专利名称：使用非血红素卤素过氧化物酶由羧酸酯底物酶催化制备过酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及过酸的生物合成和原位酶催化领域。具体地说是，用具有过水解活性的非血红素卤素过氧化物酶(haloperoxidase)由羧酸酯底物制备过酸。
背景技术：
已经报导，过酸组合物是有效的抗微生物试剂。用其对坚硬表面、肉制品、活植物组织和卫生器材进行清洁、灭菌和/或消毒以抵抗不受欢迎的微生物的生长的方法已经有所描述(US 6，545，047，US6, 183，807，US 6，518，307，US 20030026846 和 US 5，683，724)。 还有报导表明，过酸可以有效地用于制备洗衣店去污用漂白组合物(US3，974，082，US 5，296，161 和 US 5，364，554)。过酸可以通过羧酸与过氧化氢的化学反应来制备(参见OrganicPeroxides, Daniel Swern 编辑，第 1 卷，第 313-516 页；Wiley Interscience, New York)。强无机酸， 例如浓硫酸，通常能够催化所述反应。过氧化氢与羧酸的反应是平衡反应，所以使用过量浓度的过氧化物和/或羧酸或者除去水是有利于过酸的产生的。化学反应制备过酸存在几个缺点a)为了有利于制备过酸而使用高浓度的羧酸会导致在使用含有过酸的溶液时会产生不受欢迎的气味，2)随着时间的推移过酸在溶液中通常是不稳定的，所以在使用前的储存期间溶液中过酸的浓度会降低，和3)由于使用浓硫酸作催化剂所以所得制剂通常是强酸性的。克服化学制备过酸的缺点的一种方式是使用酶催化剂来代替强酸催化剂。酶催化剂的使用使得能够在使用和/或应用的时候快速地制备过酸，从而避免了与过酸溶液储存和过酸溶液浓度随时间改变有关的问题。通过与过氧化氢直接进行化学反应制备过酸一般需要使用高浓度的羧酸，而酶催化制备过酸则不需要使用这样的高浓度的羧酸，其中所述酶催化的反应能够使用羧酸酯底物在比化学反应通常使用的羧酸浓度低的多的浓度下进行。酶反应可以在很大的PH值范围内进行，其取决于给定pH值下的酶的活性和稳定性以及给定PH值下底物对过水解作用的特异性。酯酶、脂肪酶和一些蛋白酶能够催化烷基酯的水解从而制备出相应的羧酸(式 1)。式1
4脂肪酶、酯酶或蛋白酶 R1COOR2 + H2O -> R1COOH + HOR2一些酯酶、脂肪酶或蛋白酶显示出过水解活性，能够从烷基酯催化合成过酸(式 2)。式2
脂肪酶、酯酶或蛋白酶 R1COOR2 十 H2O2 -> R1COOOH + HOR20. Kirk 等人(Biocatalysis，ll :65_77 (1994))研究了水解酶(脂肪酶、酯酶和蛋白酶)催化酰基底物与过氧化氢的过水解反应形成过氧羧酸的能力，其报导在含水体系中过水解反应进展的效率极低。此外，他们发现脂肪酶和酯酶能够将过羧酸分解为相应的羧酸和过氧化氢。作者推断酯酶、脂肪酶和蛋白质通常不适合液相环境中的简单酯的过水解催化，所述简单酯例如辛炔酸甲酯和三辛精。US 3，974，082描述了通过将所要漂白的材料与含有能够释放氧气的无机过氧化物、酰基烷基酯和能够水解酯的酯酶或脂肪酶的水溶液相接触来制备洗衣店去污用漂白组合物。US 5，364，554描述了一种活化的氧化体系，该体系能够使用蛋白酶类酶、过氧化氢源和酯底物在含水溶液中原位产生过酸，其中所述酯底物优选不能化学地过水解。还公开了漂白的方法和形成过酸的方法。US 5，296，161描述了在含水溶液中制备过酸，其中所述含水溶液中包含一种或多种特异性的酯酶和脂肪酶、过氧化氢源和适合用在漂白组合物中的功能化酯底物。然而，其所制得的过酸的浓度通常不能满足许多商业消毒剂应用的需要。大多数已知的用酶催化剂由相应的羧酸酯制备过酸的方法不能产生并积聚足够高浓度的过酸以在各种应用中进行有效的消毒。最近报导有几种蛋白酶和脂肪酶的组合物能够在原位产生过酸(例如过乙酸)并且所产生的过酸的浓度适合用作消毒剂和/或商业漂白剂(US11/413，246)。然而，仍然需要发现其他的能够用于在原位制备过酸的酶催化剂。卤素过氧化物酶广泛地存在于自然界，通常发现于动物、植物、细菌、真菌和藻类中。首次发现的卤素过氧化物酶据报导含有血红素作为辅基或辅助因子。后来，有许多非血红素卤素过氧化物酶得到了鉴定，这些非血红素卤素过氧化物酶主要来自于细菌。卤素过氧化物酶能够催化卤离子(X = Cl，Br或I)在过氧化氢存在下的氧化以生成相应的次卤酸，所述次卤酸是一种反应性氧类物质，已经报导其具有比过氧化氢更好的抗微生物活性(式3)。式3
非血红素卤素过氧化物酶
H2O2 + X" + H+->HOX + H2O 对来自吡咯菌素假单胞菌(Pseudomonas pyrrocinia)的非血红素卤素过氧化物酶进行植物重组表达已经被报导能够提高对病原体抵抗力(Jacks等人，US 6，703，540)。 Jacks等人报导重组表达的非血红素商素过氧化物酶还显示能够催化乙酸和过氧化氢之间的反应，形成抗微生物剂过乙酸。转基因植物中次卤酸和过乙酸产量的增加与病原体抵抗力的增加有关。然而，后来报导在表达吡咯菌素假单胞菌非血红素卤素过氧化物酶的转基因植物中对真菌病原体黄曲霉(Aspergillusflavus)的抵抗力的增加可能并不是由于过乙酸的形成，因为在将所述底物氧化为过乙酸酯之前，酶饱和所需的底物(过氧化氢或乙酸酯)的浓度是致命(对真菌病原体)的(Jacks等人，J. Agric. Food Chem. 48 4561-4564 (2000) Jacks 等人，J. Agric. Food Chem.，50 :706_709 (2002))。所要解决的问题是提供一种在原位酶催化制备过酸的方法并且所制得的过酸的浓度适合用于各种消毒应用。优选地，用于制备过酸组合物的底物应该是相对无毒且便宜的，例如羧酸酯。
发明内容
上述问题已经通过发现非血红素卤素过氧化物酶在无机源过氧源(例如过氧化氢)和羧酸酯底物的存在下能够在原位制备足以用作消毒剂和/或漂白剂浓度的过酸。在本发明的一个方面，提供了一种水酶催化方法，所述方法能够用非血红素卤素过氧化物酶与所选择的底物结合在原位产生过酸，所述方法包括a)提供一组过酸反应组分，所述组分包括1)底物，其选自i)具有以下结构的酯
权利要求
1. 一种用酶催化制备的含水过酸组合物减少坚硬表面或无生命物体上的微生物种群的方法，所述方法包括a)提供一组过酸反应组分，所述组分包括 1)底物，其选自 i)具有以下结构的酯
2.如权利要求1所述的方法，其中在所述反应组分合并30分钟内使所述坚硬表面或无生命物体与步骤c)或步骤d)中制备的过酸接触。
3.如权利要求2所述的方法，其中在所述反应组分合并10分钟内使所述坚硬表面或无生命物体与步骤c)或步骤d)中制备的过酸相接触。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述微生物的浓度减少至少4-log。
5.如权利要求1所述的方法，其中pH范围小于6.5。
6.如权利要求5所述的方法，其中pH范围小于4.5。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述酯底物选自乳酸甲酯、乳酸乙酯、乙酸乙酯、乙醇酸甲酯、乙醇酸乙酯、甲氧基乙酸甲酯、甲氧基乙酸乙酯、3-羟基丁酸甲酯、3-羟基丁酸乙酯以及他们的混合物。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述酯底物选自乳酸乙酯、乙酸乙酯以及他们的混合物。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述甘油酯底物选自单乙酸甘油酯、二乙酸甘油酯、 三乙酸甘油酯、单丙酸甘油酯、二丙酸甘油酯、三丙酸甘油酯、一丁酸甘油酯、二丁酸甘油酯、三丁酸甘油酯和他们的混合物。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述甘油酯底物选自二乙酸甘油酯和三乙酸甘油
11.如权利要求1所述的方法，其中过酸是以至少500ppb的浓度在2小时内制备的。
12.如权利要求11所述的方法，其中过酸是以至少Ippm的浓度在2小时内制备的。
13.如权利要求12所述的方法，其中过酸是以至少5ppm的浓度在2小时内制备的。
14.如权利要求1所述的方法，其中所制备的过酸选自过乙酸、过丙酸、过丁酸、过乳酸、过乙醇酸、甲氧基过乙酸、过_ β _羟基丁酸以及他们的混合物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所制备的过酸是过乙酸。
16.如权利要求1所述的方法，其进一步包括将步骤(c)中的过酸产物与一种或多种其他试剂混合，所述其他试剂包括防腐剂、消毒剂、杀病毒剂、杀生物剂、抗微生物剂或者他们的混合物。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述的其他试剂是选自醇类、醚类、氯仿、甲醛、苯酚类、β-丙内酯、碘、氯气、汞盐、羟胺、环氧乙烷、乙二醇、季铵化合物、酶和洗涤剂的杀病毒剂。
18.如权利要求16所述的方法，其中所述的其他试剂是选自氯气、二氧化氯、氯异氰脲酸酯、次氯酸盐、臭氧、丙烯醛、胺、氯代酚醛树脂、铜盐、有机_硫化合物和季铵盐的杀生物剂。
全文摘要
本发明涉及使用非血红素卤素过氧化物酶由羧酸酯底物酶催化制备过酸。本发明提供了由羧酸酯制备过氧羧酸的方法。更具体地说是使羧酸酯在原位与无机过氧化物在具有过水解活性的非血红素卤素过氧化物酶的存在下反应生成过氧乙酸，其中所述过水解酶催化剂来源于乳酸杆菌。
文档编号C12N15/53GK102168114SQ20101059135
公开日2011年8月31日 申请日期2006年10月6日 优先权日2005年10月6日
发明者J·E·加瓦根, L·沃纳, M·S·佩恩, R·迪科西莫 申请人:纳幕尔杜邦公司