专利名称：一株解淀粉芽孢杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株解淀粉芽孢杆菌及其应用，尤其涉及一株新筛选的解淀粉芽孢杆菌YB-3 (保藏号CGMCC NO. 4318)，以及该菌株在防治能够引起植物病害的病原真菌方面的应用。
背景技术：
在农业生产中，每年因病虫害造成巨大的损失。化学农药具有防治效果高，速度快，杀虫杀菌谱广，成本低和使用简便等优点，因此在农业病虫害的防治上一直居于主导地位，但是化学农药的过量施用对人类健康、环境污染和生态平衡构成了极大的威胁。近年来，随着人们对无污染、纯天然绿色食品需求的提高，各发达国家均陆续制定了禁用化学农药的发展规划。生物农药因具有高效低毒、安全以及对生态环境相容等优点， 近年来在植物真菌病害防治领域有着广泛地应用。在微生物源的生物农药中芽孢杆菌(Bacillus)是植物病害生物防治研究中的重要微生物之一，其种类多分布广，是土壤和植物微生态的优势种群。该类微生物通过分泌抗生物质和生长竞争，在防治植物病害方面发挥多种有益作用，大量研究发现一些芽孢杆菌可以产生对植物病原真菌有抑菌活性的抗菌物质。目前已报道具有生防活性的解淀粉芽孢杆菌合成的抗菌物质为胞外物质，浓度低且不适宜提取，而且目前分离的解淀粉芽孢杆菌在生防对象单一且生防效果一般。
发明内容
本发明的目的是提供一株具有广谱杀菌活性的解淀粉芽孢杆菌。本发明提供的解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciensHB-3，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为 CGMCC Na . 4318。解淀粉芽孢杆菌YB-3在LB培养基上呈白色不透明菌落，表面粗糙，边缘不规则；菌体呈短杆状，具有运动性，兼性厌氧菌，可形成内生芽孢，革兰氏染色阳性。该菌株在 20-40°C均可以在LB培养基、NA培养基等培养基上繁殖生长。本发明所提供的解淀粉芽孢杆菌YB-3分离自花园土壤，已于2010年11月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No . 4318。解淀粉芽孢杆菌YB-3在抑制病原真菌中的应用也属于本发明的保护范围。所述病原真菌为水稻纹枯病菌、辣椒疫霉菌、黄瓜炭疽菌、棉花枯萎菌、棉花黄萎菌、小麦赤霉菌、番茄灰霉菌、黄瓜灰霉菌、西葫芦菌核菌、稻瘟菌、稻曲菌、大豆根腐菌、大豆炭疽菌或莴苣菌核菌；优选为水稻纹枯病菌、辣椒疫霉菌、黄瓜炭疽菌、大豆炭疽菌、对黄瓜灰霉菌、大豆根腐菌或棉花黄萎菌。其中，水稻纹枯病菌可以为水稻纹枯病菌ACCC 36441、辣椒疫霉可以为辣椒疫霉ACCC36278、棉花枯萎菌可以为棉花枯萎菌ACCC 36879、小麦赤霉菌可以为小麦赤霉菌 ACCC 31059、番茄灰霉菌可以为番茄灰霉菌ACCC30387、西葫芦菌核菌可以为西葫芦菌核菌 ACCC 36084、稻曲菌可以为稻曲菌ACCC36443、大豆根腐菌可以为大豆根腐菌ACCC36242、 大豆炭疽菌可以为大豆炭疽菌ACCC36201、莴苣菌核菌可以为莴苣菌核菌ACCC36081、黄瓜炭疽菌可以为黄瓜炭疽菌ACCC36065、黄瓜灰霉菌可以为黄瓜灰霉菌ACCC 36448、稻瘟菌可以为稻瘟菌ACCC 37632、棉花黄萎菌可以为棉花黄萎菌ACCC30309。本发明的解淀粉芽孢杆菌YB-3对多种植物病原真菌都具有强烈抗性。此菌株能够产生一种仅存在于细胞内、不扩散到发酵液的抗菌物质，有利于抗性物质的提取。此外， 此菌株具有稳定、高效、广谱的植物病原菌抗性，因此有望广泛应用于农业生产中病害的防治。本发明的解淀粉芽孢杆菌YB-3为环境中常见细菌菌株，可以进一步制成微生物生防菌剂，从而显现出它固有廉价原材料的特性，能够更适应工业大规模生产；本发明的解淀粉芽孢杆菌YB-3为可安全释放的菌株，故不会给环境带来负面效应的影响。本发明菌株能够合成抗菌物质，仅存在于胞内，且抑菌范围和高效、稳定的抑菌效果，可以发展成未来集各项功能于一身的微生物生防制剂。
图1为基于16S rDNA部分序列构建的系统发育树；图2为解淀粉芽孢杆菌YB-3对常见植物病原真菌的抑制效果
具体实施例方式实施例1、本发明解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)YB-3的的获得及鉴定1、样品采集从中国农业科学院院内花园采集土壤样品。2、菌株的分离和抗性筛选(1)菌种稀释将所取的样品混合均勻，称取Ig溶解到装有IOml蒸馏水的三角瓶中，用力振荡使其成 ο—1 土壤悬浮液，然后用Iml移液枪吸取该悬浮液Iml至装有9ml蒸馏水的试管中，充分摇勻制成10_2的土壤悬浮液，依次稀释至10_8 ；(2)培养基制备将配制好的NA培养基和PDA培养基灭菌，倾倒至无菌的培养皿中冷却，其中NA培养基成分为蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCL5g，琼脂粉18g，蒸馏水1000ml， PH7. 0 ；PDA培养基成分为葡萄糖20g，去皮马铃薯200g，琼脂粉18g，蒸馏水IOOOml，PH7. 0 ；(3)菌种分离与筛选吸取上述10_9 土壤悬浮液0. Iml及液体培养3天的水稻纹枯病菌0. Iml至冷却好的PDA培养基中，均勻涂布，放置25°C培养箱中倒置培养4d，观察并挑选拮抗菌落(抑制圈大的菌落)；(4)拮抗菌株纯化将所挑选菌落在PAD培养基上进行划线纯化，再将得到的纯菌株与水稻纹枯病菌进行拮抗验证，得到一株对水稻纹枯病菌拮抗能力的较强的细菌菌株， 命名为YB-3。3、菌株的鉴定对菌株TO-3CGMCC No. 4318进行形态学、生理生化鉴定及系统发育分析。
菌株在LB培养基上呈白色不透明菌落，表面粗糙，边缘不规则；菌体呈短杆状，具有运动性，兼性厌氧菌，可形成内生芽孢，革兰氏染色阳性。采用美国BIOLOG公司推出的BIOLOG细菌自动鉴定系统对菌株YB-3CGMCC No. 4318进行生理生化测定。菌株YB-3在BUGM(BI0L0G公司)+1%葡萄糖上划线30°C培养 16小时，用无菌棉签擦下菌苔于生理盐水中，制成菌悬液，用浊度计调整至适当浊度
T，用8孔移液器将菌悬液分加在Bilog GP鉴定板的各孔中，每孔150微升，共96孔；置于30°C培养箱内培养M小时，置于阅读器上读取结果，自动检索数据库。Biolog系统系统自动给出的鉴定结果为Bacillus amyloliquefaciens，与系统数据库比较结果的可能性 (Probability)为 97、相似性(Similarity)为 0.91、位距(Distance)为 0. 90。因此，此鉴定结果可信度较高，菌株YB-3应为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) 0表1菌株的Biolog系统鉴定结果
权利要求
1.解淀粉芽孢杆菌(BacillusamyloliquefaciensHB-3，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No . 4318。
2.解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens) YB-3 CGMCC Ns. 4318 在抑制病原真菌中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述病原真菌为水稻纹枯病菌、辣椒疫霉菌、黄瓜炭疽菌、棉花枯萎菌、棉花黄萎菌、小麦赤霉菌、番茄灰霉菌、黄瓜灰霉菌、西葫芦菌核菌、稻瘟菌、稻曲菌、大豆根腐菌、大豆炭疽菌或莴苣菌核菌。
全文摘要
本发明公开了一株解淀粉芽孢杆菌及其应用。该解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)YB-3，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC №.4318。本发明菌株能够产生一种仅存在于细胞内、不扩散到发酵液的抗菌物质，本身具有广谱的抑菌范围和高效、稳定的抑菌效果，可以发展成未来集各项功能于一身的微生物生防制剂。
文档编号C12N1/20GK102485880SQ20101056843
公开日2012年6月6日 申请日期2010年12月1日 优先权日2010年12月1日
发明者朱晓飞, 王海胜, 胡元森, 许雷, 闫艳春 申请人:中国农业科学院研究生院