专利名称：Gfp泄露试验方法
技术领域：
本发明涉及一种毒理学检测方法，尤其是化妆品毒理学检测方法，属于毒理学检测技术领域。
背景技术：
目前，活体兔眼刺激(Draize)试验广泛用于化妆品安全性评价，但因其评分系统存在主观性，同时由于大量使用试验动物，因对其造成损害而受到各动物保护组织的反对。 在全球化动物保护运动的影响下，发达国家普遍开展了以替代、减少和优化为核心的“3R” 运动。在化妆品安全性评价中，体外替代实验将逐步取代动物实验。因而，国内外科学家在发展科学可靠的眼刺激试验离体替代方法方面进行了大量探索，包括离体器官模型、绒毛膜尿囊膜试验和离体细胞试验等。在动物试验中，至少要对角膜、结膜及虹膜三种组织的病理反应进行观察并进行评分，单一的体外方法难以完全模拟所有组织的反应，目前尚没有任何一种方法有充分的试验依据证明能完全替代动物眼刺激性试验。目前研究较多的替代试验有鸡胚绒毛膜尿囊膜试验、红细胞溶血试验、血红蛋白变性试验、MTT试验等。这些方法在操作简便性、适用的受试物谱、特异性和准确性等方面各有优缺点。
发明内容
为了克服现有试验方法的上述不足，本发明提供一种检测SIRC细胞(兔眼角膜细胞)中GFP(绿色荧光蛋白)泄露率的试验方法。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是GFP泄露试验方法，包括下列步骤A.含有表达载体I3Shuttle-CMV-GFP的腺病毒包装细胞的选择293细胞培养于10%胎牛血清的RPMI1640培养基，SIRC细胞贴壁培养于10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，培养条件为37°C，5% CO2 (—般2 3天传代一次)；将含有 Pshuttle-CMV-GFP目的基因的载体病毒转染293细胞中；B.腺病毒制备和滴度测定取50ml 293细胞，70%铺满，常规细胞培养，使细胞数达到105/mL，用96孔酶标板铺板，每孔加入100 μ L细胞悬液，共铺10排；准备10个1. 5mLEP管，每管加900 μ L的无血清RPMI 1640培养基，第一管加100 μ L病毒液，混勻；取100 μ L第一管的病毒液加入到第二管，按梯度稀释法稀释直到第九管；在上述96孔酶标板的每行加入一个稀释度的病毒液 100μ 1，第10排加无血清的培养基作为阴性对照；37°C、CO2温箱孵化7-10天，观察细胞出现CPE的情况；记数每排出现CPE的孔数，计算细胞病变率(如某一浓度各孔细胞全部病变，比率为1，如无细胞病变，则比率为0)T = 101+d ^0-5VmL ；d = Log 10稀释度(如为10倍稀释度，d= 1)；
S =各浓度中CPE细胞病变比率之和；
根据KARBER公式计算出用于细胞感染的病毒滴度为107TCID5(1/mL ；C. GFP阳性细胞悬液和细胞裂解液的制备取80%汇合度的细胞，用已确定滴度的Pshuttle-CMV-GFP病毒液感染，24h后用荧光显微镜观察细胞发光情况；当细胞GFP阳性率达到80%以上时，收集细胞，制备成 5X 105/mL细胞悬液；细胞悬液经反复冻融，制成细胞裂解液；D.受试物处理和荧光检测将受试物用含牛血清白蛋白的0. lmol/L的PBS配成浓度为IO^UW和0. 1% 的溶液、悬液或悬浊液，向容积为500 μ L的EP管中加入2001 μ L细胞悬液或细胞裂解液和200 μ L受试物；对照组以含牛血清白蛋白的0. lmol/L的PBS替代受试物以计算自溶发光值；每处理组重复样本数为3 ；在37°C摇床中孵育lOmin，加入细胞悬液的处理组以 2000r/min离心lOmin，取上清液200 μ L加入96孔酶标板；加入细胞裂解液的处理组直接取200 μ L加入96孔酶标板，在酶标仪上以485nm和535nm测其发光度值；E. GFP漏出率、GFP变性率计算GFP泄漏率=[(受试物上清液发光度值-对照上清液发光度值)/对照发光度 it] X 100% ；GFP变性率=[(对照裂解液发光度值-受试物裂解液发光度值)/对照裂解液发光度值]X100%。本方法眼刺激性判定标准为将GFP变性率或GFP泄漏率中任意一项大于等于 25%的受试物判定为眼刺激阳性，将GFP变性率和GFP泄漏率同时小于25%的受试物判定为眼刺激阴性。本方法以腺病毒表达载体(Pshuttle-CMV-GFP)病毒液感染SIRC细胞为例，表达 GFP后制成细胞悬液和裂解液，分别与受试物孵育，检测细胞GFP的泄漏率和变性率，分析细胞GFP泄漏率与受试物MMAS值的相关性，从而建立一种替代试验的方法(通过药物对发光细胞处理替代眼刺激实验方法)。GFP来自发光水母，不存在于高等生物细胞，易于观察和检测，因此是生物医学研究中常用的生物标记蛋白。本方法采用化妆品常用原料处理转GFP基因的哺乳动物细胞， 测定从细胞中泄漏的GFP的含量。本发明的有益效果是，成本低，操作简便快速、适用受试物谱广、预测准确性高；利用腺病毒载体转导目的基因具有高效率、低致病性、高滴度、以及在体内不整合入宿主细胞染色体等优点。本方法具有很好的稳定性和可靠性。本发明仅以兔角膜上皮细胞(SIRC细胞)为例，所建立的方法也适用于Hela、h印G2、C2C12等细胞系。本发明仅以腺病毒表达载体为例，其中也包括能在细胞中表达绿色荧光蛋白的其他转基因方法，如质粒、逆转录病毒、慢病毒等方法。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明进一步说明。利用腺病毒表达载体I^shuttle-CMV-GFP病毒液感染SIRC细胞，待其表达GFP后制成细胞悬液和裂解液，分别与各种受试物不同浓度的溶液(或悬液)孵育；最后利用酶标仪检测细胞GFP的泄漏率和变性率，并分析细胞GFP泄漏率与受试物MMAS值的相关性，从
4而建立一种替代动物实验的方法，即检测SIRC细胞中GFP泄漏率的试验方法。受试物包括 表面活性剂、酸、碱、醇、酯、酮、胺、无机盐和有机盐类，表1给出了 18种受试物名称及MMAS值。实施方式一受试物为乳酸将293细胞培养于10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，SIRC细胞培养于10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，培养条件为37°C，5% CO2 ；一般2 3天传代一次；取80%汇合度的细胞，用T = IO7TCID5ciAiL的I^shuttIe-CMV-GFP病毒液感染，24h后用荧光显微镜观察细胞发光情况；当细胞GFP阳性率达到80 %以上时，收集细胞，制备成5 X IOVmL细胞悬液； 取部分细胞悬液经反复冻融，制成细胞裂解液；将乳酸用含牛血清白蛋白的0. lmol/L 的PBS配成浓度为10%、1 %和0. 1 %的溶液，向容积为500 μ L的EP管中加入200 μ L细胞悬液或细胞裂解液和200 μ L乳酸；对照组以含牛血清白蛋白的0. lmol/L的PBS替代乳酸；每处理组重复样本数为3 ；在37°C摇床中孵育lOmin，以2000r/min离心lOmin，取上清液200 μ L加入96孔酶标板；在酶标仪上以485nm和535nm测乳酸处理组上清液发光度值、对照组上清液发光度值以及对照组发光度值分别为6626. 67,6565. 33和20194，计算得出GFP漏出率为0. 3% ；在酶标仪上以485nm和535nm测对照组裂解液发光度值、乳酸组裂解液发光度值分别为30730和317，计算得出GFP变性率为98. 97%。说明乳酸GFP变性为阳性(变性率彡25% )，划定乳酸为眼刺激阳性。实施方式二 受试物为异丙醇将293细胞培养于10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，SIRC细胞培养于10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，培养条件为37°C，5% CO2 ；一般2 3天传代一次；取80%汇合度的细胞，用T = IO7TCID5ciAiL的I^shuttIe-CMV-GFP病毒液感染，24h后用荧光显微镜观察细胞发光情况；当细胞GFP阳性率达到80 %以上时，收集细胞，制备成5 X IOVmL细胞悬液； 取部分细胞悬液经反复冻融，制成细胞裂解液；将异丙醇用含牛血清白蛋白的0. Imol/ L的PBS配成浓度为10%、1%和0. 的溶液，向容积为500yL的EP管中加入200yL细胞悬液或细胞裂解液和200yL异丙醇；对照组以含牛血清白蛋白的0. lmol/L的PBS替代异丙醇；每处理组重复样本数为3 ；在37°C摇床中孵育lOmin，以2000r/min离心lOmin， 取上清液200 μ L加入96孔酶标板；在酶标仪上以485nm和535nm测异丙醇处理组上清液发光度值、对照组上清液发光度值以及对照组发光度值分别为21378. 67,3253和27214，计算得出GFP漏出率为66. 6% ；在酶标仪上以485nm和535nm测对照组裂解液发光度值、异丙醇组裂解液发光度值分别为38882和12935. 5，计算得出GFP变性率为66. 73%。说明异丙醇处理组GFP变性为阳性(变性率彡25% )，划定异丙醇为眼刺激阳性。实施方式三受试物为甘油将293细胞培养于10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，SIRC细胞培养于10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，培养条件为37°C，5% CO2 ；一般2 3天传代一次；取80%汇合度的细胞，用T = IO7TCID5ciAiL的I^shuttIe-CMV-GFP病毒液感染，24h后用荧光显微镜观察细胞发光情况；当细胞GFP阳性率达到80 %以上时，收集细胞，制备成5 X IOVmL细胞悬液；取部分细胞悬液经反复冻融，制成细胞裂解液；将甘油用含牛血清白蛋白的0. lmol/L 的PBS配成浓度为10%、1 %和0. 1 %的溶液，向容积为500 μ L的EP管中加入200 μ L细胞悬液或细胞裂解液和200 μ L甘油；对照组以含牛血清白蛋白的0. lmol/L的PBS替代甘油；每处理组重复样本数为3 ；在37°C摇床中孵育lOmin，以2000r/min离心lOmin，取上清液200 μ L加入96孔酶标板；在酶标仪上以485nm和535nm测甘油处理组上清液发光度值、对照组上清液发光度值以及对照组发光度值分别为8207、8122. 67和20344. 7，计算得出GFP漏出率为0. 41 % ；在酶标仪上以485nm和535nm测对照组裂解液发光度值、甘油组裂解液发光度值分别为30336和30971. 5，计算得出GFP变性率为0. 02%。说明甘油处理组GFP变性为阴性(变性率<25% )，且GFP泄漏率低于25%，划定甘油为眼刺激阴性。由于活体兔眼刺激试验(Draize Test)是判断化合物眼睛刺激性的经典方法，因此选用18种受试物的MMAS值与细胞GFP泄漏率进行分析。酸性和碱性受试物导致GFP变性，其它受试物对细胞GFP泄漏的作用与受试物的MMAS值和浓度有关。浓度为5%时，大多数皿仪3值> 15的受试物对SIRC细胞的GFP的泄漏有明显作用；而在0.5%和0. 05%浓度时仅有少数受试物(主要是表面活性剂)导致细胞GFP泄漏率>25%。选取GFP变性为阴性(变性率< 25% )且100%浓度的MMAS值已知的受试物，分析受试物浓度为5%时SIRC 细胞GFP泄漏率与受试物MMAS值的相关性，相关系数达到0. 888，因此，将GFP变性率为阳性(彡25% )的受试物判定为具有眼刺激性，对于GFP变性为阴性(变性率< 25% )的受试物，将GFP泄漏率25%定为“界定值”判断受试物的眼刺激性。为了排除Draize试验中受试物浓度差异对相关性分析的影响，选用文献报道的浓度100%时的受试物MMAS值与本试验得到5%浓度时的GFP泄漏率进行相关性分析，共有11种受试物(表1中序号3-8，13， 15-18)满足分析条件。结果表明这11种受试物100%浓度时的MMAS与本试验5%浓度时的GFP泄漏率的相关系数为0. 888 (ρ < 0. 001)。在GFP泄漏试验中，如果将GFP泄漏率 25%定为“界定值”，11种受试物全部被正确划分，其中7种眼刺激阳性，4种眼刺激阴性。表1
权利要求
1. 一种GFP泄露试验方法，其特征在于，包括下列步骤A.含有表达载体I^shuttle-CMV-GFP的腺病毒包装细胞的选择293细胞培养于10% 胎牛血清的RPMI1640培养基，SIRC细胞贴壁培养于10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，培养条件为37°C，5% CO2 ；将含有I^shuttle-CMV-GFP目的基因的载体病毒转染293细胞中；B.腺病毒制备和滴度测定取50ml 293细胞，70 %铺满，常规细胞培养，使细胞数达到105/mL，用96孔酶标板铺板，每孔加入100 μ L细胞悬液，共铺10排；准备10个1. 5mLEP管，每管加900 μ L的无血清RPMI 1640培养基，第一管加100 μ L病毒液，混勻；取100 μ L第一管的病毒液加入到第二管，按梯度稀释法稀释直到第九管；在上述96孔酶标板的每行加入一个稀释度的病毒液 100μ 1，第10排加无血清的培养基作为阴性对照；37°C、CO2温箱孵化7-10天，观察细胞出现CPE的情况；记数每排出现CPE的孔数，计算细胞病变率T = io1+d(s-°-5)/mL ；d = Log 10稀释度；S =各浓度中CPE细胞病变比率之和；根据KARBER公式计算出用于细胞感染的病毒滴度为IO7TCID5ciAiL ；C.GFP阳性细胞悬液和细胞裂解液的制备取80%汇合度的细胞，用已确定滴度的I^shuttle-CMV-GFP病毒液感染，24h后用荧光显微镜观察细胞发光情况；当细胞GFP阳性率达到80%以上时，收集细胞，制备成5 X IO5/ mL细胞悬液；细胞悬液经反复冻融，制成细胞裂解液；D.受试物处理和荧光检测将受试物用含牛血清白蛋白的0. lmol/L的PBS配成浓度为IO^UW和0. 1 %的溶液、悬液或悬浊液，向容积为500 μ L的EP管中加入200 μ L细胞悬液或细胞裂解液和 200 μ L受试物；对照组以含牛血清白蛋白的0. lmol/L的PBS替代受试物以计算自溶发光值；每处理组重复样本数为3 ；在37°C摇床中孵育lOmin，加入细胞悬液的处理组以 2000r/min离心lOmin，取上清液200 μ L加入96孔酶标板；加入细胞裂解液的处理组直接取200 μ L加入96孔酶标板，在酶标仪上以485nm和535nm测其发光度值；E.GFP漏出率、GFP变性率计算GFP泄漏率=[(受试物上清液发光度值-对照上清液发光度值)/对照发光度 it] X 100% ；GFP变性率=[(对照裂解液发光度值-受试物裂解液发光度值)/对照裂解液发光度值]X100%o
全文摘要
本发明公开了一种GFP泄露试验方法，属于毒理学检测技术领域。该方法采用转基因技术获得表达GFP(绿色荧光蛋白质)的动物细胞，然后制备细胞悬液和裂解液，分别与受试物孵育后检测GFP的荧光值，计算细胞GFP泄漏率和变性率。通过分析细胞GFP泄漏率和变性率与受试物MMAS值的关系，建立了一种通过GFP泄漏率和变性率判断受试物眼刺激性的替代试验方法。本发明所建立的检测方法成本低，操作简便快速、适用受试物谱广、预测准确性高、稳定性好，是一种有前途的眼刺激性替代试验方法。利用腺病毒载体转导目的基因具有高效率、低致病性、高滴度、以及在体内不整合入宿主细胞染色体等优点。
文档编号C12Q1/02GK102168081SQ201010586179
公开日2011年8月31日 申请日期2010年12月14日 优先权日2010年12月14日
发明者吴孟茹, 帅培强, 张广峰, 林琳, 谭志, 陈祥贵 申请人:四川出入境检验检疫局检验检疫技术中心, 西华大学