专利名称：Dna保存溶剂及其保存方法
技术领域：
本发明涉及一种DNA(deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸)的保存，特别是涉及一种DNA保存溶剂及其保存方法。
背景技术：
DNA是染色体的重要组成充分，是真核生物的遗传基本物质，含有物种个体的遗传信息，可用于构建基因组文库、分离所需的基因和检测相关的分子标记等。由于DNA所含的遗传信息量大，并且容易获取，具有极其稳定的化学性质，是目前种质资源和遗传资源收集和保存的主要内容之一。DNA分子的序列结构具有三个重要特性(1)不同个体序列不一样；(2)终生不变；同一人体各不同部位细胞中的DNA序列相同。因此DNA分子本身具备档案的特性，即具有长期稳定性、信息属性、个体特异性和可以备查的属性。实际上，在疾病基因组学、药物基因组学、群体遗传学和进化等研究领域，DNA是最可靠的证据和研究过程的基本材料，被广泛应用。同时生命科学研究者日益认识到保存DNA 对于今后系统生物医学的发展的重要性，各国纷纷开始保存DNA。世界上最早开始实施大规模DNA保存的是冰岛的Decode公司，全部DNA样本极其相关资料来自于将近1/3的冰岛成年人和90%以上的冰岛老年人。利用其建立的生物样本库，Decode找到了心肌梗塞等20 多种疾病的致病基因。随后英国、美国、以色列等国家研究单位建立了类似的遗传资源样本库，并且以色列对外销售这些资料齐全的人DNA样本。为了维持DNA结构的完整性，避免DNA大规模断裂和降解，DNA最佳保存方法是干粉_80°C或者液氮低温保存，但要制成干粉则需要大量的DNA，取材困难，在实际DNA样本资源收集中不具有操作性。而用无水乙醇保存DNA，虽然可以事先分装保存，但也存在反复冻融问题。而固相DNA保存技术是最近提出的新概念，适用于永久保存，并且这种方法的保存基质是否影响DNA后续实验、保存具体效果，目前无这方面的任何数据，尚有待时间考验。 并且对于保存期间需要多次使用的样本，需要重新提取DNA，操作复杂，并且容易导致DNA 断裂，将导致一些对DNA质量要求高的检测实验无法进行。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种DNA保存溶剂及其保存方法。利用该DNA保存溶剂，可以很简单地、长期保存DNA，并且DNA提取方便、避免DNA的反复冻融、成本低廉， 为今后基因组学研究、身份鉴别、基因诊断、基因治疗、器官移植等提供最原始的DNA记录。为解决上述技术问题，本发明的DNA保存溶剂，其组分包括甘油、TE缓冲液 (Tris-EDTA, EDTA 乙二胺四乙酸)、1_羧基-N，N，N-三甲基乙内酯，其中，甘油的终体积为 25% 80% ；TE缓冲液的终浓度为IXTE 5XTE，pH值为6 8，优选1XTE，pH值7. 6 ； 1-羧基-N，N，N-三甲基乙内酯的终浓度为1 6mol/L，优选3mol/L。上述甘油和1-羧基-N，N，N-三甲基乙内酯作用主要是维持液态环境。
另外，本发明的DNA保存方法，包括步骤(1)提取 DNA;其中，该DNA可从生物的任何细胞、按照常规的提取方法进行提取及纯化；(2)将DNA溶于如上所述的DNA保存溶剂中进行保存。其中，DNA保存的最终浓度可以为1 lOyg/L，如eyg/L左右，优选2 3yg/ L。如DNA保存浓度很低，如直接大用量实验，保存溶剂中高浓度的甘油有可能影响后续的实验，而高保存浓度的DNA在实际应用中需要进一步稀释后才能实验，不影响后续实验。所述保存温度可以为-20°C _196°C。与传统的DNA保存技术相比较，本发明具有如下优点(1)制作简单、成本低廉，只需要低温冰冻保存即可；(2)由于含有高浓度的甘油，使得DNA—直处于液态环境中，避免机械切割力损害，从而能有效地防止DNA降解，因此，DNA保存效果好、保存期长。(3)由于DNA保存于液态环境中，从冰箱或液氮中拿出来后，不需溶解，就可直接取样或分装，从而避免了反复冻融。因此，本发明能长期保存DNAjB 20年以上。
具体实施例方式以下实施例中的甘油、TE中的组分(^^8碱、!1(^014)、1-羧基-队队^三甲基乙内酯都是市售产品。
附图是实施例3的基因组DNA电泳图，其中，孔1为DNA分子标记，孔2为实施例 3中按照实施例1保存的DNA，孔3为实施例3中按照实施例2保存的DNA。实施例1一、样本DNA的提取采用FlexiGene DNA Kit(QIAGEN, Cat. No. 51206)试剂盒抽提肺癌患者外周血中的基因组DNA。具体步骤如下向300 μ 1血液样本中加入750 μ 1 Buffer TOl，上下颠倒5次使其混勻。接着在 12，OOOrpm转速下离心Imin0离心后倒掉上层清液，再加入150 μ 1 Buffer FG2及1· 5μ 1 蛋白酶溶液，立即振荡，直至沉淀完全溶解。接下来离心3 k，然后65°C水浴5min。当溶液从红色变为橄榄绿色后，加入150μ 1 100%异丙醇，上下充分颠倒离心管，使其混合，直至DNA析出，呈肉眼可见的线状或块状。然后在12，OOOrpm转速下离心;3min。离心后倒掉上层清液，再加入150 μ 1 70%乙醇，并振荡k。接着重新在12，OOOrpm转速下离心;3min， 离心后倒掉上层清液，自然风干沉淀，直至所有的液体都蒸发掉。二、保存向上述含有DNA的离心管中加入500 μ 1的DNA冰冻保存溶剂(即保存溶剂温度为0°C )后，37°C过夜，保证DNA充分溶解，然后于-80°c冰箱保存。其中，DNA冰冻保存溶剂的组成为终体积为35 %的甘油、终浓度为 IXTE(pH7. 6)、终浓度为3mol/L的1_羧基—N，N, N-三甲基乙内酯。
实施例2采用实施例1中的DNA抽提方法，抽取实施例1的肺癌患者外周血300 μ 1进行 DNA抽提，然后向含有该DNA的离心管中加入500 μ 1的1ΧΤΕ(ρΗ7. 6)，37°C过夜，保证充分溶解后，于-80°C冰箱保存。实施例3实施例1和实施例2中的DNA保存1个月后，每个工作日的10点和16点将实施例1和实施例2保存的DNA取出，置于37°C温箱15分钟，使实施例1和实施例2中的DNA 充分溶解后，然后-80度保存，连续反复冻融6月，进行加速实验。各取反复冻融3个月后，取按照实施例1和实施例2保存的DNA 6μ 1，用0. 8% (0. 8g/100ml)琼脂糖进行电泳鉴定，电泳结果如说明书附图所示。从电泳图中看出，实施例 1保存的DNA经过连续3个月反复冻融后，孔2电泳结果显示基因组DNA未降解；而实施例 2保存的DNA经过连续3个月反复冻融后，孔3电泳结果显示基因组DNA —片弥散，降解明显。实施例4采用实施例1中的DNA抽提方法，将得到的小鼠肝脏DNA中加入DNA冰冻保存溶剂，使DNA的最终浓度为2 μ g/L，37°C过夜，保证DNA充分溶解，然后于_20°C冰箱保存。其中，DNA冰冻保存溶剂的组成为终体积为25%的甘油、终浓度为1ΧΤΕ(ρΗ6)、 终浓度为6mol/L的1-羧基-N，N，N-三甲基乙内酯。本实施例中所保存的DNA分子结构无破坏，能满足下游实验(如PCR、基因芯片等)需要。实施例5采用实施例1中的DNA抽提方法，将得到的培养皿细胞DNA中加入DNA冰冻保存溶齐U，使DNA的最终浓度为3 μ g/L，37°C过夜，保证DNA充分溶解，然后于_196°C保存。其中，DNA冰冻保存溶剂的组成为终体积为80%的甘油、终浓度为5XTE(pH8)、 终浓度为lmol/L的1-羧基-N，N, N-三甲基乙内酯。本实施例中所保存的DNA分子结构无破坏，能满足下游实验(如PCR、基因芯片等)需要。实施例6采用实施例1中的DNA抽提方法，将得到的人肝脏DNA中加入DNA冰冻保存溶剂， 使DNA的最终浓度为10 μ g/L, 37°C过夜，保证DNA充分溶解，然后于_120°C保存。其中，DNA冰冻保存溶剂的组成为终体积为60 %的甘油、终浓度为 2XTE(pH7. 5)、终浓度为5mol/L的1_羧基-N，N, N-三甲基乙内酯。本实施例中所保存的DNA分子结构无破坏，完全能满足下游实验(如PCR、基因芯片等)需要。
权利要求
1.一种DNA保存溶剂，其特征在于该DNA保存溶剂的组分包括甘油、TE缓冲液、 1-羧基-N，N，N-三甲基乙内酯，其中，甘油的终体积为25% 80%，TE缓冲液的终浓度为 IXTE 5XTE，1-羧基-N，N，N-三甲基乙内酯的终浓度为1 6mol/L。
2.如权利要求1所述的DNA保存溶剂，其特征在于所述TE缓冲液的终浓度为IXTE， PH值为6 8。
3.如权利要求2所述的DNA保存溶剂，其特征在于所述TE缓冲液的pH值为7.6。
4.如权利要求1所述的DNA保存溶剂，其特征在于所述1-羧基-N，N，N-三甲基乙内酯的终浓度为3mol/L。
5.如权利要求1-4任意一项所述的DNA保存方法，包括步骤(1)提取DNA ；(2)将DNA溶于如权利要求1所述的DNA保存溶剂中进行保存。
6.如权利要求5所述的DNA保存方法，其特征在于所述保存温度为_20°C -196°C。
7.如权利要求5所述的DNA保存方法，其特征在于所述DNA保存的最终浓度为1 10μ g/L。
8.如权利要求7所述的DNA保存方法，其特征在于所述DNA保存的最终浓度为2 3 μ g/L ο
全文摘要
本发明公开了一种DNA保存溶剂及其保存方法，该DNA保存溶剂的组分包括甘油、TE缓冲液、1-羧基-N，N，N-三甲基乙内酯，其中，甘油的终体积为25％～80％，TE缓冲液的终浓度为1×TE～5×TE，1-羧基-N，N，N-三甲基乙内酯的终浓度为1～6mol/L。该DNA保存方法，包括步骤(1)提取DNA；(2)将DNA溶于DNA保存溶剂中进行保存。本发明制作简单、成本低廉，而且保存效果好、保存期长，并避免反复冻融。为今后基因组学研究、身份鉴别、基因诊断、基因治疗、器官移植等提供最原始的DNA记录。
文档编号C12N15/10GK102559654SQ20101059505
公开日2012年7月11日 申请日期2010年12月17日 优先权日2010年12月17日
发明者连臻 申请人:上海元基融生物科技有限公司