专利名称：一种促进植物生长和重金属污染土壤修复的内生菌及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于重金属土壤污染修复领域，具体涉及一种能促进能源作物生长的内生菌，及其侵染植物，并提高植物修复重金属土壤污染效率的应用方法。
背景技术：
随着现代化工业的发展，重金属污染对人类健康和生态系统造成了严重的威胁， 已逐渐成为全球性环境问题之一。其中，锰能在人体内积累并引起锰中毒，例如帕金森症、 生殖系统和免疫系统病变。而另一种重金属镉，具有致癌、致畸、致突变作用，在人体内积累可引起骨、消化道、血管病变。众所周知，应用植物修复技术去除土壤中的重金属，与传统的物理化学修复技术相比具有很多优点，例如成本低、安全有效、环境友好型等特点。尤其是应用超累积植物进行植物修复，这种植物不但在生长过程中不会受重金属的毒害，还能在其体内累积大量重金属。然而，超累积植物在重金属污染地区生长时，由于生物量低以及土壤中重金属的生物可利用率低，限制了超累积植物的植物修复效率。因此，许多研究者致力于研究提高超累积植物生物量的方法。其中，植物联合植物促生长内生菌(PGPE)技术有效的推动了超累积植物的植物修复应用的发展。众所周知，PGPE能够协助其宿主植物抵抗重金属在体内累积引起毒害效应，同时能促进宿主植物的生长。这是因为PGPE具有几个植物促生长机制(1)通过产生吲哚乙酸(IAA)等植物激素促进植物生长；(2)通过产生铁载体协助植物从土壤中获取生长所需的铁离子，从而使宿主植物获得最优的生长条件；(3)通过ACC脱氨酶活性降低压力乙烯前体ACC的浓度，从而降低压力乙烯对植物生长的抑制作用。然而从另一个角度来讲，值得引起注意的是利用PGPE的这些促生长机制来促进能源作物在重金属污染的边际土壤上的生长，从而提高能源作物的生物量和从空气中捕获的CO2作为生物能源的原料是十分有意义的举措。所述边际土壤是指因干旱、盐碱度高、受重金属和有机物污染等不适合一般农作物生长的土地。因此这一举措可以避免能源作物和粮食作物对有限耕地等农业资源的竞争。随着生物能源使用的日益增加，能源作物占用粮食作物耕地的问题已经成为了亟待解决的社会经济问题之一。根据最新的经济分析报告， 由于甜高粱(Sorghum bicolor L.)具有光合作用效率高、生产投入低、生物量高、耐干旱、 耐盐等特点，被公认为目前世界上最具有潜力的能源作物之一。除此之外，甜高粱也可以萃取土壤中的重金属成分，具有用于植物修复的潜力。然而据我们所知，目前还没有专利和文献报道过超累积植物体内分离所得的耐重金属促生长内生菌，应用于促进能源作物在重金属污染的边际土地上的生长和植物修复。
发明内容
本发明提供了一种能促进能源作物生长的内生菌，及其侵染植物，并提高植物修复重金属土壤污染效率的应用方法。本发明操作简单、安全、经济，对土壤环境不引入新污染，能有效避免能源作物与粮食作物对有限耕地的竞争，同时能有效地修复重金属污染的土地。为解决上述问题，本发明提供的技术方案为一种促进植物生长和重金属污染土壤修复的内生菌，其特征在于，所述的内生菌为芽孢杆菌Bacillus sp.SLSIS，已于2010年12月20日，在中国湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，进行了保藏，保藏编号为CCTCCNO :M 2010359。所述的内生菌应用于促进植物生长和重金属污染土壤修复；具体是将所述的内生菌SLS18浸染甜高粱种子，然后甜高粱播种在重金属(如Mn/Cd)污染土地上生长，进行土壤修复。内生菌SLS18的菌液浓度为IO9Cfu mL—1 ；菌液中浸泡4h。所述的甜高粱种子在浸菌前进行表面消毒的过程为将甜高粱种子浸泡于70% 乙醇溶液lmin，再浸泡于次氯酸钠溶液lOmin，随后用消毒后的去离子水漂洗至少5次后，晾干待种子浸菌。甜高粱种子浸菌过程所用的内生菌SLS18菌体为处于对数生长期，内生菌培养过程为将100 μ L保藏的SLS18菌种接种至25mL消过毒的LB培养基，培养液置于30°C摇床中震荡培养24h后，制备浓度为IO9Cfu mL—1的菌液。制备浓度为IO9Cfu mL—1的菌液的制备过程为取5mL培养24h后的内生菌菌液在13000r/min，IOmin的条件下离心，用去离子水清洗后再离心，然后将收集的菌体悬浮于 0. 03M MgSO4溶液中，并稀释至所测OD6tltl为1，即得对应浓度为109cfu mL—1的菌液。 将已浸染内生菌SLS18的甜高粱种子播种于重金属Mn/Cd污染的土壤中，使SLS18 内生菌生存于甜高粱体内伴随甜高粱生长的每个阶段，从而达到促进甜高粱在重金属污染边际土地上的生长以及土壤修复的目的。上述促生长内生菌SLS18为超累积植物商陆体内分离得到的耐重金属菌，并能成功浸染甜高粱体内。本发明菌株的筛选分离过程及方法参照本科研组的一项专利《一种分离获得植物内生菌的方法》(申请号200810107514. 1)。其在LB固体培养基上的菌落特征为大小 3至6mm ；圆形、边缘整齐；乳黄色；表面光滑、隆起、不透明。其部分生理生化性质鉴定为 革兰氏阴性菌；产吲哚乙酸及铁载体蛋白；其重金属抗性具体以MIC(最小抑制浓度)表现为Mn 2000mg/L, Cd 40mg/L, Pb 500mg/L, Cu 200mg/L, Zn lOOmg/L (LB 培养基)。通过对 16S rDNA进行测序分析，内生菌SLS18鉴定为芽孢杆菌属(bacillus sp.)本发明的优势表现为明操作简单安全、经济，在对土壤环境不引入新污染的前提下，能有效促进能源作物在受重金属污染的边际土地上生长，同时修复重金属污染的土地。
图1为本发明的操作流程图；图2为内生菌SLS18菌对甜高粱、商陆、龙葵的根部干重(g)的影响，土壤重金属浓度分别为 Omg kg-1, Mn 2000mg kg-1, Cd 50mg kg-1 ；图3为内生菌SLS18菌对甜高粱、商陆、龙葵的地上部分干重(g)的影响，土壤重金属浓度分别为 Omg kg、Mn 2000mg kg"1, Cd 50mg kg"1 ；图4为内生菌SLS18对甜高粱、商陆、龙葵累积Mn能力(口8株_1)的影响，土壤重金属浓度分别为Mn 2000mg kg—1 ；
图5为内生菌SLS18对甜高粱、商陆、龙葵累积Cd能力(口8株_1)的影响，土壤重金属浓度分别为Cd 50mg kg—1。
具体实施例方式以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。将内生菌SLS18同时浸染甜高粱，以及商陆(P.acinosa R.)和龙葵(S. nigrum L.)种子后，与没有浸染内生菌的三种植物种子一起分别播种生长，进行试验效果对比，其中商陆和龙葵为新发现的两种重金属超累积植物；试验操作过程按图1进行。所有的试验进行3次平行试验，内生菌SLS18对甜高粱生物量有明显的提高，以商陆和龙葵为参照的统计结果见图2，图3，图4。内生菌SLS18对甜高粱、商陆、龙葵的促生长率见表1，土壤重金属浓度分别为Omg kg-1, Mn 2000mg kg-1, Cd 50mg kg-1表 权利要求
1.一种促进植物生长和重金属污染土壤修复的内生菌，其特征在于，所述的内生菌为芽孢杆菌 Bacillus sp. SLS18，保藏编号为 CCTCC NO :2010359。
2.权利要求1所述的内生菌应用于促进植物生长和重金属污染土壤修复。
3.根据权利要求2所述的内生菌的应用方法，其特征在于，将所述的内生菌SLS18浸染甜高粱种子，然后甜高粱播种在重金属污染土地上生长，进行土壤修复。
4.根据权利要求2或3所述的内生菌的应用方法，其特征在于，将浓度为IO9CfumL-1 的内生菌SLS18的菌液对甜高粱种子进行种子浸菌。
5.根据权利要求4所述的内生菌的应用方法，其特征在于，所述的甜高粱种子置于菌液中浸泡4h。
6.根据权利要求4所述的内生菌的应用方法，其特征在于，所述的甜高粱种子在浸菌前进行表面消毒的过程为将甜高粱种子浸泡于70%乙醇溶液lmin，再浸泡于次氯酸钠溶液lOmin，随后用消毒后的去离子水漂洗至少5次后，晾干待种子浸菌。
7.根据权利要求4所述的内生菌的应用方法，其特征在于，甜高粱种子浸菌过程所用的内生菌SLS18菌体为处于对数生长期，内生菌培养过程为将100 μ L保藏的SLS18菌种接种至25mL消过毒的LB培养基，培养液置于30°C摇床中震荡培养24h后，制备浓度为 IO9Cfu mr1 的菌液。
8.根据权利要求7所述的内生菌的应用方法，其特征在于，制备浓度为109cfumL—1的菌液的制备过程为取5mL培养24h后的内生菌菌液在13000r/min，IOmin的条件下离心， 用去离子水清洗后再离心，然后将收集的菌体悬浮于0. 03M MgS04溶液中，并稀释至所测 OD600为1，即得对应浓度为109cfu mL—1的菌液。
全文摘要
本发明提供一种促进植物生长和重金属污染土壤修复的内生菌及应用。利用内生菌SLS18菌液通过种子浸菌的方式浸染甜高粱，使内生菌SLS18定殖于甜高粱(Sorghum bicolor L.)体内伴随甜高粱生长的每个阶段，从而促进甜高粱在重金属污染边际土地上的生长以及土壤修复。内生菌SLS18分离自超累积植物商陆茎部并经筛选所得，是一种能成功定殖于甜高粱体内，并对甜高粱有明显促生长作用和具有重金属抗性的内生菌。本发明操作简单、安全、经济，对土壤环境不引入新污染，不仅能有效利用重金属污染的边际土地资源，从而避免能源作物与粮食作物对有限耕地的竞争，还能有效地修复重金属污染的土地。
文档编号C12N1/20GK102161976SQ201010609930
公开日2011年8月24日 申请日期2010年12月28日 优先权日2010年12月28日
发明者刘承斌, 徐涛英, 罗胜联, 肖潇, 陈亮, 陈觉梁, 饶婵 申请人:湖南大学