专利名称：一种纳米基因导入材料的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因导入材料
背景技术：
基因导入系统或方法可以分为两类病毒型基因导入系统，以逆转录病毒、腺病 毒、腺相关病毒为载体；非病毒型基因导入，如显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀、阳离子脂 质体法、以及新兴的纳米基因导入材料。由于病毒型基因导入系统存在许多严重的不足，如 病毒转染有可能激活原癌基因等，故非病毒型转染方式是目前的研究热点，在上述非病毒 式转染中，显微注射一次只能处理一个细胞；基因枪穿透力十分有限；磷酸钙共沉淀法结 果不稳定；仅阳离子脂质体法表现了良好的转染效率，但是过高的毒性又限制了它的应用。
发明内容
针对现有技术的缺点，本发明的目的是提供一种纳米基因导入材料，具有良好的 细胞相容性、低毒、稳定且较高的转染效率。为了实现上述目的，本发明的技术方案为一种纳米基因导入材料，由HAuCl4和 N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]-1，2-乙二胺为原料合成AuNPs/氨基硅烷纳米球复合材料， 其中HAuCl4与N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]-1，2-乙二胺的比率为1 4。与现有技术相比，本发明具有以下的优越性(1)具有较高的转染效率，在人血管 平滑肌细胞中可以达到40%左右；(2)低毒性，因AuNPs/氨基硅烷纳米的复合材料具有良 好的生物相容性，细胞生存率很高；C3)材料分散性良好，符合对转染的要求；(4)非常低的 成本，氨基是食品添加剂，成本很低，另外实验中使用的化学药品，氨水都是常见廉价试剂；材料制备反应简单易操作，可重复性好。
图1为AuNPs/氨基硅烷纳米的扫描电镜图片。图2为AuNPs/氨基硅烷纳米的投射电镜图片。图3为转染后的倒置荧光显微镜下的荧光图片。图4为转染后的细胞生存率图片。图5为转染效率图。
具体实施例方式一、材料的制备1、主要材料四水合氯金酸(HAuCL4 · 4H20)，N, N- 二甲基甲酰胺(DMF)为分析纯，为上海国药 集团化学试剂有限公司生产。N-[3_(三甲氧基硅基)丙基]-1，2-乙二胺为Alfa Aesar, 公司生产，纯度为90%。所有试剂使用前没有进行进一步的纯化。
2、材料的制备IOmL具塞锥形瓶中加5mL DMF，加50微升0. IM HAuCl4水溶液加3. 6微升SiEN， 搅拌均勻后放入60°烘箱中加热20h。冷至室温后，产品离心(15000rpm，5min)Jt0H洗3次。二、结合性能的测定1、主要材料绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-Cl) ；HEPES平衡盐溶液(自配)；电泳缓冲液 (0. 5XTBE,自配)；DNA上样缓冲液；溴化乙啶(EB)。2、主要方法1 μ L AuNPs/氨基硅烷纳米溶液(5mg AuNPs/氨基硅烷纳米溶解在500 μ L双蒸水 中)与 1 μ LpEGFP-C 1 水溶液(0. 1 μ g/ μ L)以及 8 μ 1 双蒸水(pH = 7. 4water)在 1. 5mL 离心管中混合，置于室温下30分钟让其充分结合。AuNPs/氨基硅烷纳米和pEGFP-Cl的质 量比分别用100 1,50 1,30 1,10 1,1 1。在5000rpm的速度下离心5min。将 沉淀物加载到的琼脂糖(ΕΒαι μ g/mL)在TAE的缓冲下，在100V电压下跑40min，然后 在320nm处观察条带。3、结果请参阅图1和图2，结果观察，有多种条带出现，这是因为pEGFP-Cl有多种构型所 致。在质量比10 1,1 1处条带清晰明显，说明在这些质量比之下，DNA和纳米颗粒结 合不是很好，到了 100 1,50 1,30 1条带消失，说明结合完全了。这些结果表明带正电荷的pEGFP-Cl和AuNPs/氨基硅烷纳米有一个最佳的结合 比，超出30 1以后过多的纳米颗粒显得不再重要，所以使用30 1进行转染。三、转染1、主要材料人体脐静脉内皮细胞(HUVEC) ；AuNPs/氨基硅烷纳米@pEGFP_Cl联合体(上述制 备)；DMEM培养基；胎牛血清FBS ；6孔培养板。2、主要方法(1)细胞的培养将HUVEC用胰蛋白酶-EDTA消化下来，计数后加入到6孔板中 (5 X IO6/孔)，用含FBSlO %的DMEM溶液并加转染优化试剂培养至细胞密度为60 % 70 % 的融合度。(2)细胞转染实验将培养好的细胞上清除去，换新的培养液并加入质量比30 1 的AuNPs/氨基硅烷纳米@pEGFP-Cl联合体。请参阅图3、图4和图5，培养48小时后分别 对其荧光、细胞存活率(碘化吡啶标识，流式细胞仪检测)、转染效率(流式细胞仪检测)进 行测定。3、结果分析荧光图可以看出有明显绿色荧光，并且覆盖面比较大。细胞生存率图分别为无添 加物、AuNPs/氨基硅烷纳米@pEGFP-Cl联合体、lipofectamine 2000ipEGFP-Cl联合体的生 存率，可以看到AuNPs/氨基硅烷纳米@pEGFP-Cl联合体对细胞生存率的影响是很小的。比 lipofectamine 20000 pEGFP-Cl联合体的影响小很多。转染效率图可以看到AuNPs/氨基 硅烷纳米@pEGFP-Cl联合体可以达到约55%的转染效率，这是在保证了细胞生存率的前提下达到了一个如此的转染效率。虽然不及lipofectamine 2000高，但是其高细胞相容性是 lipofectamine2000所无法比拟的，表现出了 AuNPs/氨基硅烷纳米做为转染试剂的巨大潜 力。
权利要求
1. 一种纳米基因导入材料，由HAuCl4三甲氧基硅基)丙基]-1，2-乙二胺为原料合成AuNPs/氨基硅烷纳米球复合材料，其中HAuCl4与N-[3-(三甲氧基硅基)丙 基]-1，2-乙二胺的比率为1 4。
全文摘要
本发明公开了一种纳米基因导入材料，由HAuCl4和N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]-1，2-乙二胺为原料合成AuNPs/氨基硅烷纳米球复合材料，其中HAuCl4与N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]-1，2-乙二胺的比率为1∶4。本发明具有良好的细胞相容性、低毒、稳定且较高的转染效率。
文档编号C12N15/63GK102071209SQ201010574319
公开日2011年5月25日 申请日期2010年12月6日 优先权日2010年12月6日
发明者刘勇, 周鸿雁, 常光其, 张德元, 徐安武, 徐建波, 李梓伦, 王冕, 王深明, 王雷, 胡作军 申请人:张德元, 徐安武, 王深明