专利名称：含重组基因的酸性α-淀粉酶及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种含有重组基因的酸性α-淀粉酶及其用途，属于微生物、酶工程技术领域。
背景技术：
淀粉是工业上制取葡萄糖和糊精的主要原料，目前工业上用淀粉制糖主要采用酶水解的方法。酶法制糖工艺一般采用两步法，第一步用α-淀粉酶将淀粉水解成低分子量的糊精，第二步用糖化酶将糊精水解成葡萄糖。淀粉颗粒在冷水中形成乳浊液，绝大部分淀粉分子包裹在淀粉酶不能到达的晶体内。当加热到60 70°C时，淀粉颗粒吸水膨胀，体积迅速增加，晶体结构被破坏，颗粒外膜裂开，形成一种糊状的粘稠液体，这一过程称为糊化。 不同来源的淀粉的糊化温度不同，但一般都在阳 80°C之间。淀粉糊化后，分子链直接暴露在酶分子的作用之下，分子链被迅速切断、变短，最终形成低分子量的糊精，液体粘度急剧下降，这一过程被称为液化。α-淀粉酶的作用特点是在淀粉分子链中间将α-1，4糖苷键切断，而对于已经形成的短链糊精一般并不能进一步分解，将糊精分解为葡萄糖需要由糖化酶来完成。糖化酶的最适作用温度、PH等均与淀粉酶不同，因此需调整ρΗ后才能进入糖化过程。以上制糖工艺使用了两种酶α-淀粉酶和糖化酶，因此常称之为双酶法制糖工艺。浓度较高的淀粉液糊化时，必须迅速液化，否则淀粉液的粘度急剧上升会使设备无法运行，因此用于淀粉液化的淀粉酶必须至少能耐受淀粉糊化所需温度。大部分的淀粉原料加水制成乳液时其PH —般在4. 5左右，而目前双酶法制糖工艺中使用的糖化酶的最适ρΗ也是4. 5，因此淀粉液化工艺中淀粉酶的作用温度如果也是4. 5左右则将为淀粉制糖工艺带来很大的方便。
发明内容
本发明要解决的技术问题是利用基因重组技术从酸性淀粉酶产生菌基因组DNA 中克隆淀粉酶编码基因并确认其功能，从而提供一种来源于芽孢杆菌的酸性α -淀粉酶编码基因，并且利用基因重组技术生产出含有该重组基因的酸性α-淀粉酶，使之用于淀粉高效加工。本发明的技术解决方案是，一种含重组基因的酸性α-淀粉酶，其特征在于该酸性α-淀粉酶包含来源于芽孢杆菌的酸性α-淀粉酶编码基因，所述芽孢杆菌是芽孢杆菌属细菌Bacillus sp. 089，所述酸性α -淀粉酶编码基因是amy089，其核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO :1，所述酸性α-淀粉酶的氨基酸序列为序列表中的SEQ ID NO :2。进一步地，上述酸性α -淀粉酶编码基因amy089与克隆载体pUC18组成的重组质粒pUC-amy089的大肠杆菌转化子是JM109/pUC_amy089。上述含重组基因的酸性α-淀粉酶的用途是，在淀粉加工过程中用于淀粉的液化，液化时PH为4. 5，温度为65°C。本发明的有益效果是利用本发明获得的酸性α -淀粉酶编码基因构建重组微生物，可实现酸性α-淀粉酶的高效率生产，该酸性α-淀粉酶在淀粉加工过程中具有液化淀粉的功能，因此，应用本发明技术方案能够大幅度提高淀粉的加工效率。
具体实施例方式本发明从自然界中筛选到一株具有淀粉降解能力的芽孢杆菌，其编号为Bacillus sp. 089，利用基因工程技术从Bacillus sp. 089基因组DNA中克隆出一条α -淀粉酶编码基因，命名为amy089，其核苷酸序列为序列表中的SEQ IDNO :1，其编码的酸性α-淀粉酶原酶的氨基酸序列为序列表中的SEQ ID NO :2，基因amy089与克隆载体pUC18组成的重组质粒pUC-amy089的大肠杆菌转化子，分类命名为JM109/pUC-amy089。所述酸性α -淀粉酶已经经过功能鉴定证实，它在最适作用温度为65°C、最适作用pH为4. 5环境下的性能，适合淀粉液化工艺的要求。所述酸性α -淀粉酶编码基因amy089的获得方法如下(1)从自然界筛选产酸性α -淀粉酶的芽孢杆菌从自然界采集土样，采用高温处理杀死营养体细胞，富集芽孢杆菌，然后在以淀粉为唯一碳源的培养基上富集产淀粉酶细菌，通过摇瓶培养和淀粉酶酶活检测筛选产淀粉酶的细菌。用16s rDNA基因序列分析确认所筛选微生物属于芽孢杆菌属，此轮工作选定芽孢杆菌Bacillus sp. 089为淀粉酶基因克隆研究的出发菌。(2)Bacillus sp. 089淀粉酶基因的克隆第一步bacillus sp. 089基因组文库的构建提取Bacillus sp. 089基因组DNA，用核酸内切酶EcoR I酶切所获得的基因组 DNA，葡聚糖凝胶电泳分离酶切产物，回收其中2. 0 5. Okb范围内的DNA片段。所回收片段与经EcoR I酶切并经碱性磷酸酶处理的大肠杆菌克隆载体pUC18连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，在含100μ g/mL氨苄青霉素的LB平板上筛选转化子，收集总计约10000个转化子，合并转化子获得Bacillus sp. 089基因组文库。第二步酸性α -淀粉酶基因的克隆将上述基因组文库适当稀释后涂布在含有2%淀粉的LB平板上，37°C培养M小时，总计在100块平板上约获得8，000个菌落。将上述平板上已经形成的菌落编号并点种到另一块添加2%可溶性淀粉的含氨苄青霉素的LB平板上，将原平板在4°C保藏，新点种获得的平板在37°C培养M小时，形成菌落后放入60°C水浴锅内，培养M小时。将上述平板从水浴锅中取出后室温放置1小时左右，将碘液倾倒在平板表面，放置5分钟后倒掉未被吸收的碘液，将平板放入4°C冰箱中放置1小时后取出观察，在总计约8，000个菌落中有一个菌落的周围形成无色透明圈。根据编号在原平板上找到对应的菌落。该菌落的编号为038-41， 该菌落的转化子所含质粒命名为pUC-amy089。提取038-41转化子中所含质粒pUC-amy089，送上海生工生物工程公司测序。结果显示，该重组质粒含有一 2067bp的插入片段，含有一 1416bp的完整编码区，将编码区基因序列提交美国国家生物技术信息中心(www. ncbi. nlm. nih. gov)用blast软件进行序列比对，结果显示，该序列与解淀粉芽孢杆菌淀粉酶基因相似性最高，相似性为73%。(3)Bacillus sp. 089 α -淀粉酶基因的表达与重组酶的应用根据SEQ ID NO :1设计一对引物以扩增Bacillus sp. 089淀粉酶编码区基因。以pUC-amy089染色体DNA为模板，PCR扩增获得一 1. 4kb左右的DNA片段，扩增片段纯化后用 EcoR I和Ml I酶切后与经同样酶切的大肠杆菌表达载体pEtac连接，连接物转化大肠杆菌JM109，在含50 μ g/mL卡那霉素的LB平板上筛选转化子。任选4个转化子，提取质粒后用EcoR I和Ml I酶切质粒并电泳鉴定，结果显示，4个质粒酶切后均产生两条带，一条为 5. 3kb与pETac载体大小相当，另一条为1. 4kb与PCR获得的Bacillus sp. 089 α -淀粉酶基因相当，可见均为P^ac与所获淀粉酶基因的重组质粒。重组质粒命名为pEtac-amy。任取上述转化子一个，划线分离后任取一个单菌落，接种含50 μ g/mL卡那霉素的LB液体培养基，37°C培养至培养液浑浊度为0D600 = 0. 8时加IPTG至终浓度为0. 5mg/ mL,继续培养5小时。作为对照，空质粒pEtac的转化子也同样接种液体LB培养基并用 IPTG诱导表达。诱导后的培养液用超声波破碎细胞，破碎液检测淀粉酶酶活。结果显示， 含pEtac-amy的转化子破碎液有明显淀粉酶酶活。重组酶最适pH为4. 5，最适作用温度为 65°C。含pKac空质粒的转化子破碎液没有淀粉酶酶活，可见上述克隆得到的基因确实为 α -淀粉酶编码基因。基因amy089与克隆载体pUC18组成的重组质粒pUC-amy089的大肠杆菌转化子，其分类命名为JM109/pUC-amy089。α -淀粉酶编码基因amy089能用于在不同宿主细胞中进行异源表达，表达产物用于淀粉液化。α -淀粉酶最适作用温度为65°C，最适作用pH为4. 5，性能适合淀粉液化工艺的要求。 下面通过具体实例，对本发明技术内容作进一步的详细描述。(一 )产酸性α -淀粉酶芽孢杆菌Bacillus sp. 089的获得从自然界筛选产酸性α -淀粉酶的芽孢杆菌从无锡市大浮茶场附近采集PH值为 4左右的酸性土样。在实验室中，将上述土样放入烧杯中，加5倍双蒸水，混勻后在100°C保温1小时。取少量上述混合液涂布以淀粉为唯一碳源的固体培养基平板，37°C培养三天，共获得976个菌落，显微镜观察确定其中387株为杆状细菌。将上述杆状细菌的菌落分别划线分离后以单菌落接种发酵培养基，摇瓶培养2天后取上清液检测α -淀粉酶酶活，其中3 株菌培养液中检测到明显的α-淀粉酶活性。分别进行细菌的16s rDNA基因序列分析，其中编号为089的细菌的16s rDNA基因部分序列为SEQ ID NO :3，利用BLAST软件将SEQ ID NO 3与美国国家生物技术信息中心(www. ncbi. nlm. nih. gov，简称NCBI)收录的基因序列进行比对，结果显示SEQ ID NO :3与Bacillus cereusSBD2_l的16s rDNA基因序列(NCBI 登录号HQ236041. 1)最为接近，相似性为87 %。根据以上实验结果，089细菌应属于芽孢杆菌属，命名为Bacillussp. 089。Bacillus sp. 089被用于下一步实验。(二)Bacillus sp. 089 α -淀粉酶基因的克隆第一步bacillus sp. 089基因组文库的构建提取Bacillus sp. 089基因组DNA，用核酸内切酶EcoR I酶切所获得的基因组 DNA，葡聚糖凝胶电泳分离酶切产物，回收其中2. 0 5. Okb范围内的DNA片段。所回收片段与经EcoR I酶切并经碱性磷酸酶处理的大肠杆菌克隆载体pUC18连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，在含100 μ g/mL氨苄青霉素的LB平板上筛选转化子，在所涂布的100块LB 平板上，共计获得约10000个转化子菌落。在上述每个平板上倾倒约5mL LB液体培养基， 用ImL移液器吸取LB液体培养基对准平板上的菌落进行吹洗，将菌落洗下。最后将从平板上洗下的含有重组大肠杆菌的菌液收集合并即获得Bacillus sp. 089基因组文库。
第二步酸性α -淀粉酶基因的克隆将上述基因组文库适当稀释后涂布在含有2%淀粉的LB平板上，37°C培养M小时，总计在100块平板上约获得8，000个菌落。将上述平板上已经形成的菌落编号并点种到另一块含氨苄青霉素的LB平板上，将原平板在4°C保藏，新点种获得的平板在37°C培养 24小时，形成菌落后放入60°C水浴锅内，培养M小时。将上述平板从水浴锅中取出后室温放置1小时左右，将碘液倾倒在平板表面，放置5分钟后倒掉未被吸收的碘液，将平板放入 4°C冰箱中放置1小时后取出观察，在总计约8，000个菌落中有一个菌落的周围形成无色透明圈。根据编号在原平板上找到对应的菌落。该菌落的编号为038-41，该菌落的转化子所含质粒命名为pUC-amy089。提取038-41转化子中所含质粒pUC-amy089，送上海生工生物工程公司测序。结果显示，该重组质粒含有一 2067bp的插入片段，含有一 1416bp的完整编码区，将上述1416 碱基片段的核苷酸序列提交美国国家生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih. gov)用 blast软件进行序列比对，结果显示，该序列与Bacillus amyloliquefaciens DSM7淀粉酶基因相似性最高，为73%。上述1416bp的完整编码区序列为SEQ ID NO :1。Bacillus amyloliquefaciens DSM7淀粉酶基因在美国国家生物技术信息中心的序列登录号为 FN597644。(三)Bacillussp. 089 α -淀粉酶基因的表达与重组酶的应用根据SEQ ID NO :1设计一对引物以扩增Bacillus sp. 089淀粉酶编码区完整基因。引物序列如下5，-AATTGAATTCATGATGCAAAAACTAAAGCG-3，(SEQ ID NO 4)5，-AATTGTCGACTTATTTGACA TAAATAGAG-3，(SEQ ID NO 5)以pUC-amy089为模板，PCR扩增获得一 1. 4kb左右的DNA片段，扩增片段纯化后用EcoR I和Ml I酶切后与经同样酶切的大肠杆菌表达载体pEtac连接，连接物转化大肠杆菌JM109，在含50 μ g/mL卡那霉素的LB平板上筛选转化子。任选4个转化子，提取质粒后用EcoR I和Ml I酶切质粒并电泳鉴定，结果显示，4个质粒酶切后均产生两条带，一条为5. 3kb与pEtac载体大小相当，另一条为1.抛与PCR获得的Bacillus sp. 089 α -淀粉酶基因相当，可见均为P^ac与所获淀粉酶基因的重组质粒。重组质粒命名为pEtac-amy。任取上述转化子一个，划线分离后任取一个单菌落，接种含50 μ g/mL卡那霉素的 LB液体培养基，37°C培养至培养液浑浊度为OD6tltl = 0. 8时加入IPTG至终浓度为0. 5mg/mL 加入IPTG至终浓度为0. 5mg/mL,继续培养5小时。作为对照，空质粒pETac的转化子也同样接种液体LB培养基并用IPTG诱导表达。诱导后的培养液用超声波破碎细胞，破碎液检测淀粉酶酶活。结果显示，含PEtac-amy的转化子破碎液有明显淀粉酶酶活。重组酶最适 PH为4. 5，最适作用温度为65°C。含pETac空质粒的转化子破碎液没有淀粉酶酶活，可见上述克隆得到的基因确实为酸性α-淀粉酶编码基因。基因amy089与克隆载体pUC18组成的重组质粒pUC18-amy089的大肠杆菌转化子，其分类命名为JM109/pMD_PA。(四)基因amy089的应用α -淀粉酶编码基因amy089能用于在不同宿主细胞中进行异源表达，表达产物用于淀粉液化。α -淀粉酶最适作用温度为65°C，最适作用pH为4. 5，性能适合淀粉液化工艺的要求。
材料和方法普通分子生物学方法除非提及，DNA操作和转化按照标准的分子生物学方法进行(Sambrook等1989分子克隆实验手册)。除非另外提及，PCR操作使用标准方法和PCR反应数据进行，可参见(Sambrook等 1989分子克隆实验手册)。DNA操作所使用的酶根据供应商的说明书使用。引物均为本专利发明人设计并由上海生工生物工程有限公司合成。克隆载体pUC18为大连宝生物工程有限公司产品，产品编号为D506A。大肠杆菌JM109，大肠杆菌表达载体pEtac(沈微，王正祥，唐雪明等.古细菌 Pyrococcus furiosus高嗜热α -淀粉酶基因在大肠杆菌中的分泌表达.中国酿造， 2003，124(1) 12-14.)均由中国高校工业微生物资源与信息中心(http//www. cicim_cu. jiangnan. edu. cn) i^i"共。DNA操作使用的酶和试剂盒除非另外提及，所有DNA操作使用的酶，例如限制性内切酶，连接酶等均为大连宝生物工程有限公司产品。PCR反应使用的DNA聚合酶为大连宝生物工程有限公司产品h Taq，产品编号为DRR006A。所有DNA操作使用的酶在反应时所使用的缓冲液均为购买酶时附赠，缓冲液浓度均为反应所需浓度的10倍。柱式DNA片段回收试剂盒以及从电泳凝胶中回收DNA片段的试剂盒均为大连宝生物工程有限公司产品，产品编号分别为DV807A和 DV805A, DNA纯化以及从琼脂糖凝胶中回收DNA的方法均按上述试剂盒说明书操作。细菌基因组DNA小量提取试剂盒为上海华舜生物工程有限公司产品，细菌基因组DNA提取方法按上述试剂盒说明书进行。其它试剂可溶性淀粉为浙江菱湖淀粉厂产品，酵母氮基为Difco公司0/0型酵母氮基，该产品不含碳源和氨基酸。酶活检测用的淀粉溶液均采用IOmM的磷酸缓冲液配制，磷酸缓冲液使用双蒸水配制，不同PH的磷酸缓冲液按文献(诸葛健王正祥编著工业微生物实验技术手册.北京中国轻工业出版社，1994 :682 683.)介绍的方法配制。诱导大肠杆菌基因表达使用的IPTG为宝生物工程有限公司产品，产品编号为D9030A。培养基LB在“Sambrook等1989分子克隆实验手册”中描述。以淀粉为唯一碳源的固体培养基酵母氮基lg/L，淀粉2g/L，琼脂粉15g/L，用双蒸水配制；摇瓶发酵培养基酵母氮基lg/L，淀粉2g/L，(NH3) 2S04 0. lg/L，用双蒸水配制。摇瓶培养均采用500mL三角瓶，在 37°C条件下按220r/min条件在恒温摇瓶柜中进行。碘溶液按文献[姜锡瑞等.新编酶制剂实用技术手册.2002，北京轻工业出版社]中第 398页“稀碘液”配制。细菌的16s rDNA基因序列分析按文献进行[陈源源，牛丹丹，王正祥.一种快速鉴定细菌的方法.食品与发酵工业，2007，33 (5) 29-31]
淀粉酶酶活力测定按文献[姜锡瑞等.新编酶制剂实用技术手册.2002,北京轻工业出版社]介绍的方法进行。
权利要求
1.含重组基因的酸性α-淀粉酶，其特征在于该酸性α-淀粉酶包含来源于芽孢杆菌的酸性α-淀粉酶编码基因，所述芽孢杆菌是芽孢杆菌属细菌Bacillus sp.089，所述酸性α-淀粉酶编码基因是amy089，其核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO :1，所述酸性 α -淀粉酶的氨基酸序列为序列表中的SEQ IDNO :2。
2.根据权利要求1所述的含重组基因的酸性α-淀粉酶，其特征在于所述酸性α-淀粉酶编码基因amy089与克隆载体pUC18组成的重组质粒pUC-amy089的大肠杆菌转化子是 JM109/pUC-amy089o
3.权利要求1所述的含重组基因的酸性α-淀粉酶的用途，其特征在于所述酸性 α -淀粉酶在淀粉加工过程中用于淀粉的液化，液化时PH为4. 5，温度为65°C。
全文摘要
本发明揭示了一种来源于芽孢杆菌属细菌Bacillus sp.089的酸性α-淀粉酶编码基因amy089，其核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO1。利用基因amy089构建的重组微生物表达产生的重组酸性α-淀粉酶，其氨基酸序列为序列表中的SEQ ID NO2。利用本发明获得的酸性α-淀粉酶编码基因构建重组微生物，可实现酸性α-淀粉酶的高效率生产，该酸性α-淀粉酶在淀粉加工过程中具有液化淀粉的功能。
文档编号C12N9/28GK102477437SQ20101056395
公开日2012年5月30日 申请日期2010年11月30日 优先权日2010年11月30日
发明者王正祥 申请人:苏州普瑞信生物技术有限公司