专利名称：一种测定反刍动物饲料蛋白生物活性物质的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种测定生物活性物质的制备方法，具体的说是一种测定反刍动物饲料蛋白生物活性物质的制备方法。
背景技术：
蛋白质作为动物日粮的主要营养指标，是动物营养研究的主要内容。在世界蛋白质饲料资源紧缺加剧，和人们对畜产品质量以及环境保护要求不断提高的今天，对饲料的蛋白质营养价值进行准确评定就有着十分重要的意义。长期以来，对反刍动物蛋白质营养价值的评定常使用Mitchell (1951)提出来的粗蛋白体系或可消化蛋白质体系测定蛋白质的生物学价值。粗蛋白体系是以日粮中氮的含量为基础进行评定，仅限于化学分析上，并没有结合动物的消化生理特点说明动物对饲料的消化利用情况。该体系不能区分真蛋白(True Protein, NP)和非蛋白氮(Nonprotein Nitrogen, NPN)的营养价值，忽视了蛋白质被动物消化、吸收、利用的情况。可消化蛋白质体系是以动物对蛋白质的消化率为基础的，该体系把饲料的营养组成成分和动物的消化生理结合起来，对饲料蛋白质营养价值进行评定，比简单的以粗蛋白体系为指标来评定饲料蛋白质价值的粗蛋白体系有很大的进步，对单胃动物有其合理性。由于饲料在反刍动物的瘤胃中被降解，所以不能使用，无法将瘤胃非降解蛋白质和微生物蛋白质进行区分，不能对非蛋白氮(Nonprotein Nitrogen, NPN)的营养价值进行评价。据Titgemyer等(1989)估测，大多数饲料中的瘤胃非降解蛋白的消化率在80%—90%之间，瘤胃非降解蛋白是动物小肠蛋白的第二重要来源，大约占小肠中蛋白的30%—35%。因此根据瘤胃降解率得到的消化率，不同于反刍动物生理上的消化率。因此用可消化蛋白质体系来评价反刍动物饲料蛋白质价值，不能反映降解产物合成微生物蛋白质的效率及合成量，同时亦不能反映进入小肠内的非降解蛋白质和微生物蛋白质的量、氨基酸的量及其消化率。氨基酸越平衡，生物学价值就越高，就越能满足动物的需要，对配制单胃动物饲料时极为重要。但对于反刍动物，由于成年动物瘤胃中的微生物可合成各种必需氨基酸，因此对反刍动物的生物学价值要求就更高。尤其当非蛋白氮(Nonprotein Nitrogen，NPN)可代替反刍动物日粮中的一部分氮，不能以生物学价值作为评定方法。同时，由于尿素可通过唾液或直接扩散回到瘤胃形成氮的再循环，所以使反刍动物的蛋白质生物学价值计算更难实现。自二十世纪七十年代以来，很多国家用于反刍动物蛋白质评定大多采用瘤胃瘘管动物提供瘤胃液，或从反刍动物粪便液中提取生物活性屈指，其操作复杂，准确率低，污染严重，造成反刍动物易发生疾病。
发明内容
本发明目的主要针对上述问题，制备一种测定反刍动物饲料蛋白生物活性物质的制备方法，其制备方法快速、准确、简易、利用操作。
本发明为解决现有技术存在的不足，所采取的技术方案是一种测定反刍动物饲料蛋白生物活性物质的制备方法
步骤一瘤胃液中生物活性物质的分离早晨7点饲喂时，选择成年奶牛或羊3—5头， 将口腔瘤胃液抽取装置通过口腔插入瘤胃内，调节真空泵真空压力在15— 50Pa，抽取瘤胃液，用60目的滤网，过滤去除饲料残渣，后将含有生物活性物质的瘤胃液转至容器中，通入 CO2保证期内呈现厌氧环境；
步骤二 瘤胃液中生物活性物质冻干粉的制备
1、按照1:1的比例将经过厌氧处理的含有生物活性物质的瘤胃液中加入冷冻干燥保护剂，混勻制成悬液，后将悬浊液置于0 — 4°C条件下平衡20 - 30分钟；
2、将平衡后的悬液放在一30—一 35°C的条件下，放置30—90分钟，进行第一次预冷冻，得到冷冻瘤胃液I ；
3、将冷冻瘤胃液I置于一70—一 80°C条件下，时间为5 - 7小时，进行第二次预冷冻， 得到冷冻瘤胃液II ；
4、将冷冻瘤胃液II置于冷冻真空干燥机中，在温度为20- 30°C，操作压力为15 — 50Pa时，升华温度低于一 20°C，解吸干燥温度为30 — 35°C的条件下，干燥M — 36小时，制得生物活性物质，0 - 4°C贮存，6个月后，测得活菌数达107_9cfu/g。所述的冷冻干燥保护剂的组分为海藻糖2%、氯化钠0. 6%、蔗糖3%、0. 03%的吐温一 80，余量为水的水溶液。所述的cfu/g为cfu是菌落形成单位，cfu/g指在单位数量的奶粉里含有的活性大肠杆菌数量，是一个样品点的数据，一般要多测几个求平均值，才能反映整体水平。所述的吐温一 80即聚山梨酯-80为非离子型亲水性表面活性剂，微有特臭、味微苦、略涩，有温热感。在水、乙醇、甲醇或醋酸乙酯中易溶，在矿物油中极微溶解。用作注射剂的增溶剂及其他剂型的乳化剂和分散剂。有益效果
在本发明中所得到的生物活性物质不仅含有瘤胃中大部分的细菌，还包含了部分的原虫，及瘤胃微生物的代谢产物，用于测定反刍动物饲料可利用蛋白质的准确性远远大于用牛、羊粪液，污染少，不易发生疾病，操作简单便宜。本发明厌氧过滤，冷冻真空干燥，最大限度地保存了微生物的生物活性和微生物代谢产物的生物活性。本发明中的生物活性物质在O — 4°C的条件下贮存，6个月后测得活菌数达107cfu/g，其生物活性大于其他用于六位修复的生物活性物质。
具体实施例方式实施例一
步骤一瘤胃液中生物活性物质的分离早晨7点饲喂时，选择成年奶牛3头，将口腔瘤胃液抽取装置通过口腔插入瘤胃内，调节真空泵真空压力在15Pa，抽取瘤胃液，用60目的滤网，过滤去除饲料残渣，后将含有生物活性物质的瘤胃液转至容器中，通入CO2保证期内呈现厌氧环境；
步骤二 瘤胃液中生物活性物质冻干粉的制备
1、按照1 :1的比例将经过厌氧处理的含有生物活性物质的瘤胃液中加入冷冻干燥保护剂，混勻制成悬液，后将悬浊液置于0°c条件下平衡20分钟；
2、将平衡后的悬液放在一30°C的条件下，放置30分钟，进行第一次预冷冻，得到冷冻瘤胃液I ；
3、将冷冻瘤胃液I置于一70°C条件下，时间为5小时，进行第二次预冷冻，得到冷冻瘤胃液II ；
4、将冷冻瘤胃液II置于冷冻真空干燥机中，在温度为20°C，操作压力为15 时，升华温度低于一 20°C，解吸干燥温度为30°C的条件下，干燥M小时，制得生物活性物质，0°C贮存，6个月后，测得活菌数达109cfu/g。实施例二
步骤一瘤胃液中生物活性物质的分离早晨7点饲喂时，选择成年奶牛4头，将口腔瘤胃液抽取装置通过口腔插入瘤胃内，调节真空泵真空压力在30Pa，抽取瘤胃液，用60目的滤网，过滤去除饲料残渣，后将含有生物活性物质的瘤胃液转至容器中，通入CO2保证期内呈现厌氧环境；
步骤二 瘤胃液中生物活性物质冻干粉的制备
1、按照1:1的比例将经过厌氧处理的含有生物活性物质的瘤胃液中加入冷冻干燥保护剂，混勻制成悬液，后将悬浊液置于2°C条件下平衡25分钟；
2、将平衡后的悬液放在一33°C的条件下，放置60分钟，进行第一次预冷冻，得到冷冻瘤胃液I ；
3、将冷冻瘤胃液I置于一75°C条件下，时间为6小时，进行第二次预冷冻，得到冷冻瘤胃液II ；
4、将冷冻瘤胃液II置于冷冻真空干燥机中，在温度为25V，操作压力为30 时，升华温度低于一 20°C，解吸干燥温度为33°C的条件下，干燥30小时，制得生物活性物质，2°C贮存，6个月后，测得活菌数达108cfu/g。实施例三
步骤一瘤胃液中生物活性物质的分离早晨7点饲喂时，选择成年奶牛5头，将口腔瘤胃液抽取装置通过口腔插入瘤胃内，调节真空泵真空压力在50Pa，抽取瘤胃液，用60目的滤网，过滤去除饲料残渣，后将含有生物活性物质的瘤胃液转至容器中，通入CO2保证期内呈现厌氧环境；
步骤二 瘤胃液中生物活性物质冻干粉的制备
1、按照1:1的比例将经过厌氧处理的含有生物活性物质的瘤胃液中加入冷冻干燥保护剂，混勻制成悬液，后将悬浊液置于4°C条件下平衡30分钟；
2、将平衡后的悬液放在一35°C的条件下，放置90分钟，进行第一次预冷冻，得到冷冻瘤胃液I ；
3、将冷冻瘤胃液I置于一80°C条件下，时间为7小时，进行第二次预冷冻，得到冷冻瘤胃液II ；
4、将冷冻瘤胃液II置于冷冻真空干燥机中，在温度为30°C，操作压力为50 时，升华温度低于一 20°C，解吸干燥温度为35°C的条件下，干燥36小时，制得生物活性物质，4°C贮存，6个月后，测得活菌数达107cfu/g。实施例四步骤一瘤胃液中生物活性物质的分离早晨7点饲喂时，选择成年羊3头，将口腔瘤胃液抽取装置通过口腔插入瘤胃内，调节真空泵真空压力在15Pa，抽取瘤胃液，用60目的滤网，过滤去除饲料残渣，后将含有生物活性物质的瘤胃液转至容器中，通入CO2保证期内呈现厌氧环境；
步骤二 瘤胃液中生物活性物质冻干粉的制备
1、按照1:1的比例将经过厌氧处理的含有生物活性物质的瘤胃液中加入冷冻干燥保护剂，混勻制成悬液，后将悬浊液置于0°C条件下平衡20分钟；
2、将平衡后的悬液放在一30°C的条件下，放置30分钟，进行第一次预冷冻，得到冷冻瘤胃液I ；
3、将冷冻瘤胃液I置于一70°C条件下，时间为5小时，进行第二次预冷冻，得到冷冻瘤胃液II ；
4、将冷冻瘤胃液II置于冷冻真空干燥机中，在温度为20°C，操作压力为15 时，升华温度低于一 20°C，解吸干燥温度为30°C的条件下，干燥对小时，制得生物活性物质，0°C贮存，6个月后，测得活菌数达109cfu/g。实施例五
步骤一瘤胃液中生物活性物质的分离早晨7点饲喂时，选择成年羊4头，将口腔瘤胃液抽取装置通过口腔插入瘤胃内，调节真空泵真空压力在30Pa，抽取瘤胃液，用60目的滤网，过滤去除饲料残渣，后将含有生物活性物质的瘤胃液转至容器中，通入CO2保证期内呈现厌氧环境；
步骤二 瘤胃液中生物活性物质冻干粉的制备
1、按照1:1的比例将经过厌氧处理的含有生物活性物质的瘤胃液中加入冷冻干燥保护剂，混勻制成悬液，后将悬浊液置于2°C条件下平衡25分钟；
2、将平衡后的悬液放在一33°C的条件下，放置60分钟，进行第一次预冷冻，得到冷冻瘤胃液I ；
3、将冷冻瘤胃液I置于一75°C条件下，时间为6小时，进行第二次预冷冻，得到冷冻瘤胃液II ；
4、将冷冻瘤胃液II置于冷冻真空干燥机中，在温度为25V，操作压力为30 时，升华温度低于一 20°C，解吸干燥温度为33°C的条件下，干燥30小时，制得生物活性物质，2°C贮存，6个月后，测得活菌数达108cfu/g。实施例六
步骤一瘤胃液中生物活性物质的分离早晨7点饲喂时，选择成年羊5头，将口腔瘤胃液抽取装置通过口腔插入瘤胃内，调节真空泵真空压力在50Pa，抽取瘤胃液，用60目的滤网，过滤去除饲料残渣，后将含有生物活性物质的瘤胃液转至容器中，通入CO2保证期内呈现厌氧环境；
步骤二 瘤胃液中生物活性物质冻干粉的制备
1、按照1:1的比例将经过厌氧处理的含有生物活性物质的瘤胃液中加入冷冻干燥保护剂，混勻制成悬液，后将悬浊液置于4°C条件下平衡30分钟；
2、将平衡后的悬液放在一35°C的条件下，放置90分钟，进行第一次预冷冻，得到冷冻瘤胃液I ；
3、将冷冻瘤胃液I置于一80°C条件下，时间为7小时，进行第二次预冷冻，得到冷冻瘤胃液II ；
4、将冷冻瘤胃液II置于冷冻真空干燥机中，在温度为30°C，操作压力为50 时，升华温度低于一 20°C，解吸干燥温度为35°C的条件下，干燥36小时，制得生物活性物质，4°C贮存，6个月后，测得活菌数达107cfu/g。
权利要求
1.一种测定反刍动物饲料蛋白生物活性物质的制备方法，其特征在于步骤一瘤胃液中生物活性物质的分离早晨7点饲喂时，选择成年奶牛或羊3—5头， 将口腔瘤胃液抽取装置通过口腔插入瘤胃内，调节真空压力泵，在压力为15-50Pa,抽取瘤胃液，用60目的滤网，过滤去除饲料残渣，后将含有生物活性物质的瘤胃液转至容器中，通入(X)2使容器内的呈厌氧环境，备用；步骤二 瘤胃液中生物活性物质冻干粉的制备1)在容器内按照1:1比例加入经过厌氧处理含有生物活性物质的瘤胃液和冷冻干燥保护剂，混勻制成悬液，后将悬浊液置于0 — 4°C条件下平衡20 - 30分钟；2)将平衡后的悬液放在一30—一 35°C的条件下，放置30— 90分钟，进行第一次预冷冻，得到冷冻瘤胃液I ；3)将冷冻瘤胃液I置于一70—一 80°C条件下，时间为5 — 7小时，进行第二次预冷冻， 得到冷冻瘤胃液II ；4)将冷冻瘤胃液II置于冷冻真空干燥机中，在温度为20- 30°C，操作压力为15 — 50Pa,升华温度低于一 20°C，解吸干燥温度为30 — 35°C的条件下，干燥M — 36小时，制得生物活性物质，0 - 4°C贮存。
2.根据权利要求1所述的一种测定反刍动物饲料蛋白生物活性物质的制备方法，其特征在于所述的冷冻干燥保护剂的组分为海藻糖、氯化钠、蔗糖、吐温一 80，按重量百分比为海藻糖2%、氯化钠0. 6%、蔗糖3%、0. 03%的吐温一 80，余量为水。
全文摘要
一种测定反刍动物饲料蛋白生物活性物质的制备方法，提取牛或羊的瘤胃液，对其进行过滤，除去其中的饲料残渣，后将过滤得到的液体和冷冻干燥保护剂按1:1的比例混合，置入真空冷冻干燥机中冷冻干燥，制取生物活性物质粉剂。本发明解决了现在测定反刍动物饲料可利用蛋白时必需由瘤胃瘘管动物提供瘤胃液，或从反刍动物粪便液中进行测定的问题，使能够简便、快速、准确地评定反刍动物饲料蛋白质营养价值，准确为动物提供营养物质，同时减少疾病的发生。
文档编号C12Q1/02GK102154435SQ201010605000
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月25日 优先权日2010年12月25日
发明者张勇法, 李元晓, 王占彬, 王玉琴, 达赖 申请人:河南科技大学