻结成固体状，可继续研磨成粉末，接着将Trizol试剂转移到玻璃勻浆器中，进一步勻浆 3^5 min，最后把Trizol试剂转移到1. 5 ml离心管中，按照Trizol试剂的标准操作抽提总 RNA。实施例3 检测miR_30b在肿瘤细胞和正常细胞中的表达
1.首先按照实施例1和实施例2中所述的Trizol法提取肿瘤细胞/正常细胞的总 RNA，及肿瘤组织/正常组织的总RNA。胃癌细胞株HGC-27、AGS、BGC-823、SGC-7901购自美国ATCC，正常胃粘膜组织取5 份(N=5)。
2.逆转录反应
分别取上述各种总RNA各IOng为模板，合成cDNA，反应体系如下dNTPs (100 mM) 0. 15 μ 1 ；逆转录酶(200 U/μ 1) 0. 5 μ 1 ；5XRT 缓冲液 3 μ 1 ；RNase 抑制剂(20 U/ μ 1) 0. 5 μ 1 ；RT 引物(SEQ ID NO:2) (5 uM) 1 μ 1 ；总 RNA 5 μ 1 ；DEPC H2O 补足总体 积15 μ L·反应条件16°C 30分钟，42°C 30分钟，85°C 5分钟反应，4°C保存。3.定量PCR反应
以上述第2点中合成的cDNA为模板，进行定量PCR反应，体系如下2XPCR mix 10μ 1 (具体可以含25 mmol/L MgCl2 2.4 μ ,5 mmol/L dNTPs 禾口 SYBR Green);cDNA 2μ 1 ； 引物(SEQ ID NO: 3-4) (5 uM) 1 μ 1 ；Taq DNA 聚合酶 0.5 μ 1 (5 U/ μ 1), DEPC H2O 补 足20μ1 (Taq DNA聚合酶和PCR mix购自TaKaRa公司)。反应条件95 °C反应3分 钟；95°C 15秒，60°C 30秒反应40个循环。以TO为内参对照(U6的荧光定量PCR引 物具体为 SEQ ID NO: 5-6，SEQ ID N0:5 为 5' -CTCGCTTCGGCAGCACA-3 ‘，SEQ ID NO: 6 为 5' -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3 ‘)，采用相对定量法(请参考Livak KJ,
Schmittgen TD. Methods. 2001，25 (4) 402-8)分析数据。利用荧光定量PCR技术，比较了胃癌细胞株HGC-27、AGS、BGC-823、SGC-7901与正 常胃粘膜组织(N=5)中miR-30b的表达情况，结果表明，miR_30b在各类胃癌细胞株中的表 达均显著低于正常胃粘膜组织(请参照图1及图2)。其中未分化胃癌细胞株HGC-27的表达 最低，仅为正常组织的0. 08倍；低分化胃癌细胞AGS和BGC-823的表达居中，分别为0. 22 倍和0. 18倍；中分化胃癌细胞株SGC-7901为0. 64倍，各组P值均小于0. 05，与正常组织 差异显著，同时，miR-30b与胃癌的恶性程度呈负相关。实施例4 试剂盒的制备及其在胃癌诊断中的临床验证
诊断或检测胃癌的试剂盒包含=M-MLV逆转录酶及逆转录反应缓冲液、miR-30b逆转录 引物、Taq DNA聚合酶及聚合反应缓冲液、miR-30b定量PCR引物，miR-30b逆转录引物如 SEQ ID N0:2所示，miR-30b定量PCR引物如SEQ ID N0:3_4所示，逆转录反应缓冲液包含 pH 为 8. 3 的 Tris-HCl、15mM MgCl2,375 mM KCl、50mM DTT，聚合反应缓冲液包含 25 mmol/ L MgCl2 2.4 μ , 5 mmol/L dNTPs 禾口 SYBR Green。按照实施例2、3所述方法，检测15例胃癌患者(取样于第三军医大学新桥医院)胃 癌组织和正常胃组织的miR-30b的表达水平，结果表明，在胃癌组织中，miR-30b的表达量 也要显著低于对照正常胃粘膜组织，当以miR-30b (胃癌组织)/ miR-30b正常组织的相对 值< 1为诊断指标时，15例胃癌患者中有14例诊断为胃癌阳性，灵敏度为93. 33% (14/15) (请参照图3)。虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术 领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与改进，因此本发明 的保护范围当视权利要求所界定者为准。
权利要求
1.一种用于诊断或检测胃癌的试剂盒，其特征在于，包含M-MLV逆转录酶及逆转录反 应缓冲液、miR-30b逆转录引物、Taq DNA聚合酶及聚合反应缓冲液、miR-30b定量PCR引 物。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述miR-30b的核苷酸序列如SEQID N0:1所示。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述miR-30b逆转录引物如SEQID N0:2所示。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述miR-30b定量PCR引物如SEQID NO:3-4 所示。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述逆转录反应缓冲液包含 Tris-HCl、MgCl2、KCl 和 DTT。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述逆转录反应缓冲液中=Tris-HCl的 pH 为 8. 3，MgCl2、KCl、DTT 的用量分别为 15mM MgCl2,375 mM KCl、50mM DTT。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述聚合反应缓冲液包含=MgCl2、 dNTPs和 SYBR Green0
全文摘要
本发明涉及一种用于诊断或检测胃癌的试剂盒，其主要包含M-MLV逆转录酶及逆转录反应缓冲液、miR-30b逆转录引物、TaqDNA聚合酶及聚合反应缓冲液、miR-30b定量PCR引物。利用本发明所述的试剂盒，对患者的胃癌组织和正常胃组织的miR-30b的水平进行检测，结果表明，在胃癌组织中，miR-30b的表达量也要显著低于对照正常胃粘膜组织，这与miR-30b在胃癌细胞株中的表达水平相一致。当以miR-30b的相对表达水平为诊断指标时，在收集的15例胃癌患者标本中，本试剂盒在诊断胃癌中的灵敏度为93.33%。使用该试剂盒，可以快速、方便、灵敏地诊断或检测胃癌。
文档编号C12Q1/68GK102002532SQ201010562349
公开日2011年4月6日 申请日期2010年11月29日 优先权日2010年11月29日
发明者朱恩东, 李娜, 毛旭虎, 肖斌, 邹全明, 郭刚, 黎伯胜 申请人:中国人民解放军第三军医大学