专利名称：牙源性上皮细胞的培养和扩增方法
技术领域：
本发明涉及一种上皮细胞的培养和扩增方法，具体地说，涉及一种牙源性上皮细 胞的培养和扩增方法，属于细胞培养技术领域。
背景技术：
牙缺失是人类的常见病、多发病，对患者的咀嚼、言语、美观和心理等有显著影响。 根据WHO统计，牙病是人类发病率最高的三大非传染性疾病之一，由各种牙病造成牙缺失 的病例非常普遍。现有的义齿修复手段虽已成熟，但由于其不具备生物活性，难以与天然牙 齿相媲美，无法实现人类拥有“第三副牙”的愿景。因此牙齿发育再生医学变成口腔医学中 最为重要的科学问题。牙齿的发育过程是一个上皮细胞和间充质细胞相互作用、相互诱导的具有时空特 异性的复杂过程。要想实现牙齿再生，必须了解牙源性上皮细胞和间充质细胞是如何动态 相互作用的。由于上皮细胞的细胞间连接较紧密，使用常用的胰蛋白酶进行消化，需要消化 较长时间才能使细胞离散，而胰蛋白酶(简称胰酶)长时间作用于细胞，势必造成细胞膜上 粘连蛋白的大量流失，对细胞损伤较大，因而上皮细胞的培养存在难以培养、扩增、不易诱 导及传代效果差等不足。上皮细胞的难培养阻碍了牙齿发育再生研究的进展，导致了目前 牙齿再生研究主要集中在牙源性间充质细胞成牙能力研究方面。但牙齿发育再生的研究仅 仅从间充质细胞方面研究入手，是不能完整了解牙发育的分子机理的，因而研究牙源性上 皮细胞就不得不首先解决上皮细胞的难培养和扩增的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中所存在的上述不足，提供一种牙源性上皮细胞 的培养和扩增方法，为牙齿再生研究提供上皮细胞来源。为了实现上述目的，本发明提供了以下技术方案
一种牙源性上皮细胞的培养和扩增方法，包括原代上皮细胞的获取和培养、上皮细胞 的扩增，
其中，1)原代上皮细胞的获取和培养包括
(1)用混合酶消化液对牙源性乳糜状组织进行消化，所述混合酶包括分散酶、I型胶原 酶和DNA酶；
(2)用培养液终止消化，用含有100U/mL青霉素和100U/mL链霉素PBS(简称加双抗的 PBS)洗涤，离心，去上清；
(3)用含上皮细胞生长因子的培养基重悬细胞，置于培养皿中进行培养；
(4)当上皮细胞达到复层生长的时候，用胰蛋白酶消化去除成纤维细胞，用胰蛋白酶消 化法结合刮刀刮除法收集剩余上皮细胞，用PBS洗涤，离心、去上清，用含上皮细胞生长因 子的培养基重悬细胞，按照3-5 X IO4个/cm2细胞密度接种于培养皿中培养3-10天；
2)上皮细胞的扩增包括当细胞生长融合达到皿底面积的80%-90%时，采用消化法结合刮除法收集细胞，用PBS 洗涤，离心、去上清，用含上皮细胞生长因子的培养基重悬细胞，按照3-5 X IO4个/cm2细胞 密度接种于培养皿中培养3-10天。以此方法扩增2-3次，即可得到大量纯化的牙源性上皮细胞，经上皮细胞标志物 CK14鉴定为上皮细胞。上述牙源性上皮细胞的培养方法中，原代上皮细胞的获取和培养的步骤(1)中所 用混合酶消化液中各酶的终浓度为分散酶0. 6-2. 4U/mL、I型胶原酶400_800U/mL，DNA酶 20-2000U/mL。上述牙源性上皮细胞的培养方法中，原代上皮细胞的获取和培养的步骤(1)中用 混合酶进行消化的温度为25°C -37°C，消化的时间为30-90分钟，最好在振荡条件下消化。上述牙源性上皮细胞的培养方法中，原代培养上皮细胞的获取和培养步骤(2)中 所述培养液可以为含10% (ν/ V)胎牛血清DMEM培养液。上述牙源性上皮细胞的培养方法中，原代培养上皮细胞的获取和培养步骤(4)中 消化去除成纤维细胞所用胰蛋白酶的质量百分比浓度为0. 025%-0. 25%，消化时间为2-5分钟。上述牙源性上皮细胞的培养方法中，原代培养上皮细胞的获取和培养步骤(4) 中采用胰蛋白酶消化法结合刮除法收集剩余上皮细胞的方法为用质量百分比浓度为 0. 025%-0. 25%的胰蛋白酶消化15-45分钟，用含10% (ν/ ν，体积比)胎牛血清的DMEM培养 液终止消化，将上皮细胞从皿底吹打下来，仍未消化下来的细胞用细胞刮刀从皿底刮下来。上述牙源性上皮细胞的培养方法中，原代上皮细胞的获取和培养、上皮细胞扩增 中所述含上皮细胞生长因子的培养基是在含100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的基础培养 基中加入2%体积比胎牛血清、1%体积比的上皮细胞生长因子的培养基。上述牙源性上皮细胞的培养方法中，所述含上皮细胞生长因子的培养基中所述上 皮细胞生长因子可以为上皮生长因子Gpithelial growth factors, EGF)、成纤维细胞生 长因子(fibroblast growth factors, FGF)、胰岛素(isulin)或美国 Sciencell 公司提 供的上皮培养基中的上皮细胞生长因子，优选美国Sciencell公司提供的上皮培养基中的 上皮细胞生长因子。上述牙源性上皮细胞的培养方法中，原代上皮细胞的获取和培养、上皮细胞扩增 中所述培养皿为皿底涂有多聚赖氨酸的培养皿，上皮细胞的培养条件为37°C、5% C02。上述牙源性上皮细胞的培养方法中，原代上皮细胞的获取和培养、上皮细胞扩增 中离心的条件为800-1200rpm离心4_6min。上述牙源性上皮细胞的培养方法中，所述牙源性乳糜状组织为下颂切牙颈环组织 或磨牙HERS组织。上述牙源性上皮细胞的培养方法中，所述牙源性乳糜状组织的获取方法为选取 出生后1-10天的下颂前牙或磨牙，常规培养前准备后用双抗PBS液(含100U/ml青霉素和 100U/ml链霉素的PBS)冲洗，在含10%胎牛血清DMEM培养液的培养皿中剥离牙囊组织后剪 碎成乳糜状。所述常规培养前准备的方法为在质量体积比为4% (g/mL)多聚甲醛中室温固定 2-30天，再在质量体积比为10% EDTA (g/mL)中室温脱钙7_30天；流水冲洗过夜，乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，连续5-10 μ m切片，HE染色观察，显微镜下观察拍照下颂前牙， 把出生后3-6天作为颈环上皮细胞取材的时间点，出生后7-9天作为HERS细胞取材的时间
点ο细胞在取材时常用消化法和组织块贴壁法，而消化法中常利用的胰酶能够消化细 胞膜上粘连蛋白的原理，使组织中的细胞离散成单个细胞。此方法适用于细胞间连接相对 不紧密的间充质细胞和成纤维细胞，胰酶可以在短时间内将这些细胞从组织块中离散下 来，短时间内胰酶对这些细胞的影响不大，而用于离散连接较紧密的上皮细胞，则需要较长 时间，才能够将其离散，而胰酶长时间作用于细胞，势必造成细胞膜上粘连蛋白的大量流 失，对细胞损伤比较大。本发明在培养牙源性上皮细胞过程中采用包括分散酶、I型胶原酶 和DNA酶的混合酶进行消化，其中胶原酶可以消化细胞间主要的连接蛋白一胶原蛋白，且 其作用相对于胰酶者要温和；分散酶配合胶原酶使用，可以更好更快地是细胞分散开，采用 胶原酶和分散酶相结合的方法，在短时间内即可以使上皮细胞从组织块中消散开来，且对 细胞损伤较小；另外，在消化的同时，加入少许DNA酶，可以使组织块在消化时不因DNA酶粘 连在一起，能够使组织充分与消化酶接触，达到比较好的消化效果。细胞传代时，常用的方法是胰酶消化法和细胞刮刀机械刮除法。前者亦是利用胰 酶溶解细胞膜上的粘连蛋白的原理，使细胞和培养皿、细胞与细胞之间分离，此方法适用于 间充质细胞核成纤维细胞，一般0. 25%的胰酶1分钟就可以将间充质细胞消化分散开来，且 对细胞损伤小，若时间变长，亦会对间充质细胞造成较大损伤；对于相互之间粘接紧密的上 皮细胞，若用胰酶，则必须需要长时间(1-2小时)，才能够将细胞离散开，这势必对上皮细胞 造成较大损伤。细胞传代的另一种方法就是机械法，即利用细胞刮刀将细胞从培养皿中直 接刮除下来，再用移液管反复吹打，使细胞分散开；此方法相对于胰酶消化法，对细胞损伤 较小，但较耗时费力。本发明采用胰酶消化法和细胞刮刀刮除法相结合的方法，即先用特定 浓度胰酶消化细胞一定时间后，相互之间粘接没有之前紧密，再用细胞刮刀将细胞从皿底 刮除下来，稍一吹打就可以使细胞分散开。除此之外，本发明还采用了含上皮细胞生长因子的培养基对牙源性上皮细胞进行 培养，有利于上皮细胞的生长。与现有技术相比，本发明所述的牙源性上皮细胞培养和扩增方法从消化酶的使 用、培养基的选择以及细胞传代方面有所突破，使从少量(5-10颗牙齿)的颈环组织和HERS 组织获得大量的上皮细胞，为牙发育再生研究提供上皮细胞来源。根据本发明的方法，可 从5-10颗牙齿的颈环或HERS组织中获取的牙源性上皮细胞经过短期的培养即可获得大量 (2-5X107个)纯化的上皮细胞，解决了牙源性上皮细胞不易培养的难题。与一般细胞培养 技术相比，本技术同样具有操作简单、容易掌握、安全可行、标准化程度较高等特点，在常规 普通实验室条件下即可开展，因此本发明具有广泛的应用前景。
具体实施例方式下面结合试验例及具体实施方式
对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解 为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本 发明的范围。实例中操作均在严格无菌环境中进行，为保证细胞不受污染，在所有使用的 PBS、DMEM中均含有100U/mL青霉素和100U/mL链霉素。
由于不同细胞取材时间点不同，为避免产生阐述冲突，本发明以颈环上皮细胞培 养和扩增方法为例加以阐述，其他牙源性上皮细胞只在取材时间点上有差别，其余步骤一 样，取出生后3-6天的下颂前牙，PBS冲洗，在含10%体积比胎牛血清DMEM培养液的培养皿 中用尖锐的外科手术刀和显微镊切取根方的颈环组织，剥离它们周围的牙囊组织，分别充 分剪碎颈环组织，成乳糜状；
颈环上皮细胞培养和扩增方法包括以下步骤
1)原代上皮细胞的获取和培养
(1)用含分散酶、I型胶原酶和DNA酶的混合酶对该乳糜状组织进行消化，25°C-37°C 消化30-90分钟；
(2)用含10%胎牛血清DMEM培养液终止消化，用PBS洗涤，800-1200rpm离心4_6min，
去上清；
(3)用含上皮细胞生长因子的培养基重悬细胞和仍未消化组织，置于皿底涂过多聚赖 氨酸(增加黏附性)的培养皿中培养，培养条件为37°C、5% CO2 ；
(4)培养3-10天后，当上皮细胞达到复层生长的时候，0.025%-0. 25%胰蛋白酶消化细 胞，消化2-5分钟，去除消化下来的成纤维细胞，继续用该浓度胰酶消化15-45分钟，用含 10%体积比胎牛血清DMEM培养液终止消化，将上皮细胞从皿底吹打下来，仍未消化下来的 细胞用细胞刮刀从皿底刮下来，用PBS洗涤、离心；
去上清，用上皮培养基重悬细胞，按照3-5 X IO4个/cm2细胞密度接种于皿底涂过多聚 赖氨酸的培养皿中培养15-30天；
2)上皮细胞的扩增
当细胞生长融合达到皿底面积的90%时，用0. 025%-0. 25%胰酶消化15-45分钟，用 巴氏管将细胞从皿底吹打下来，收集细胞入离心管中；对于仍未消化下来细胞采用细胞刮 刀刮除法使其从皿底脱落，将细胞移入同一离心管中；用PBS洗涤，离心，800-1200rpm， 4-6min ；去上清，用上皮培养基重悬细胞，按照3_5 X IO4个/cm2细胞密度接种于皿底涂过多 聚赖氨酸的培养皿中培养15-30天；
以此方法传代2-3次，即可得到大量纯化的牙源性上皮细胞，经上皮细胞标志物CK14 鉴定及结合组织取材特异性判断其为颈环上皮细胞。实施例1大鼠下切牙颈环上皮干细胞的培养
(1)根据大鼠切牙发育的规律，选取出生后1天至出生后10天的SD大鼠，将实验鼠酒 精溺死，从耳后缘剪取其头部，以双侧下颂升支为标志用尖锐的外科手术刀和显微镊游离 下颂骨，去除舌体和周围软组织；在4%多聚甲醛中4°C固定7天，10% g/mL EDTA脱钙1 个月；流水冲洗过夜，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，连续5μπι切片，HE染色，显微 镜下观察拍照；按照切牙颈环细胞最富集时刻，得出出生后4-5天是大鼠颈环上皮细胞取 材的最佳时间点。(2)取10只处于颈环细胞最富集时期(出生后4-5天)的SD大鼠，完整剥离下切 牙，PBS冲洗，在含10%(胎牛血清DMEM培养液的培养皿中用尖锐的外科手术刀和显微镊剪 取根方的颈环组织，剥离它们周围的牙囊组织，充分剪碎颈环组织，成乳糜状；用含2. 4U/ mL分散酶、625U/mL I型胶原酶、200U/mL DNA酶的混合酶消化液共同消化组织，37°C振荡消 化60分钟；用含10%体积比胎牛血清的DMEM培养液终止消化，用PBS洗涤，离心，1OOOrpm,5min ；去上清，避光(该培养基需避光)，用2mL上皮专用培养基重悬细胞和仍未消化组织， 置于6( πι(Φ)培养皿中培养，培养条件为37°C、5% CO2,培养时间为1天；培养1天后，避 光条件下在培养皿中更换新鲜上皮培养基2mL继续培养，以后为隔天换液；培养4天后，当 细胞达到复层生长的时候，用0. 125%胰蛋白酶差别消化细胞，消化4分钟，去除消化下来的 成纤维细胞，继续用胰酶消化10分钟，用含10%体积比胎牛血清DMEM培养液终止消化，将 上皮细胞从皿底吹打下来，仍未消化下来的细胞用细胞刮刀从皿底刮下来，用PBS洗涤、离 心；去上清，避光，用上皮培养基重悬细胞，按照3 X IO4个/cm2细胞密度接种于培养皿中培 养20天。(3)当细胞生长融合达到皿底面积的90%时，用0. 125%胰酶消化15分钟，用巴斯 管将细胞从皿底吹打下来，收集细胞入离心管中；对于仍未消化下来细胞采用细胞刮刀刮 除法使其从皿底脱落，将细胞移入同一离心管中；离心，1000rpm，5min ；去上清，用上皮培 养基重悬细胞，按照3 X IO4个/cm2细胞密度接种于IOcm( Φ)培养皿中培养；以此方法传代 3次，得到大量纯化的颈环上皮细胞.
经上皮细胞标志物CK14鉴定，上述细胞为上皮细胞，将上述所培养细胞按实际需要进 行培养后即可应用。实施例2、小型猪第一磨牙HERS细胞培养
(1)根据小型猪磨牙发育的规律，选取胚胎第100、110、120、130天和出生后1、10、20、 30天小型猪第一磨牙；在4%多聚甲醛中4°C固定14天，10% g/mL EDTA脱钙1个月；流 水冲洗过夜，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，连续5 μ m切片，HE染色，显微镜下观察 拍照；按照第一磨牙HERS刚形成的时期作为HERS取材的最佳时间点，故得出出生后1_2天 作为小型猪磨牙HERS细胞取材的最佳时间点。(2)取10颗处于HERS刚形成时期(出生后1-2天)小型猪第一磨牙；PBS冲洗， 在含10%体积比胎牛血清DMEM培养液的培养皿中用尖锐的外科手术刀和显微镊剪取根方 HERS组织，剥离它们周围的牙囊组织，充分剪碎HERS组织，成乳糜状；用含2. 4U/mL分散 酶、625U/mL I型胶原酶、200U/mL DNA酶的混合酶消化液共同消化组织，37°C振荡消化60 分钟；用含10%胎牛血清DMEM培养液终止消化，用PBS洗涤，离心，IOOOrpm, 5min ；去上清， 避光，用2mL上皮培养基重悬细胞和仍未消化组织，置于6( πι(Φ)培养皿中培养，培养条件 为37°C、5% CO2,时间为1天；培养1天后，避光条件下在培养皿中更换新鲜上皮培养基2mL 继续培养，以后为隔天换液；培养5天后，当上皮细胞达到复层生长的时候，用0. 125%胰蛋 白酶差别消化细胞，消化3分钟后可使成纤维细胞从混合细胞中脱落，去除消化下来的成 纤维细胞，继续用胰酶消化10分钟，用含10%体积比胎牛血清DMEM培养液终止消化，将上 皮细胞从皿底吹打下来，用PBS洗涤、离心；去上清，避光条件下用上皮培养基重悬细胞，按 照5X IO4个/cm2细胞密度接种于IOcm(Ct)培养皿中培养20天。(3)当细胞生长融合达到皿底面积的90%时，用0. 125%胰酶消化15分钟，用巴斯 管将细胞从皿底吹打下来，收集细胞入离心管中；对于仍未消化下来细胞采用细胞刮刀刮 除法使其从皿底脱落，将细胞移入同一离心管中；离心，1000rpm，5min ；去上清，用上皮培 养基重悬细胞，按照5 X IO4个/cm2细胞密度接种于IOcm( Φ)培养皿中培养；以此方法传代 2次，得到大量纯化的HERS细胞。
经上皮细胞标志物CK14鉴定，上述细胞为上皮细胞。
将上述所培养细胞按实际需要进行培养后即可应用。
权利要求
1.一种牙源性上皮细胞的培养和扩增方法，包括原代上皮细胞的获取和培养、上皮细 胞的扩增，其特征在于其中，1)原代上皮细胞的获取和培养包括(1)用混合酶消化液对牙源性乳糜状组织进行消化，所述混合酶包括分散酶、I型胶原 酶和DNA酶；(2)用培养液终止消化，用PBS洗涤，离心，去上清；(3)用含上皮细胞生长因子的培养基重悬细胞，置于培养皿中进行培养；(4)当上皮细胞达到复层生长的时候，用胰蛋白酶消化去除成纤维细胞，采用胰蛋白酶 消化法结合细胞刮刀刮除法收集剩余细胞，用PBS洗涤，离心、去上清，用含上皮细胞生长 因子的培养基重悬细胞，按照3-5 X IO4个/cm2细胞密度接种于培养皿中培养3-10天；2)上皮细胞的扩增包括当细胞生长融合达到皿底面积的80%-90%时，采用消化和刮除法收集细胞，用PBS洗 涤，离心、去上清，用含上皮细胞生长因子的培养基重悬细胞，按照3-5 X IO4个/cm2细胞密 度接种于培养皿中培养3-10天；以此方法扩增2-3次，得到纯化的牙源性上皮细胞。
2.根据权利要求1所述的牙源性上皮细胞的培养和扩增方法，其特征在于原代上皮细胞的获取和培养的步骤(1)中所用混合酶消化液中各酶的终浓度为分散 酶0. 6-2. 4U/mL、I型胶原酶400-800U/mL，DNA酶20-2000U/mL ；混合酶进行消化的温度为 250C _37°C，消化的时间为30-90分钟。
3.根据权利要求1所述的牙源性上皮细胞的培养和扩增方法，其特征在于原代培养 上皮细胞的获取和培养步骤(2)中所述培养液为含10%体积比胎牛血清的DMEM培养液。
4.根据权利要求1所述的牙源性上皮细胞的培养和扩增方法，其特征在于原代培养 上皮细胞的获取和培养步骤(4)中消化去除成纤维细胞所用胰蛋白酶的质量百分比浓度为 0. 025%-0. 25%,消化时间为2-10分钟。
5.根据权利要求1所述的牙源性上皮细胞的培养和扩增方法，其特征在于上述牙源 性上皮细胞的培养方法中，原代培养上皮细胞的获取和培养步骤(4)中采用胰蛋白酶消化 法结合刮除法收集剩余上皮细胞的方法为用质量百分比浓度为0. 025%-0. 25%的胰蛋白 酶消化15-45分钟，用10%体积比胎牛血清的DMEM培养液终止消化，将上皮细胞从皿底吹 打下来，仍未消化下来的细胞用细胞刮刀从皿底刮下来。
6.根据权利要求1所述的牙源性上皮细胞的培养和扩增方法，其特征在于原代上皮 细胞的获取和培养或上皮细胞扩增中所述含上皮细胞生长因子的培养基是在含100U/mL 青霉素、100U/mL链霉素的基础培养基中加入2%体积比胎牛血清、1%体积比的上皮细胞生 长因子的培养基，所述上皮细胞生长因子为上皮生长因子EGF、成纤维细胞生长因子FGF、 胰岛素或美国Sciencell公司提供的上皮培养基中的上皮细胞生长因子。
7.根据权利要求1所述的牙源性上皮细胞的培养和扩增方法，其特征在于原代上皮 细胞的获取和培养或上皮细胞扩增步骤中所述培养皿为皿底涂有多聚赖氨酸的培养皿，培 养条件为37°C、5% CO2。
8.根据权利要求1所述的牙源性上皮细胞的培养和扩增方法，其特征在于原代上皮 细胞的获取和培养或上皮细胞扩增步骤中离心的条件为800-1200rpm离心4-6min。
9.根据权利要求1-8任意一项所述的牙源性上皮细胞的培养和扩增方法，其特征在 于所述牙源性乳糜状组织为下颂切牙颈环组织或磨牙HERS组织。
10.根据权利要求9所述的牙源性上皮细胞的培养和扩增方法，其特征在于所述牙源 性乳糜状组织的获取方法为选取出生后1-10天的下颂前牙或磨牙，常规培养前准备后用 含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS冲洗，在含10%胎牛血清DMEM培养液的培养皿 中剥离牙囊组织后剪碎成乳糜状；所述常规培养前准备的方法为在4%多聚甲醛中室温固定2-30天，10% g/mLEDTA室 温脱钙7-30天；流水冲洗过夜，乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，连续5-10 μ m切片，HE染 色观察，显微镜下观察拍照下颂前牙和磨牙，把出生后3-6天作为颈环上皮细胞取材的时 间点，出生后7-9天作为HERS细胞取材的时间点。
全文摘要
本发明公开了一种牙源性上皮细胞培养和扩增方法，属于细胞培养技术领域。本发明的牙源性上皮细胞培养和扩增方法包括原代上皮细胞的获取和培养、上皮细胞的扩增，其中原代培养包括用分散酶、Ⅰ型胶原酶和DNA酶组成的混合酶消化液对牙源性乳糜状组织进行消化、收集细胞后进行培养，所述混合酶包括分散酶、Ⅰ型胶原酶和DNA酶，传代培养包括用细胞刮刀刮除法结合0.025%-0.25%胰蛋白酶消化法消化细胞、用培养基重悬细胞后进行培养。以此方法传代2-3次，即得到大量纯化的牙源性上皮细胞，经上皮细胞表达标志物CK14鉴定为上皮细胞。本发明克服了牙源性上皮细胞难培养的问题，得到了大量稳定纯化的牙源性上皮细胞，为牙齿发育和再生研究提供了上皮细胞来源。
文档编号C12N5/071GK102002477SQ20101056727
公开日2011年4月6日 申请日期2010年12月1日 优先权日2010年12月1日
发明者孔子任, 田卫东, 葛雅能, 郭永文, 郭维华 申请人:四川大学