两种海洋动物抗菌肽基因的融合表达产物及其制备方法

专利名称：两种海洋动物抗菌肽基因的融合表达产物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域中鱼类与蟹类的基因工程，具体涉及具有抗菌活性的锯 缘青蟹抗菌肽SCyg0nadin2与大黄鱼抗菌肽h印Cidin的融合表达产物及其制备方法。
背景技术：
随着分子生物学技术的成熟及其在生物学和医学上的广泛应用，水生动物抗菌 肽的基因陆续被发现与研究，(1、Brogden KA. Antimicrobial peptides :pore formers or metabolic inhibitors in bacteria[J]. Nat. Rev. Microbiol. 2005, 3 :238-250 ；2> S.E.Lofgren, L. C. Miletti, M. Steindel, E. Bachere, M. A. Barracco. Trypanocidal and leishmanicidal activities of different antimicrobial peptides (AMPs) isolated from aquatic animals. [J]. Experimental Parasitology. 2008,118 :197-202) SiJi^Jf 发针对水产养殖业中疾病的预防与治疗的相应抗菌肽药物具有广阔的潜在应用价值。利用 分子生物学技术，可建立高效、大量表达水生动物抗菌肽基因工程菌株，实现在体外获得有 活性的、且能满足产业化生产的抗菌肽产品。将此类产品代替抗生素添加到饲料中，能增强 水产动物的免疫力，提高养殖产量，还能避免抗生素在动物体中的富集。该方法不仅突破了 直接从水生动物体中提炼或者化学合成抗菌肽所带来的产量低、费用高等局限性，还能为 目前我国水产养殖中长期使用抗生素所带来的细菌耐药性及抗生素污染等造成的问题提 出可供参考的解决方案。锯缘青蟹抗菌肽SCyg0nadin2与大黄鱼抗菌肽h印cidin均是来自于水产动物 (3、Cloning and expression of a hepcidin gene from a marine fish(Pseudosciaena crocea)and the antimicrobial activity of synthetic peptide. [J]. Peptides,2009, 30 :638-646)。本发明所用的SCyg0nadin2来自于无脊椎动物，在固有免疫中发挥作用，而 hepcidin来自于低等脊椎动物，与适应性免疫密切相关。迄今，还未有关于这两种类型抗菌 肽串联表达的研究报道。因此研究水产动物养殖业中这两个主要经济物种的抗菌肽基因串 联表达产物及其活性特点，具有重要的实践价值和应用价值。

发明内容
本发明的目的在于提供两种海洋动物抗菌肽基因的融合表达产物及其制备方法。所述两种海洋动物抗菌肽基因的融合表达产物的基因包括锯缘青蟹抗菌肽 scygonadin2基因、连接肽和大黄鱼抗菌肽h印cidin基因；所述两种海洋动物抗菌肽基因 的融合表达产物命名为抗菌肽scygonadin2-h印cidin。所述锯缘青蟹抗菌肽SCyg0nadin2的基因序列为cacccatggc gaatggcctg gcactcaaca gacttatgaa taaggccgtc gacgccatag 60tttatatggt tggacaacaa gacgcaggcg tctctcttct gggtcaccca tgtctggtgg 120agtcagcgaa acaaccggaa ggcatctaca ccgcagtaat gtcgtgtgct tcctggaccc 180ctcgcttcgt tggggaaggc acaagcgagg ttgaacttga ggcgcttaaa ggttcgatca 240 gaagctttat ccgtaaggca tccgattacc agctgttaag taaagaagac ctcgaggact 300 ggcttgcttc ctacggttct ccaggttccg gt332
其中第1 3位的碱基序列cac为保护碱基，第4 9位碱基序列ccatgg为酶切 第315 332位的碱基序列ggttct ccaggttccg gt为连接肽。 所述大黄鱼抗菌肽hepcidin的基因序列为
ggttctccag gttccggtgt cccagccaat gaagagcaag agctggagca gcaaatttat 60 tttgctgatc cagagatgcc agtggaatca tgcaagatgc cgtattacat gcgtgagaat 120 cgtcagggca gccctgctag atgcaggttt tgctgccgtt gctgtcctag aatgagggga 180 tgtggtatct gctgcaggtt c ctcgagcgg210
其中第1 18位的碱基序列ggttct ccaggttccg gt为连接肽，第202 207位 基序列ctcgag为Biol酶切位点，第208 210位的碱基序列egg为保护碱基。所述连接肽的氨基酸序列为
Gly Ser Pro Gly Ser Gly
15
所述两种海洋动物抗菌肽基因的融合表达产物的氨基麵■序列为
MetAlaAsnGlyLeuAlaLeuAsnArgLeuMetAsnLysAlaValAsp
151015
AlaValTyrMetValGlyGlnGlnAspAlaGlyValSerLeuLeuGly
202530
HisProCysLeuValGluSerAlaLysGlnProGluGlylieTyrThr
354045
AlaValMetSerCysAlaSerTrpThrProArgPheValGlyGluGly
505560
ThrSerGluValGluLeuGluAlaLeuLysGlySerlieArgSerPhe
65707580
lieArgLysAlaSerAspTyrGlnLeuLeuSerLysGluAspLeuGlu
859095
AspTrpLeuAlaSerTyrGlySerProGlySerGlyValProAlaAsn
100105110
GluGluGlnGluLeuGluGlnGlnlieTyrPheAlaAspProGluMet
115120125
ProValGluSerCysLysMetProTyrTyrMetArgGluAsnArgGln
130135140
GlySerProAlaArgCysArgPheCysCysArgCysCysProArgMet
145150155160
ArgGlyCysGlylieCysCysArgPheLeuHisHisHisHisHisHis
165170175
其中103 108位氨基酸序列为连接肽。
所述两种海洋动物抗菌肽基因的融合表达产物的制备方法包括以下步骤1)克隆锯缘青蟹sCyg0nadin2抗菌肽基因和大黄鱼hepcidin抗菌肽基因，并PCR 扩增出锯缘青蟹与大黄鱼的融合基因sCyg0nadin2-h印cidin ；2)将融合基因scygonadir^-kpcidin导入表达载体，构建携带融合基因 scygonadin2-hepcidin的重组表达载体；3)将重组表达载体转入宿主细胞，获得可表达融合基因scyg0nadin2-h印cidin 的工程菌；4)发酵培养可表达融合基因sCyg0nadin2-h印cidin的工程菌，分离纯化发酵液 即得两种海洋动物抗菌肽基因的融合表达产物。在步骤幻中，所述表达载体可为pET28a。在步骤幻中，所述宿主细胞可为大肠杆菌。本发明借助基因工程技术，利用pET28a原核表达载体，成功高效地表达出具有抗 菌活性的锯缘青蟹抗菌肽SCyg0nadin2与大黄鱼抗菌肽hepcidin的融合表达产物，使得串 联抗菌肽的药用价值得到开发。与现有抗菌肽相比，两种海洋动物抗菌肽基因的融合表达 产物的优点如下1、抗菌肽8(^80皿肚112来自锯缘青蟹，抗菌肽11印(^肚11来自大黄鱼。这两种肽的 分子量都较小，分别表达的产物很可能会被大肠杆菌自身酶解；而采用串联表达的方式，可 以增大表达产物的分子量，相比之下会更加稳定。2、scygonadin2作为无脊椎动物体内抗菌肽，主要在非特异免疫中发挥作用；而 hepcidin作为脊椎动物抗菌肽，涉及到脊椎动物的特异性免疫。二者的功能机制有所差异， 从而使得串联产物的药用开发对水产养殖业具有重要研究价值。3、两种海洋动物抗菌肽基因的融合表达产物在％ig/ml浓度下能够抑制包括金黄 色葡萄球、溶壁微球菌、藤黄微球菌、谷氨酸棒状杆菌、施氏假单胞菌和荧光假单胞菌在内 的6种菌的生长。并且，该蛋白在稀释后(浓度为6ym0l/L)对施氏假单胞菌、溶壁微球菌 和藤黄微球菌的生长仍然有抑制作用。


图1为锯缘青蟹SCyg0nadin2和大黄鱼h印cidin PCR产物的琼脂电泳图。在图1 中，1为大黄鱼h印cidin PCR产物；2为锯缘青蟹scygonadin2PCR产物；M为DL2000Marker ； 250、100代表DL2000Marker中核酸片断的碱基数目，核酸数目单位为bp，即碱基数。图2为锯缘青蟹SCyg0nadin2与大黄鱼h印cidin融合基因的琼脂电泳图。在图 2 ψ,Μ^ DL2000Marker ；1 为 scygonadin2-hepcidin ffi^SS ；500 DL2000Marker ψ 核酸片断的碱基数目，核酸数目单位为bp，即碱基数。图3为将pET28a空质粒与pET28a/scygonadin2_h印cidin重组质粒在同样诱导 条件下，取总菌体进行的SDS-PAGE电泳图。在图3中，M为SDS-PAGE预染蛋白质Marker ； 1为pET28a空载体IPTG诱导证后的菌体总蛋白；2为pET28a/scygonadin2_h印cidin 重组表达载体IPTG诱导5h后的菌体总蛋白；3为pET28a/scygonadin2-t^pcidin重 组表达载体未诱导菌体总蛋白；49KDa、34KDa、25KDa、19KDa代表预染蛋白质Marker中 各蛋白片断的分子量；KDa代表蛋白分子量的单位，即千道尔顿；A代表融合表达产物scygonadin2-hepcidin 蛋白。图4为表达菌体超声破碎并离心后的上清与沉淀的SDS-PAGE电泳图。在图4中， M为SDS-PAGE预染蛋白质Marker ；1为pET28a/scygonadin2_hepcidin诱导菌体超声破碎 后的沉淀；2为pET28a/scygonadin2-h印cidin诱导菌体超声破碎后的上清；49KDa、;34KDa、 25KDa、19KDa代表预染蛋白质Marker中各蛋白片断的分子量；KDa代表蛋白分子量的单位， 即千道尔顿；A代表融合表达产物scygonadin2-h印cidin蛋白。图5为亲和层析柱(IMAC)纯化目的蛋白图。在图5中，横坐标为流经层析柱的溶 液的体积，单位为ml ；纵坐标为280nm紫外吸收光密度值，单位为mAU ；A代表与层析柱结合 后又被洗脱下的蛋白峰。图6为目的蛋白纯化前和纯化后的样品SDS-PAGE电泳图。在图6中，1为经过 IMAC柱纯化后得到的目的蛋白；2为纯化前的蛋白样品；M为SDS-PAGE预染蛋白质Marker ； 49KDa、34KDa、25KDa、19KDa代表预染蛋白质Marker中各蛋白片断的分子量；KDa代表蛋白 分子量的单位，即千道尔顿；A代表融合表达产物sCyg0nadin2-h印cidin蛋白。图7为Bradford法蛋白浓度测定标准曲线。在图7中，横坐标为A595，即为595nm 可见吸收光密度值，纵坐标为BSA(标准蛋白)浓度，单位为mg/ml ；标准曲线的回归方程为 Y = O. 8499X-0. 6551，R2 = 0. 9902。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明作进一步说明。实施例1重组表达质粒pEI^8a/scygonadin2-h印cidin的构建1)锯缘青蟹scygonadin2和大黄鱼h印cidin基因的获得根据pET28a载体上多克隆位点，分别设计合成锯缘青蟹scygonadiM抗菌肽基因 (Genbank登录号:DQ872630)和大黄鱼h印cidin抗菌肽基因(Genbank登录号:EF156401) 的特异性上、下游引物。在锯缘青蟹scygonadiM基因上游引物5'端加上NcoI酶切位点， 上游引物Fl为Fl 5' CACCCATGGCGAATGGCCTGGCACTCAACAGGCTTATG 3‘其中黑斜体表示引入的NcoI酶切位点。在锯缘青蟹scygonadiM抗菌肽基因下游引物的5'端突变BioI酶切位点，5'端 加入含有6个氨基酸的连接肽基因序列，下游引物Rl为Rl 5' ACCGGAACCTGGAGAACCGTAGGAAGCAAGCCAGTCTTCGAGGTC 3’其中黑斜体表示连接肽。在大黄鱼h印cidin抗菌肽基因上游引物5'端加入互补连接肽基因序列，上游引 物F2为F2 5' GGTTCTCCA GGTTCCGGTGTCCCAGCCAATGAAGAGCAAG 3’其中黑斜体表示连接肽。在大黄鱼h印cidin抗菌肽基因下游引物5'端加上B10I酶切位点，下游引物R2 为R2 5' CCGCTCGAGGAACCTGCAGCAGATACC 3‘其中黑斜体表示引入的BioI酶切位点。
以上引物均由上海英俊生物技术有限公司合成，使用前用无菌超纯水稀释至 10 μ mol/Lo2)以锯缘青蟹scygonadin2cDNA和大黄鱼h印cidin cDNA重组pPMD18_T阳性质 粒为扩增模板，分别以Fl和F2为上游引物，Rl和R2为下游引物，以Ex Taq酶(购自TaKaRa 公司)进行PCR扩增两种目的片段，反应体系为无菌超纯水 81 μ 1无菌超纯水 81 μ 1
IOX反应缓冲液(含Mfe)10 μIOX反应缓冲液(含Mg2+)10 μ 1
dNTPs(IOmmol/L each)2μ 1dNTPs(10mmol/L each)2μ 1
pPMD18-T/scygonadin2 质粒2μ 1pPMD18-T/hepcidin 质粒2μ 1
Fl(20pmol/y 1)2μ 1F2(20pmol/y 1)2μ 1
Rl(20pmol/y 1)2μ 1R2(20pmol/y 1)2μ 1
Ex Taa 酶(5U/μ 1)1 μ 1Ex Taa 酶(5U/μ 1)1 μ 1总反应体积100 μ 1总反应体积 100 μ 1混合均勻，在热循环仪上按照以下程序进行PCR反应锯缘青蟹scygonadin2 基因 PCR 程序为94°C预变性 5min ；94°C变性 30sec，57°C 退火30sec，72°C延伸30sec ；进行30个循环后，72°C延伸7min。大黄鱼h印cidin基因PCR程序为94°C预变性5min ；94°C变性30sec，62°C退火 30sec, 72°C延伸30sec ；进行30个循环后，72°C延伸7min。反应结束后，将所有反应液进行2% (W/V)琼脂糖凝胶-TAE电泳，用Axegen凝胶 回收试剂盒回收特异性片段，得到锯缘青蟹SCyg0nadin2基因PCR产物长度为300bp，大黄 鱼h印cidin基因PCR产物长度为183bp。3)融合基因 scygonadin2-h印cidin 的制备以步骤2)中回收的两种PCR产物为模板，以锯缘青蟹SCyg0nadin2基因上游引物 Fl和大黄鱼h印cidin基因下游引物R2为上、下游引物，用Ex Taq酶扩增目的片段，反应体 系为无菌超纯水79 μ 1
IOX反应缓冲液(含Mg2+)10 μ 1
dNTPs(10mM each)2μ 1
scygonadin2 片段2μ 1
hepcidin 片段2μ 1
Fl(20pmol/y 1)2μ 1
Rl(20pmol/y 1)2μ 1
Ex Taq 酶(5U/ μ 1)1 μ 1_总反应体积100 μ 1混合均勻，在热循环仪上按照以下程序进行PCR反应94°C预变性5min ；94°C变性 30sec，63°C退火 30sec，72°C延伸 30sec ；进行 30 个循环后，72°C延伸 7min。反应结束后，将所有反应液进行2% (W/V)琼脂糖凝胶-TAE电泳，用Axegen凝胶回收试剂盒回收特异性片段，得到融合基因SCyg0nadin2-h印cidin PCR产物长度为 525bp04)预连接DNA片段的制备将上步中回收的PCR产物，用Nco I和Bio I进行双酶切，反应液置于37°C水浴中
反应他。酶切体系为PCR 回收产物26 μ 1IOXK酶反应缓冲液10 μ 1IOXBSA10 μ 1Nco I和Xho I限制性内切酶各5 μ 1无菌超纯水44 μ 1_总反应体积100 μ 1反应结束后，用2% (W/V)琼脂糖凝胶-TAE电泳检查酶切效率，用Axegen凝胶回 收试剂盒回收目的片段。幻载体的处理将pET28a原核表达载体转化E. coli DH5 α，大量提取质粒，具体操作方法为取Ιμ pET28a空载体转化Ε. coli DH5 α，涂布在含有卡那霉素(50 μ g/ml)的 LB固体培养基平板上培养过夜。次日挑取单菌落，并扩大到IOml LB液体培养基摇床培养； 离心收集菌体，碱裂解法提取质粒；将pET28a空载体进行双酶切，反应液置于37°C水浴中
反应他。酶切体系为pET28a 载体60 μ 1IOXK酶反应缓冲液10 μ 110XBSA10 μ 1Nco I和Xho I限制性内切酶各5 μ 1无菌超纯水10 μ 1_总反应体积100 μ 1反应结束后，将反应液进行(W/V)琼脂糖凝胶-TAE电泳检查酶切效率。用 Qiagen凝胶回收试剂盒回收处理好的载体片段。处理好的载体具有Nco I和)(h0 I酶切位 点的粘性末端，且双酶切及回收处理后将成为单一的线性化条带。6)重组表达载体的连接、转化和鉴定将双酶切处理后具有相同粘性末端的pET28a原核表达载体与含有锯缘青蟹 scygonadin2基因和大黄鱼h印cidin基因的DNA片段连接，反应体系如下pET28a载体10 μ 1
融合基因8μ 1
10XT4DNA Ligase Buffer (连接缓冲液)2. 5μ 1
T4DNA Ligase2μ 1
无菌超纯水2. 5μ 1
总反应体积25 μ 1将反应液置于16°C连接过夜；次日，取全部连接反应液转化至50μ1 Ε. coli DH5a感受态细胞中，涂布在含有卡那霉素(50yg/ml)的LB固体培养基平板上培养过夜 后，挑取阳性菌落，以Fl和R2为上、下游引物，如前所述用PCR法鉴定阳性克隆菌，由上海 英俊公司进行DNA核苷酸序列测定，结果显示连接正确，核苷酸的开放阅读框(ORF)编码连 续，得到pET28a/SCyg0nadin2-h印cidin重组表达质粒(参见图1和幻。该表达载体采用 T7启动子，scygonadin2与h印cidin基因之间有6个氨基酸组成的连接肽，在插入目的基 因片段的C端有6个组氨酸，便于采用亲和层析纯化目的蛋白。实施例2pEI^8a/scygonadin2-h印cidin重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达1)诱导表达碱裂解法提取经鉴定正确的pET28a/SCyg0nadin2-h印cidin重组 质粒，用热击法将pET28a空质粒和pET28a/SCyg0nadin2-h印cidin重组质粒分别转化至 E. coli BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含有卡那霉素(50 μ g/ml)的LB固体培养基平板 上，37°C培养过夜；次日挑取若干pET28a空质粒和pET28a/scygonadin2-h印cidin重组质 粒转化表达菌株后生长的单菌落，分别接种于20ml LB液体培养基中(含50 μ g/ml卡那霉 素)，200rpm、37°C振荡培养至0D_约为0. 3 (OD600为细菌培养液在600nm处的吸光值)，然 后加入IPTG至终浓度为0. 6mmol/L，在下180rpm振荡培养5h。2)聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测融合蛋白表达以pET28a空质粒转化 的 E. coliBL21(DE3)为对照，以 pEI^8a/scygonadin2_h印cidin 重组质粒转化的 E. coli BL2KDE3)为实验组，取若干份对照组及实验组IPTG诱导前后的Iml菌液，分别离心收集 菌体；加入50 μ 11 X SDS加样缓冲液和5 μ 1 β -巯基乙醇，沸水浴IOmin后，12000rpm离 心5min，取15 μ 1上清进行SDS-PAGE电泳。配置SDS-PAGE凝胶。采用5%积层胶和12% 分离胶，以8V/cm电压电泳，当溴酚蓝前沿进入分离胶(12%分离胶)后，以12V/cm电压电 泳，溴酚蓝电泳至分离胶底部后，取出凝胶，用0. 5%考马斯亮兰R-250振荡染色2 3h，脱 色后扫描分析。可见pET28a/SCyg0nadin2-h印cidin重组质粒在诱导后较诱导前具有明显 的蛋白质条带；并且重组质粒和空质粒相比，也具有明显的表达蛋白带。重组质粒表达蛋白 分子量在23kDa左右，与计算的理论分子量相似(参见图3)。实施例3pEI^8a/scygonadin2-h印cidin重组质粒在大肠杆菌中表达产物的可溶 性分析1)按如上所述方法转化、培养20ml种子液，取2ml种子液加至200ml含有50 μ g/ ml卡那霉素的LB液体培养基中，37°C下200rpm摇床培养1. 5 池至OD6tltl约0. 3，加入 IPTG至浓度为0. 6mmol/L, 下180rpm摇床诱导5h。2)离心收集菌体，用预冷的20ml PBS (pH7. 4)悬浮菌体，经_20°C冻融1次后，于 冰浴条件下超声波破碎菌体细胞。3)将上述超声破碎液于4°C，12000g，离心15min。分别收集上清液与沉淀，如上所 述进行SDS-PAGE电泳，证实目的蛋白均以包涵体的形式表达(参见图4)。实施例4亲和层析法纯化scygonadin2_h印cidin串联表达产物1)上柱样品的制备将表达菌液按比例转入IL含50 μ g/ml卡那霉素的新鲜LB液体培养基中， 37°C振荡培养2小时左右，至0D600为0. 3，加入0. 6mmol/L的IPTG，28°C、180rpm摇床诱导证。表达结束后，将全部诱导培养液于4°C，4500g离心20min，收集菌体，加入预冷的50ml PBS (pH7. 4)重悬菌体沉淀。放入-20°C冷冻过夜。次日，待菌液解冻后，于冰浴条件下超 声破碎菌体细胞10 15min (超声5s，间隔IOs)。破碎至菌液无粘性后4°C，IlOOOg离心 15min。用含2M尿素的缓冲液洗涤包涵体后，4°C、11000g离心15min。最后用含有8mol/L 尿素的缓冲液充分溶解包涵体，40C UlOOOg离心20min，将上清装入处理好的透析带中。放 入逐级降低的，含有6mol/L、4mol/L、2mol/L、lmol/L、0. 5mol/L、0mol/L尿素的缓冲液中透 析复性，多次更换透析液。以上操作均在低温环境中进行。透析结束后将蛋白溶液于4°C， 12000g离心20min。至此准备好上柱样品。2)准备金属鏊合层析柱金属鏊合层析填料为s印harose fast flow (GE Healthcare)，亲和层析介质装柱 后，先用3 4个柱体积的溶液A鏊合Ni2+，用5 10个柱体积超纯水洗柱；再用5 10 个柱体积的溶液B洗去多余的M2+，并用5 10个柱体积超纯水洗柱；接着用5 10个柱 体积溶液C充分平衡层析柱，等待上样。全部溶液用0. 45 μ mol/L滤膜过滤。层析试剂为溶液A :200mmol/L 硫酸镍；溶液B :25mmol/L NaH2P04+500mmol/L NaCl，pH 4. 0 (用磷酸调)；溶液C :20mmol/L 磷酸缓冲液 +500mmol/L NaCl+40mmol/L 咪唑，pH 8. 0 ；溶液D :20mmol/L 磷酸缓冲液 +500mmol/L NaCl+400mmol/L 咪唑，pH 8. 0。3)上柱纯化将上柱样品经0.45 μ mol/L过滤后，全部上柱。先用5 10个柱体积的溶液C洗 去未结合的杂蛋白；再用10个柱体积的溶液D过柱洗脱目标蛋白；收集洗脱峰，可见到明 显的洗脱蛋白峰(参见图幻，取少量进行SDS-PAGE电泳鉴定(参见图6)，通过凝胶扫描计 算得知，扫描凝纯化后的融合表达产物具有90%的纯度。将目的蛋白洗脱液装入处理好的 透析带中，放入磷酸盐缓冲液中透析，多次更换透析液。最后透析入超纯水中。以上操作均 在低温环境中进行。实施例5融合表达产物scygonadin2-t^pcidin抗菌活性的测定1)应用Bradford法测定目的蛋白的浓度 取BSA储液用1 X PBS稀释10倍，终浓度为0. 5mg/ml ；将0. 5mg/ml BSA标准品按 0、1、2、4、8、12、16、20μ 1梯度加到96孔细胞培养板中，用IXPBS分别补足至20μ 1，每个 浓度梯度设置3个平行样；分别加20μ 1、10μ 1、5μ 1待测样品到96孔板的样品孔中，用 1 XPBS分别补足至20 μ 1，每个浓度梯度设置3个平行样；每孔加入200 μ 1 G250染色液， 室温放置:3min ；用酶标仪测定595nm波长处的吸光度；根据标准曲线计算待测样品的蛋白 浓度；应用Bradford法测定BSA标准品得到蛋白浓度标准曲线(参见图7)，根据公式可 计算出重组表达蛋白的浓度。2)融合表达产物scygonadin2-t^pcidin抗菌活性的测定(1)取被测细菌，在MH(Mueller-Hint0n)平板上划线，倒置培养12 16h ；挑取 单克隆接种于MH斜面，继续培养12 16h ；用DPBS (DPBS为杜氏磷酸缓冲液)清洗斜面 培养物，调整稀释至OD6tltl = 0. 1。取18 μ 1上诉稀释菌液加入到MH稀释培养基(DPBS 600 μ 1，MH 400 μ 1)中至终体积为1ml，至此准备好细菌的最小抑菌浓度(MIC minimum inhibition concentration)的工作浓度。其中金黄色葡萄球菌培养温度为37°C，溶壁微球 菌、藤黄微球菌、谷氨酸棒状杆菌、施氏假单胞菌、荧光假单胞菌培养温度为28 30°C (所 使用的上述菌株均购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心)。(2)目的蛋白经过0. 22 μ m过滤膜过滤除菌后，以96、48、24、12、6、3、1. 5 μ mol/L 为梯度进行稀释；(3)在96孔细胞培养板上，每种被测细菌按照以下操作设置空白对照组、阴性对 照组和待测样品实验组，每组设置2个平行样①空白对照组加50 μ 1蛋白样品和50 μ 1杜氏磷酸缓冲液DPBS ；②阴性对照组加50 μ 1菌悬液和50 μ 1杜氏磷酸缓冲液DPBS ；③样品实验组加50 μ 1待测各浓度蛋白样品和50 μ 1菌悬液；培养24h后，判定目的蛋白对各种细菌的最小抑菌浓度。结果表明融合表达 产物scyg0nadin2-h印cidin对所测菌种均具有一定的杀伤作用，参见表1 融合表达产物 SCyg0nadin2-h印cidin对6种细菌的最小抑菌浓度图。在表1中，测试菌株有施氏假单 胞菌(Pseudomonas stutzeri)、焚光假单胞菌(Psendomonas fluorescens)、金黄色葡萄 球菌(Staphylococcus aureus)、溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)、藤黄微球菌 (Micrococcus leteus)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) ；MIC是最小抑菌浓 度，单{立为 U mol/L ；scygonadin2_hepcidin代表融合表达白勺 scygonadin2_hepcidin 蛋白。表权利要求
1.两种海洋动物抗菌肽基因的融合表达产物，其特征在于，所述两种海洋动物抗菌肽基因的融合表达产物的基因包括锯缘青蟹抗菌肽scygonadin2基因、连接肽和大黄鱼抗菌肽hepcidin基因。
2.如权利要求l所述的两种海洋动物抗菌肽基因的融合表达产物，其特征在于所述锯缘青蟹抗菌肽scygonadin2的基因序列为cacccatggc gaatggcctg gcactcaaca gacttatgaa taaggccgtc gacgccatag60tttatatggt tggacaacaa gacgcaggcg tctctcttct gggtcaccca tgtctggtggl 20agtcagcgaa acaaccggaa ggcatctaca ccgcagtaat gtcgtgtgct tcctggaccc180ctcgcttcgt tggggaaggc acaagcgagg ttgaacttga ggcgcttaaa ggttcgatca240gaagctttat ccgtaaggca tccgattacc agctgttaag taaagaagac ctcgaggact300ggcttgcttc ctacggttct ccaggttccg gt332其中第l一3位的碱基序列CaC为保护碱基，第4—9位碱基序列ccatgg为酶切位点，第315—332位的碱基序列ggttct ccaggttccg gt为连接肽。
3.如权利要求l所述的两种海洋动物抗菌肽基因的融合表达产物，其特征在于所述大黄鱼抗菌肽hepcidin的基因序列为ggttctccag gttccggtgt cccagccaat gaagagcaag agctggagca gcaaatttat60tttgctgatc cagagatgcc agtggaatca tgcaagatgc cgtattacat gcgtgagaatl 20cgtcagggca gccctgctag atgcaggttt tgctgccgtt gctgtcctag aatgagggga180tgtggtatct gctgcaggtt cctcgagcgg2 10其中第l—18位的碱基序列ggttct ccaggttccg gt为连接肽，第202—207位的碱基序列ctcgag为XhoI酶切位点，第208—210位的碱基序列cgg为保护碱基。
4.如权利要求l所述的两种海洋动物抗菌肽基因的融合表达产物，其特征在于所述连接肽的氨基酸序列为Gly Set Pro Gly Set Gly·l5。
5.如权利要求l所述的两种海洋动物抗菌肽基因的融合表达产物，其特征在于所述两种海洋动物抗菌肽基因的融合表达产物的氨基酸序列为 Met Ala Asn Gly Leu Ala Leu Asn Arg Leu Met Asn Lys Ala Val Asp ·l5lo15 Ala Val／yr Met Val Gly Gin Gin Asp Ala Gly Val Set Leu Leu Gly·202530HiS Pro Cys Leu Val Glu Set Ala Lys Gin Pro Glu Gly Ile／yr／hr·354045Ala Val Met Set Cys Ala Set／rp／hr Pro Arg Phe Val Gly Glu Gly·505560／hr Set Glu Val Glu Leu Glu Ala Leu Lys Gly Set Ile Arg Set Phe·65707580Ile Arg Lys Ala Set Asp／yr Gin Leu Leu Set Lys Glu Asp Leu Glu·859095Asp Trp Leu Ala Ser Tyr Gly Ser Pro Gly Ser Gly Val Pro Ala Asn 100105110Glu Glu Gln Glu Leu Glu Gln Gln lie Tyr Phe Ala Asp Pro Glu Met 115120125Pro Val Glu Ser Cys Lys Met Pro Tyr Tyr Met Arg Glu Asn Arg Gln 130135140Gly Ser Pro Ala Arg Cys Arg Phe Cys Cys Arg Cys Cys Pro Arg Met145150155160Arg Gly Cys Gly lie Cys Cys Arg Phe Leu His His His His His His 165170175其中103 108位氨基酸序列为连接肽。
6.如权利要求1所述的两种海洋动物抗菌肽基因的融合表达产物的制备方法，其特征 在于包括以下步骤1)克隆锯缘青蟹scyg0nadin2抗菌肽基因和大黄鱼h印cidin抗菌肽基因，并PCR扩增 出锯缘青蟹与大黄鱼的融合基因scygonadin2-h印cidin ；2)将融合基因scygonadir^-kpcidin导入表达载体，构建携带融合基因 scygonadin2_h印cidin的重组表达载体；3)将重组表达载体转入宿主细胞，获得可表达融合基因sCyg0nadin2-h印cidin的工 程菌；4)发酵培养可表达融合基因SCyg0nadin2-h印cidin的工程菌，分离纯化发酵液即得 两种海洋动物抗菌肽基因的融合表达产物。
7.如权利要求1所述的两种海洋动物抗菌肽基因的融合表达产物的制备方法，其特征 在于在步骤幻中，所述表达载体为pET28a。
8.如权利要求1所述的两种海洋动物抗菌肽基因的融合表达产物的制备方法，其特征 在于在步骤幻中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
全文摘要
两种海洋动物抗菌肽基因的融合表达产物及其制备方法。涉及生物技术领域中鱼类与蟹类的基因工程，提供两种海洋动物抗菌肽基因的融合表达产物及其制备方法。融合表达产物的基因包括锯缘青蟹抗菌肽scygonadin2基因、连接肽和大黄鱼抗菌肽hepcidin基因。制备方法包括克隆融合基因scygonadin2-hepcidin；表达融合基因scygonadin2-hepcidin，即得两种海洋动物抗菌肽基因的融合表达产物。利用pET28a原核表达载体，成功高效的表达出具有抗菌活性的锯缘青蟹抗菌肽scygonadin2与大黄鱼抗菌肽hepcidin的融合表达产物，使得串联抗菌肽的药用价值得到开发。
文档编号C12N15/12GK102061303SQ20101056246
公开日2011年5月18日 申请日期2010年11月26日 优先权日2010年11月26日
发明者王克坚, 蔡晶晶, 黄晟沛 申请人:厦门大学