专利名称：一种用于转基因大豆、玉米和棉花检测的标准质粒分子及其构建的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种分子生物学技术领域的质粒分子，具体来说，涉及一种转基因大豆、玉米和棉花检测用标准质粒分子及其构建方法。
背景技术：
自从转基因植物商业化以来，全球转基因植物种植面积不断扩大，1996年到2009 年全球转基因农作物种植面积累计达到6. 9亿公顷，10多年间转基因农作物种植面积增长了 67倍。种植的转基因作物主要是转基因大豆、转基因玉米和转基因棉花。转基因大豆的种植面积最大，5860万公顷，占全球转基因作物种植面积的57%，其次是转基因玉米(2520 万公顷，占25% )和转基因棉花(1340万公顷，占13% )。随着转基因作物的广泛种植，其安全性问题引起了全球公众的普遍重视。在许多国家特别是欧洲联盟，国家立法要求对转基因产品进行标签说明。我国于2001年5月23日发布了《农业转基因生物安全管理条例》，2002年1月5 日公布了农业转基因生物安全评价、标识和进口安全管理二个配套管理办法，确定了第一批实施标识管理的农业转基因生物目录，并于2002年3月20日起正式实施。标识制度的实施依赖于转基因产品检测技术。目前，国际上还没有统一的转基因作物及其产品的标准化检测方法。综合各国的检测方法，主要有两种类型，即基于外源基因表达产物-蛋白质检测和基于外源基因插入的DNA检测。针对插入的外源DNA序列，PCR方法应用最广。PCR检测策略可以分为四种，即通用元件筛选检测、基因特异性检测、构建特异性检测和品系特异性检测。通用元件筛选PCR检测主要是以转基因通用元件CaMV35S启动子和NOS终止子为目的基因片段；基因特异性PCR检测是以插入外源基因的特异性DNA片段作为目的检测片段；品系特异性PCR检测是通过检测外源插入载体与植物基因组的连接区序列实现的。由于每一个转基因植物品系，都具有特异的外源插入载体与植物基因组的连接区序列，并且连接区序列是单拷贝，所以品系特异性检测方法具有较高的特异性和准确性。品系特异性检测已经成为目前转基因检测研究的重点，并逐步地为国际各检测实验室所采用。在应用PCR检测转基因产品时，需要设置阳性对照来对检测活动进行监控。通常以从阳性标准品(CRMs)中提取的基因组DNA作为阳性对照，但由于转基因作物存在生物安全性和和现有技术的限制，转基因作物阳性标准品很难获得，因此亟需研制新型阳性对照材料，以满足不断发展的转基因检测需求。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种转基因大豆、玉米和棉花检测用标准质粒分子及其构建方法，使其可以代替阳性标准物质用于转基因大豆、玉米和棉花的定性和定量PCR检测。利用融合PCR技术的原理设计了玉米Hmg基因、转基因玉米Btl76和MonSlO品系的3'端转化事件的PCR融合引物，经过融合PCR扩增获得了二基因的融合片段。利用分了克隆技术将融合片段插入到质粒分子PTLE8(专利申请号 201010286884.幻，获得了组质粒分子pTLHIO。本发明构建的标准质粒分子pTLHIO可以作为检测过程中的阳性对照，为解决转基因作物检测中标准物质缺乏的难题提供一条有效途径并能有效地保障检测工作的进行。本发明是通过以下实验方案实现的，本发明所述标准质粒分子，以替代转基因大豆品系GTS40-3-2和转PAT大豆、转基因玉米Bt 176和Mon810品系、转基因Bt棉，用于定性和定量PCR检测。该标准质粒分子含有大豆内参基因LeCtinl、35S启动子、NOS终止子、 PAT基因、转基因大豆GTS40-3-2品系的5'端转化事件序列、棉花内源基因Sad特异性片段、转Bt基因棉花的外源基因CrylAb/c融合基因的特异性片段、玉米内参基因Hmg特异性片段、转基因玉米Btl76品系的3'端转化事件和MonSlO品系的3端转化事件特异性片段的部分序列。本发明所述的一种转基因大豆、玉米和棉花检测用标准质粒分子及其构建方法， 包括以下步骤(1)利用GcnBank数据库查找并获得玉米内参基因Hmg、转基因玉米Btl76品系的 3'端转化事件和MonSlO品系的3'端转化事件特异性序列；(2)利用Primer Premier 5. O软件设计PCR特异性引物并进行blast验证；(3)分别扩增上述三个基因；(4)采用融合PCR方法将三个基因拼接成一个片段；第一轮反应以转基因玉米Btl76和Mon810的基因组DNA为模板，以权利要求 3中对应引物进行PCR扩增；反应体系为总体积为50 μ 1，其中10倍Taq缓冲液5 μ 1， dNTPs(10mM)4y 1，上下游引物(10 μ M)各 2μ 1，模板(IOOng/μ 1) 1 μ 1，用 ddH20 补足至 50 μ 1。反应程序为95"C 5min ；30 个循环(94 "C 30s, 58. 2-59. 6 "C 30s, 72 "C 60s)； 72°C IOmin ；4°C保存；产物标记为 PHmg、PBt、PM。n ；第二轮反应，分两步进行扩增第一步取第一轮反产物各70ng，10倍Taq缓冲液5 μ 1，dNIPs (IOmM) 4 μ 1，用 (MH2O 补足至 50 μ 1 ；使 PHmg、Pbo PMon 相连接；反应程序11个循环(94°C 15s，60°C 20s，72°C 10min)，4°C保存；第二步向第一步反应液中分别加入引物Bt-Pl和Hmg-P2各1 μ 1 ；反应程序94°C3min,28 个循环(94°C 15s，60°C lmin，72°C 2min)，4°C保存；将融合PCR产物割胶纯化后标记为PBH3。(5)因收纯化PBH13，连接于pMD 19-TSimple载体，转入大肠杆菌T0P10筛选得到中间质粒分子PTBH3。(6)将质粒分子pTLE8和pTBH3分别用限制性内切酶EcoR I和)(bal进行双酶切， 回收这两种酶切产物，用T4DNA连接酶连接获得质粒分子pTLHIO。(7)标准质粒分子pTLHIO的定量PCR检测方法验证。所述的定量PCR验证，是指用定量PCR方法分析构建的标准质粒分子pTLHIO中玉米内源基因HmgI和转基因玉米Btl76、Mon810品系转化事件特异性序列的定量检测极限以及重复性和重演性等特性，以鉴定该标准质粒分子代替阳性标准物质的能力本发明有益结果在于，利用融合PCR、酶切、连接等分子克隆技术构建了含有十个基因的标准质粒分子pTLHIO。此标准质粒分子可以代替阳性标准物质用于转基因大豆、玉米和棉花的定量PCR检测，很好的解决了检测过程中阳性标注物质缺乏的问题，在检测过程中无需提供多种阳性基因组DNA作为阳性对照；将该标准质粒分了转入大肠杆菌，可长其稳定保存；也可以在原有标准质粒分子的基础上加入新的外源基因片段，以满足日益增多的转基因作物材料检测的需要。此标准质粒分子PTLHlO在实际检测中具有较高的特异性和重复性、灵敏度高等优点，应用该标准质粒分子进行实际样品定量分析时，样品检测结果的偏差在国际上广泛认可的允许范围内。因此，本发明中构建的标准质粒分子PTLHlO完全适用于对转基因大豆、玉米和棉花及其加工产品中的转基因成分含量的定量分析。
附图为十基因标准质粒分子pTLHIO的测序结果斜体加粗的为融合PCR引物，在十基因之间引入了四个限制性内切酶NotI，Sail， EcoR I和)(ba I。方框内为定量PCR的引物和探针序列。
具体实施例方式为了更充分的解释本发明的实施，提供转基因大豆、玉米和棉花标准分子对照物的制备实施实例。这些实施实例仅仅是解释而不是限制分发明的范围。下列实施例中未标明具条件的实验方法，通常按照常规条件操作实施例1 标准质粒分子的构建一、实验材料转基因玉米Btl76品系和Mon810品系；非转基因玉米品种。二、实验试剂pMD 19-T Simple Vector购自大连宝生物工程公司；dNTPs、Taq DNA聚合酶、DNA marker I、II和marker III购自北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶Not I.Sal I、EcoR I, Xba I购自NEB北京有限公司；质粒基因组DNA提取及纯化采用北京天根生化科技有限公司研制的质粒小量提取试剂盒；其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。三、实验仪器TC-512型PCR扩增仪(英国TECHNE公司)；Geliance 200DNA电泳凝胶成像仪 (美国PerkinElmer公司)；Nano-Drop ND-1000核酸蛋白仪(美国Nano Drop公司)；离心机；恒温水浴锅；培养箱；天平等。四、试验方法和过程1、植物基因组DNA提取-SDS法a、称取0. Ig经粉碎机粉碎的玉米样品，加入Iml 65°C预热的2% SDS抽提液， 10 μ IRNase-A混勻，于65°C温育30min，置于室温后13000r离心lOmin。b、取上清加0. 6倍体积的KAc，冰浴20min后，13000r离心lOmin，取上清加2倍体积预冷无水乙醇，混勻。c、于-20°C静置30min，13000r离心lOmin，充上清，沉淀用70%乙醇洗涤，短时间离心后弃上清，重复一次。自然干燥后加200μ1 TE溶沉淀，20°C保存。d、取2 μ 1提取的DNA样品，用1 %的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量。利用核酸仪测定所提取的DNA浓度和纯度。2、引物设计在GenBank中搜索玉米内源基因Hmg、转基因玉米Btl76品系和Mon810品系的3 ‘ 端转化事件特异性序列，利用软件ft~imer5. 0设计3对定性PCR引物，分别用于扩增玉米内参基因特异性序列Hmg、转基因玉米Btl76品系和MonSlO品系的3'端转化事件特异性序列。具体引物序列见表1。表1构建标准质粒分子的PCR引物序列
权利要求
1.一种转基因大豆、玉米和棉花检测用标准质粒分子，其特征在于，含有大豆内参基因Lectin 1、35S启动子、NOS终止子、PAT基因、转基因大豆GTS40-3-2品系的5'端转化事件35SG、棉花内源基因Sad特异性片段、转Bt基因棉花的外源基因CrylAb/c融合基因的特异性片段、玉米内参基因Hmg特异性片段、转基因玉米Btl76品系的3'端转化事件和MonSlO品系的3'端转化事件特异性片段的部分序列，其先后顺序为Lectin l+35S+N0S+PAT+35SG+Sad+Cryl Ab/c+Bt176+Mon81O+Hmg
2.根据权利要求1所述的转基因大豆、玉米和棉花检测用标准质粒分子，其特征是，所述的大豆内源基因Lectin、棉花内源基因Sad和玉米内源基因Hmg，分别指的是大豆凝集素基因、硬脂酰-酰基载体蛋白脱饱和酶基因和玉米内生高迁移率族基因，其在大豆、玉米和棉花基因组中高度保守，具有种间特异性、种内非特异性和单拷贝数的特点；所述的筛选序列35S是指花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus，CaMV) 35S启动子；所述的NOS是指根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因(N0Q终止子；所述的PAT基因是指草丁膦乙酰转移酶基因(PAT)；所述的转基因大豆GTS40-3-2品系的5'端转化事件35SG是指外源插入载体与大豆基因组的连接区序列；所述的CrylAb/c是指杀虫晶体蛋白CrylAb、CrylAc基因的融合基因(CrylAb/c)；所述的转基因玉米Btl76品系3 ‘端转化事件是指外源插入载体与玉米基因组的连接区序列；所述的转基因玉米MonSlO品系3'端转化事件是指外源插入载体与玉米基因组的连接区序列。
3.根据权利要求1所述的转基因大豆、玉米和棉花检测用标准质粒分子，其中转基因玉米Btl76品系的3'端转化事件、MonSlO品系的3'端转化事件和玉米内参基因Hmg特异性序列的引物序列如下13标基W引物…物序列(5'-3')产物人小(bp)Btl 76Bt-PlGGAATTCGAAGTCCCTGGAGGCACABt-P2AGGTCTTGGCTGTCTTC-ACTCCGTGGGCGTGGTAT372Mon810Mon-PlATACCACGCCCACGGAGT-GAAGACAGCCAAGACCTMon-P2AAAGTCAAAGTAGATACrT-TTACATCTAAGAAGGATTCTCA365HmgHmg-PlrGAGAA'I'CC'n'CrrAGAI'GrAA-ACTATCTACTTTGACTTTHmg-P2GCTCTAGA GAAGCATCAGTTTCCCTACC.354
4. 一种如权利要求1所述的转基因大豆、玉米和棉花检测用标准质粒分子的构建方法，其特征在于，包括以下步骤第一轮反应以转基因大豆Btl76品系、转基因玉米MonS 10品系基因组DNA为模板，以权利要求3中对应引物进行PCR扩增；反应体系为总体积为50μ 1，其中10倍Taq缓冲液 5 μ 1，dNTPs(10mM)4y 1，上下游引物(10 μ M)各 2μ 1，模板(IOOng/μ 1) 1 μ 1，用 ddH20 补足至50 μ 1。反应程序为95 "C 5min ；30 个循环(94 "C 30s, 58. 2-59. 6 "C 30s, 72 "C 60s)； 72°C IOmin ；4°C保存；产物标记为 PHmg、PBt、PM。n ； 第二轮反应，分两步进行扩增第一步取第一轮反应产物各70ng，10倍Taq缓冲液5μ l，dNTPs(10mM)4y 1，用ddH20 补足至50 μ 1 ；使PHmg、PBt、PMon相连接；反应程序11 个循环(94°C 15s，60°C 20s, 72°C 10min)，4°C保存；第二步向第一步反应液中分别加入引物Bt-Pl和Hmg-P2各1μ 1 ； 反应程序94°C 3min,28 个循环(94°C 15s，60°C lmin，72°C 2min)，4°C保存；将融合 PCR产物割胶纯化后标记为PBH3。将融合纯化产物Pbh3连接于pMD 19-T Simple载体，转入大肠杆菌T0P10筛选得到中间质粒分子PTBH3。将质粒分子pTLE8和pTBH3分别用限制性内切酶EcoR I和)(ba I进行双酶切，分别回收酶切目的片段BH3和pTLE7，用T4DNA连接酶连接获得质粒分子pTLHIO。
全文摘要
本发明公开了一种转基因作物检测中必要的标准质粒分子及其构建方法。将八基因质粒分子pTLE8(专利申请号201010286884.3)进行改造，增加转基因玉米Bt176品系和Mon810品系的3′端转化事件特异性序列和玉米内参基因Hmg特异性序列的融合片段，改造成十基因的质粒分子pTLH10(Lec1，35S，NOS，PAT，Sad1，Cry1Ab/c，Bt176，Mon810和Hmg)。本发明中构建的标准质粒分子完全可以代替阳性标准品，适用于对转基因大豆GTS40-3-2品系、转基因玉米Bt176和Mon810品系及转Bt基因棉花的筛选、基因特异性和品系特异性的定性和定量PCR分析和检测。
文档编号C12N15/63GK102559854SQ201010595049
公开日2012年7月11日 申请日期2010年12月20日 优先权日2010年12月20日
发明者杨雅麟, 滕达, 王建华, 王秀敏 申请人:中国农业科学院饲料研究所