专利名称：一种诱导骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化的试剂盒及其应用和诱导细胞分化的方法
技术领域：
本发明涉及一种诱导细胞分化的试剂盒及其应用和诱导细胞分化的方法，具体 地，涉及一种诱导骨髓间充质干细胞向脂肪细胞方向分化的试剂盒及其应用和诱导骨髓间 充质干细胞向脂肪细胞方向分化的方法。
背景技术：
骨髓间充质干细胞是一类具有多向分化潜能的成体干细胞，可分化为脂肪细胞、 软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、肝细胞等多种组织细胞，临床上可应用于组织工程、基因治 疗、细胞因子替代治疗等领域。
骨髓间充质干细胞是一群具有独特表型的细胞，由于其缺乏特异性的表面标志， 因而如何确定获得的细胞克隆是骨髓间充质干细胞是基础工作关键所在。骨髓间充质干细 胞的鉴定方法是通过在培养中出现增殖分化，首先证明其具有多项分化潜能，然后逆推证 明其为大鼠骨髓间充质干细胞。可利用骨髓间充质干细胞可以诱导分化为脂肪细胞这一特 性来检测培养细胞的分化特性。
先前对骨髓间充质干细胞诱导分化为脂肪细胞的研究中，诱导剂有马血清、牛血 清、谷氨酰胺、I/T/S混合液、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素、吲哚美辛、地塞米松等。但 研究发现骨髓间充质干细胞诱导分化为脂肪细胞的时间长达3-4周，给实验增加了不确定 性和风险性。发明内容
为了解决将骨髓间充质干细胞诱导分化为脂肪细胞的问题，根据本发明的一个方 面，本发明提供了一种用于诱导细胞分化的试剂盒，其可以用于诱导骨髓间充质干细胞向 脂肪细胞方向分化。进一步地，该试剂盒可以用于进行脂肪细胞鉴定。
根据本发明的一个方面，本发明还提供了所述试剂盒在将骨髓间充质干细胞诱导 分化为脂肪细胞中的应用。
根据本发明的一个方面，本发明还提供了一种诱导细胞分化的方法，采用该方法 可以诱导大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞方向分化。进一步地，采用该方法可以进行脂 肪细胞鉴定。利用本发明的试剂盒和方法可以方便、有效的诱导出所需脂肪细胞。
在本发明中，一种诱导细胞分化的试剂盒包括脂肪细胞诱导培养液，该脂肪细胞 诱导培养液包括ImM地塞米松溶液、0. 05M1-甲基-3-异丁基黄嘌呤溶液、以及胎牛血清。
所述脂肪细胞诱导培养液还可以进一步包括10 μ g/mL胰岛素溶液，α -MEM液体 培养基作为上述材料的溶剂和定容剂。
在本发明中，所述脂肪细胞诱导培养液可以是各组分的混合液，也可以将各组分 单独包装，临用时混合配制。
本发明的脂肪细胞诱导培养液主要成分包括地塞米松、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤3溶液和胰岛素溶液。应用浓度为ImM的地塞米松溶液可以诱导骨髓间充质干细胞向脂肪细 胞方向转化。1-甲基-3-异丁基黄嘌呤溶液是磷酸二酯酶的特异性抑制剂，通过抑制cAMP 的降解而提高细胞内的cAMP水平，进而激活cAMP反应元件结合蛋白来调控C/EBP α和C/ EBP β表达从而促进脂肪细胞的产生。胰岛素通过调节ERK1/ERK2信号传导途径及降解核 蛋白磷酸酶ΡΡ2Α的活性来调节CREB的磷酸化和转录活性。按照一定的配制比例，利用本 发明的脂肪细胞诱导培养液进行骨髓间充质干细胞的脂肪诱导分化，可以方便、有效的诱 导出所需脂肪细胞。
在一个具体实施方式
中，所述脂肪细胞诱导培养液包括细胞培养液Α、细胞培养 液B、细胞培养液C、细胞培养液D、细胞培养液Ε，其中，所述细胞培养液A为α -MEM液体 培养基；细胞培养液B为胎牛血清；细胞培养液C为ImM地塞米松溶液；细胞培养液D为 0. 05Μ1-甲基-3-异丁基黄嘌呤溶液；细胞培养液E为10 μ g/mL胰岛素溶液。
所述脂肪细胞诱导培养液中各组分可以优选按照以下比例进行配制lmM地塞米 松溶液90 μ 1 110μ 1，0. 05Μ1-甲基_3_异丁基黄嘌呤溶液0. 8ml 1. ^nl，10 μ g/mL胰 岛素溶液600 μ 1 650 μ 1，胎牛血清5ml 15ml，加α -MEM液体培养基定容到100ml。
在一个优选实施例中，实验中所用的脂肪细胞诱导细胞培养液组分比例可如下所 示ImM地塞米松溶液100μ 1，0. 05Μ1-甲基_3_异丁基黄嘌呤溶液1ml，10 μ g/mL胰岛素 溶液625 μ 1，胎牛血清10ml，加α -MEM液体培养基定容到100ml。实验结果发现，采用此配 置比例，可以迅速(8天时间)、有效的将骨髓间充质干细胞诱导分化为脂肪细胞。
本发明的试剂盒还可进一步包括脂肪细胞鉴定液，该脂肪细胞鉴定液包括细胞固 定液、染色剂、以及洗涤剂。其中，所述细胞固定剂可为4%的多聚甲醛溶液；染色剂可为油 红0溶液；洗涤剂可分为洗涤剂A和洗涤剂B，洗涤剂A为60 %异丙醇溶液，洗涤剂B为双 蒸水。
本发明的成骨细胞鉴定液主要成分包括细胞固定液、染色剂、以及洗涤剂。4%的 多聚甲醛溶液主要起到固定细胞作用。油红0溶液为特异性的脂质结合剂，可以检测脂肪 沉积来检测脂肪细胞。60%异丙醇溶液主要用来漂洗去除多余的染料，并用双蒸水将细胞 清洗干净。
本发明所提供的诱导细胞分化的方法包括以下步骤
a、获取并扩增骨髓间充质干细胞；
b、将所述骨髓间充质干细胞转入脂肪细胞诱导培养液中培养7 9天，所述脂肪 细胞诱导培养液包括ImM地塞米松溶液、0. 05M1-甲基-3-异丁基黄嘌呤溶液、以及胎牛血清。
上述方法可进一步包括以下步骤
C、弃去所述脂肪细胞诱导培养液，用固定液固定之后，加入细胞洗涤剂冲洗，然后 加入染色剂孵育，双蒸水冲洗后观察分化后的脂肪细胞。
在步骤c中，所述细胞洗涤剂可为60%异丙醇溶液，所述染色剂可为油红0溶液。
本发明还提供了所述试剂盒在将骨髓间充质干细胞诱导分化为脂肪细胞中的应 用。所述骨髓间充质干细胞应来源于哺乳动物，在本发明的一个具体实施方式
中，来源于大鼠。
本发明提供了一种诱导骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化的试剂盒，其主要包括脂肪细胞诱导培养液和脂肪细胞鉴定液。
本发明所采用的技术方案是利用快速制备大鼠骨髓间充质干细胞的试剂盒取得 大量细胞后，加入脂肪细胞诱导培养液，体外诱导8天后，利用脂肪细胞鉴定液对脂肪细胞 进行鉴定。
在一个具体实施方式
中，本发明进行诱导大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞方向 分化的方法包括
1、大鼠骨髓间充质干细胞的原代分离培养和传代扩增
将细胞利用洗涤液从大鼠骨髓腔内冲出，利用快速制备大鼠骨髓间充质干细胞的 试剂盒取得大量细胞，为细胞形态呈梭形的大鼠骨髓间充质干细胞。
2、诱导大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞方向分化
弃除培养瓶的培养液，用洗涤液充分清洗细胞，传代至培养皿内，加入脂肪细胞诱 导培养液，每周换液2次，放置在37°C的二氧化碳孵箱内连续培养8天。
3、脂肪细胞的鉴定
从孵箱内取出诱导8天的细胞培养皿，弃去细胞诱导液，4%的多聚甲醛固定1小 时，加入60%异丙醇溶液冲洗3次，加入油红0溶液孵育10分钟，双蒸水冲洗后观察。
本发明的有益效果是可以利用此试剂盒和方法，将大鼠骨髓间充质干细胞有效 诱导分化为脂肪细胞，证实了大鼠骨髓间充质干细胞的分化能力，有效地检测了培养细胞 的分化特性。
为了更好地理解本发明的本质，下面结合附图通过对本发明较佳实施方式的描 述，详细说明但不限制本发明。
图1 大鼠骨髓间充质干细胞加入脂肪细胞诱导液8天后加入脂肪细胞鉴定液后 细胞观察图。
图2 大鼠骨髓间充质干细胞加入普通细胞培养液8天后加入脂肪细胞鉴定液后 细胞观察图。
具体实施方式
下面结合本发明实施来进一步说明本发明的实质性内容，但不以此来限制本发 明。本发明所用试验材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
一、制备用于诱导大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞方向分化的试剂盒
(一 )溶液配制
本发明用于制备大鼠骨髓间充质干细胞的试剂盒包括以下制剂
1、脂肪细胞诱导培养液包括细胞培养液A，细胞培养液B，细胞培养液C，细胞培 养液D，细胞培养液E。其中，所述细胞培养液A为α-MEM液体培养基；细胞培养液B为胎 牛血清；细胞培养液C为ImM地塞米松溶液；细胞培养液D为0. 05Μ1-甲基_3_异丁基黄嘌 呤溶液；细胞培养液E为10 μ g/mL胰岛素溶液。
脂肪细胞诱导细胞培养液组分比例如下ImM地塞米松溶液100μ 1，0. 05Μ1-甲 基-3-异丁基黄嘌呤溶液1ml，10 μ g/mL胰岛素溶液625 μ 1，胎牛血清10ml，加α-MEM液体培养基定容到100ml。
2、脂肪细胞鉴定液所述脂肪细胞鉴定液包括细胞固定液、染色剂和洗涤剂。其 中，所述细胞固定剂为4%的多聚甲醛溶液；染色剂为油红0溶液；洗涤剂A为60%异丙醇 溶液；洗涤剂B为双蒸水。
油红0溶液的主要成分的浓度及配制方法为原液油红0 0.6g，异丙醇 (99% )100ml。稀释液油红0原液20ml，蒸馏水20ml，过滤后使用。
( 二 )试剂盒的分装
试剂盒的规格为1次/盒，每盒中各组分的量lmM地塞米松溶液1管(100 μ 1/ 管)，0.05Μ1-甲基-3-异丁基黄嘌呤溶液1管(lml/管)，10yg/mL胰岛素溶液1管 (625 μ 1/管)，胎牛血清1瓶(IOml/瓶)，α -MEM液体培养基1瓶(88. 275ml/瓶)，4%的 多聚甲醛溶液1瓶OOml/瓶)，60%异丙醇溶液1瓶QOml/瓶)，双蒸水1瓶QOml/瓶)。 按上述剂量说明对试剂盒中各组分进行包装，即可得到诱导大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪 细胞方向分化的试剂盒。
二、大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞方向诱导分化
利用步骤一中所述试剂盒进行大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞方向进行诱导 分化。
(一 )大鼠骨髓间充质干细胞的原代培养及传代扩增
4周龄清洁级SD大鼠1只，颈椎脱臼处死，利用快速制备骨髓间充质干细胞的试剂 盒(主要包括磷酸盐缓冲液、α-MEM液体培养基、胎牛血清、胰蛋白酶液)进行培养，短期 内获得可用的骨髓间充质干细胞。
( 二)诱导大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞方向分化
弃除培养瓶的培养液，用洗涤液充分清洗细胞，传代至培养皿内，加入脂肪细胞诱 导培养液，每2天换液2次，放置在37°C的二氧化碳孵箱内连续培养8天。另外利用相同条 件下获得的大鼠骨髓间充质干细胞，加入普通培养液，每2天换液2次，放置在37°C的二氧 化碳孵箱内连续培养8天作为对照。
(三)脂肪细胞的鉴定
从孵箱内取出诱导8天的细胞培养皿，弃去细胞诱导液，4%的多聚甲醛固定1小 时，加入60%异丙醇溶液冲洗3次，加入油红O溶液孵育10分钟，双蒸水冲洗后观察。
显微镜下观察，在漩涡状排列的细胞集落中央，可观察到散在的充满脂滴的脂肪 细胞形成，细胞形态呈短梭形或圆形，油红O染色显示脂滴为红色(图1)。对照组染色为阴 性(图2)。
以上对本发明较佳实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本 发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
权利要求
1.一种诱导细胞分化的试剂盒，用于将骨髓间充质干细胞诱导分化为脂肪细胞，包括 脂肪细胞诱导培养液，该脂肪细胞诱导培养液包括ImM地塞米松溶液；0. 05M1-甲基-3-异丁基黄嘌呤溶液；以及胎牛血清。
2.权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述脂肪细胞诱导培养液进一步包括10yg/mL胰岛素溶液；以及α -MEM液体培养基。
3.权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述脂肪细胞诱导培养液的组分比 例为ImM地塞米松溶液90 μ 1 110μ 1，0. 05Μ1-甲基_3_异丁基黄嘌呤溶液0. 8ml 1. 2ml, 10 μ g/mL胰岛素溶液600 μ 1 650 μ 1，胎牛血清5ml 15ml，加α -MEM液体培养 基定容到100ml。
4.权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述脂肪细胞诱导培养液的组分比例为 ImM地塞米松溶液100 μ 1,0. 05Μ1-甲基-3-异丁基黄嘌呤溶液1ml，10 μ g/mL胰岛素溶液 625 μ 1，胎牛血清IOml，加α -MEM液体培养基定容到IOOml。
5.权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括脂肪细胞鉴定液，该 脂肪细胞鉴定液包括细胞固定液、染色剂、以及细胞洗涤剂，其中，所述染色剂为油红0溶 液。
6.权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述细胞固定液为4%的多聚甲醛溶液；所 述细胞洗涤剂为60%异丙醇溶液和双蒸水。
7.权利要求1 6之一所述的试剂盒在将大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为脂肪细胞 中的应用。
8.一种诱导细胞分化的方法，用于将骨髓间充质干细胞诱导分化为脂肪细胞，包括以 下步骤a、获取并扩增骨髓间充质干细胞；b、将所述骨髓间充质干细胞转入脂肪细胞诱导培养液中培养7 9天，所述脂肪细胞 诱导培养液包括ImM地塞米松溶液、0. 05M1-甲基-3-异丁基黄嘌呤溶液、以及胎牛血清。
9.权利要求8所述的方法，其特征在于，进一步包括以下步骤C、弃去所述脂肪细胞诱导培养液，用固定液固定之后，加入细胞洗涤剂冲洗，然后加入 染色剂孵育，双蒸水冲洗后观察分化后的脂肪细胞。
10.权利要求9所述的方法，其特征在于，所述细胞洗涤剂为60%异丙醇溶液，所述染 色剂为油红0溶液。
全文摘要
本发明提供一种诱导大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化的试剂盒及方法。该试剂盒包括脂肪细胞诱导培养液和脂肪细胞鉴定液。诱导培养液包括细胞培养液A、细胞培养液B、细胞培养液C、细胞培养液D、细胞培养液E。脂肪细胞鉴定液包括细胞固定液、染色剂、洗涤剂A和洗涤剂B。所述细胞培养液A为α-MEM液体培养基；细胞培养液B为胎牛血清；细胞培养液C为地塞米松溶液；细胞培养液D为1-甲基-3-异丁基黄嘌呤溶液；细胞培养液E为胰岛素溶液；细胞固定剂为多聚甲醛溶液；染色剂为油红O溶液；洗涤剂A为60％异丙醇溶液；洗涤剂B为双蒸水。
文档编号C12N5/0775GK102041244SQ20101056920
公开日2011年5月4日 申请日期2010年11月26日 优先权日2010年11月26日
发明者孙建和, 杨仕明, 杨伟炎, 秦贺, 翟所强, 赵立东, 郭维维 申请人:中国人民解放军总医院