专利名称：用一粒稻谷鉴定籼稻和粳稻的分子标记方法
用一粒稻谷鉴定籼稻和粳稻的分子标记方法技术领域
本发明属于生物类型鉴别技术领域，具体涉及一种在一粒水稻种子(或稻米)中提 取DNA，并鉴定其籼稻和粳稻特性的方法。技术背景
栽培稻(ftr^a sativa L.)是我国重要的三大粮食作物之一，在我国的农业生产 和经济发展中占有举足轻重地位。栽培稻起源于我国，已有8000多年的栽培历史，目前广 泛种植于全球。在栽培稻的栽培和驯化过程中，由于适应不同的生态环境，产生了显著的籼 稻和粳稻遗传分化。典型的籼稻和典型的粳稻之间已经形成了明显的生殖隔离，故通常将 籼稻和粳稻分成两个亚种籼稻亚种(Orj^a sativa subsp.)和粳稻亚种(ftTza sativa subsp. japonica).籼稻和粳稻不仅在形态、生理和生化性状方面产生了较大的差 异，而且也形成了不同的稻米品质和口感品味等特点。稻米的不同消费人群对于籼稻或粳 稻的喜好是不同的，如北方人更偏重选择粳稻，这就造成了不同类型稻米在价格上有较大 差异。同时在育种中，由于籼稻和粳稻的遗传分化以及上述特征特性，进行籼稻和粳稻的亚 种间有性杂交，可以产生丰富的遗传变异类型而培育出优异的水稻品种；籼稻和粳稻的亚 种间杂种优势，在杂交稻的培育中也具有重要的价值。因此，对于籼稻和粳稻的鉴定，不仅 可以确定特定稻米的商品价值，而且在水稻育种中也具有重要的实践意义。
虽然籼稻和粳稻的准确鉴定极为重要，但是一直以来，对籼稻和粳稻的准确鉴定 都存在较大的问题。传统鉴定籼、粳稻的方法主要依赖于形态性状变异(如株高，株型 等)以及生理生化功能差异。目前用来鉴定籼稻和粳稻最常用的方法是以形态鉴定为基础 的“程氏指数法”，(包括6个性状稃毛、酚反应、穗节长、稻壳色、叶毛和谷粒长宽比)。这 个方法的最大缺点1)由于形态性状受环境的影响较大而导致检测的不准确；2)形态测量 必须要栽种被测水稻样品，从播种到成熟一般需要3-5个月，耗时长；3)形态测量需要一定 的样品群体，故需要较多的水稻样品；大大影响了籼稻和粳稻鉴定的效率。专利“利用水稻 DNA插入或缺失分子标记鉴定籼稻和粳稻的方法”大大提高了籼稻和粳稻鉴定的准确性和 效率。但是，水稻DNA的提取通常是以新鲜叶片来进行，需要将稻种进行萌发，形成幼苗，1 周甚至10天以后才能提取DNA，耗时较长。对于不能萌发出苗的种子，无法提取DNA。以一 粒稻米中提取的DNA为模板，结合InDel分子标记方法，能更快速和高效地确定稻米样品的 籼、粳特性。发明内容
本发明的目的是提供一种仅用一粒稻谷(或稻米)提取DNA，并利用InDel分子标 记电泳和分析，快速和精确鉴定稻谷样品籼稻和粳稻特性的方法。
本发明提出的一粒稻谷鉴定水稻的籼稻和粳稻特性方法，是一种利用一粒稻谷 (或稻米)中提取的微量DNA为模板、插入或缺失(InDel)分子标记以及琼脂糖电泳技术鉴 定水稻品种的方法。具体来说是以一粒稻谷中提取的DNA为模板，利用水稻亚种间DNA序列的特异性差异InDel片段，设计扩增引物组合以及衍生物，对籼稻型等位基因(I)和粳稻 性等位基因(J)的频率或进行计算，并根据这些频率的值(o-ioo%)来确定籼稻和粳 稻的方法。
本发明用于提取一粒稻米中微量DNA样本的方法，具体步骤如下(1)取一粒稻米，研磨成粉末，加入750μ L CTAB提取缓冲液；(2)缓冲液经氯仿/异戊醇萃取后，在700(Γ13(ΚΚ)转/分钟条件下离心；(3)上清液中加入等体积沉淀缓冲液，于-20°C放置30分钟，按步骤(2)离心；所述缓 冲液配方可选为0. 5 1. 5% CTAB，40 60 mmol/L Tris-HCl pH7. 8 8. 5，9. 5 10. 5 mmol/L EDTA ρΗ7· 8 8· 5 ；(4)沉淀物中加入500μ L纯化液，重复步骤(2)；所述纯化液配方可选为9. 5^10. 5 mmol/L Tris-HCl ρΗ7· 8 8· 5,0. 8 1· 2 mmol/L EDTA ρΗ7· 8 8· 5,0. 8-1. 2 mol/L NaCl ；(5)上清液加入无水乙醇，-20°C沉淀DNA，按步骤(2)离心，沉淀物经70%乙醇漂洗、离 心后烘干。
本发明用于鉴定籼稻和粳稻的MDel特异引物一共有40对，具体如下表1
权利要求
1.一种用一粒稻米提取DNA样本的方法，其特征在具体步骤如下(1)取一粒稻米，研磨成粉末，加入750μ L CTAB提取缓冲液；(2)缓冲液经氯仿/异戊醇萃取后，在700(Γ13(ΚΚ)转/分钟条件下离心；(3)上清液中加入等体积沉淀缓冲液，于-20°C放置30分钟，按步骤(2)离心；(4)沉淀物中加入500μ L纯化液，重复步骤(2)；(5)上清液加入无水乙醇，-20°C沉淀DNA，按步骤(2)离心，沉淀物经70%乙醇漂洗、离 后烘干。
2.一种用于鉴定籼稻和粳稻的InDel特异性引物对，其特征在于PCR产物长度差异为24-67bp的寡聚核苷酸及其衍生物序列，共40对，列表如下
3. 一种利用InDel分子标记鉴定籼稻和粳稻的方法，其特征在于具体步骤如下(1)按照权利要求书1所述，从一粒稻谷或稻米中提取DNA样品；(2)采用如权利要求书2所述的40对特异引物，对提取的水稻DNA样品进行PCR扩增；(3)利用琼脂糖电泳方法检测PCR产物；(4)计算基因频率根据PCR产物的电泳结果和读取记录电泳结果中样品在各特异位点上的基因型结果， 使用下述公式来计算样本各特异位点的平均籼稻型基因频率巧或粳稻型基因频率G，其变 化在0-100%之间籼稻型基因频率(％)
全文摘要
本发明属于生物类型鉴别技术领域，具体为一种利用一粒稻谷(或稻米)和插入或缺失(InDel)分子标记来鉴定籼稻和粳稻的方法。本发明从一粒稻谷中提取DNA，利用籼稻93-11和粳稻日本晴的全基因组DNA序列对比而获得的40对特异InDel引物，对水稻种子中提取的DNA进行片段扩增、电泳分离以及电泳图谱的分析来鉴定该水稻样本的籼、粳稻特性。具体而言，以一粒稻谷中提取的DNA为模板，利用40对InDel引物组合，基于聚合酶链式反应和琼脂糖电泳获得的分子指纹图谱进行分析和统计，根据样本40个InDel位点上的93-11基因型和日本晴基因型分子指纹计算出的基因频率(Fi或Fj)，确定被测水稻种子(样品)的籼稻或粳稻特性。本发明仅需检测一粒种子的样品便可获得结果，方法简便快捷，鉴定准确，具有良好的推广应用前景。
文档编号C12N15/11GK102031253SQ20101059178
公开日2011年4月27日 申请日期2010年12月16日 优先权日2010年12月16日
发明者刘苹, 卢宝荣, 蔡星星 申请人:复旦大学