转化右旋磷霉素为左旋磷霉素生物催化菌株的筛选方法

专利名称：转化右旋磷霉素为左旋磷霉素生物催化菌株的筛选方法
技术领域：
本发明涉及生物医药和生物技术领域，具体为一种催化右旋磷霉素为左旋磷霉素菌株的高灵敏筛选方法。
背景技术：
左旋磷霉素[(-)_顺-(1R，2S)_1，2-环氧丙基磷酸，这里简写为F0M]是一种广谱抗生素。它具有独特的化学结构与抗菌机制，与其它抗生素之间不仅没有交叉耐药性，而且多呈协同作用。同时，因为磷霉素还具有理化特性稳定、安全低毒、无抗原性等优点，现已广泛用于临床治疗，被国际医学界和药学界称为二十一世纪的新抗生素。目前，左旋磷霉素生产工艺采用的是化学合成法，该工艺收率较低(不到20% )， 主要原因是工艺中顺丙稀磷酸的环氧化步骤是对称性的化学催化过程，所获得的产物为磷霉素消旋体，即左旋磷霉素和右旋磷霉素各占一半。其中，左旋磷霉素有疗效，从消旋体中被拆分出来后，进一步精制成为产品；而右旋磷霉素[(+)_顺_(1S，2R)-1，2-环氧丙基磷酸]则无疗效，被作为废弃物排放掉，这导致了严重的资源浪费和环境污染等问题。我们的前期研究结果显示，通过生物催化来实现右旋磷霉素转化为左旋磷霉素是可行的，微生物可以完成由右旋磷霉素到左旋磷霉素的生物催化过程(参见一种把右旋磷霉素转变为左旋磷霉素的方法，专利号ZL200710012579. 3)。但是，以前的转化右旋磷霉素为左旋磷霉素生物催化菌株的筛选方法主要是采用先振荡培养方法完成待筛选菌株对右旋磷霉素的和转化、再把催化发酵液离心，获取上清液作为待测定样品，然后以生物鉴定盘鉴定上清液是否产生抑菌圈，从而判断是否有抗生素存在(如一种磷霉素产生菌株的筛选方法，专利号ZL200610134746. 7)，最后由薄层层析的方法定性鉴定产物是左旋磷霉素。这种方法的缺点是当发酵液中抗生素含量较低时， 在生物鉴定盘上检测不到微量抗生素(如左旋磷霉素)的存在，从而导致筛选工作失败或遗漏大量具催化能力菌株。

发明内容
本发明的目的是提供一种转化右旋磷霉素为左旋磷霉素催化菌株的新筛选方法， 解决现有技术中存在的筛选工作失败或遗漏大量具催化能力菌株等问题，采用本发明可以大幅提高筛选的灵敏度和效率。本发明的技术方案是一种转化右旋磷霉素为左旋磷霉素生物催化菌株的筛选方法，包括如下步骤(1)以牛肉膏蛋白胨培养基制备左旋磷霉素敏感菌株(如大肠杆菌或金黄色葡萄球菌等)的菌悬液，使其细菌浓度为IO8-IOltl个细菌/ml，即为敏感菌悬液。(2)将可能把右旋磷霉素转化为左旋磷霉素的待筛选催化菌株接种于催化培养基中，经摇瓶培养20-120小时后，吸取发酵液，通过0. 45 μ m孔径滤膜过滤除去发酵液中的细菌，制成待筛选菌株的无菌发酵液。
(3)把上述的敏感菌悬液与待筛选菌株的无菌发酵液相混合，使混合液中敏感菌终浓度为IO2-IO4个细菌/ml，把混合液于37°C温度下培养8_48小时，取该培养液和培养初始时刻的混合液于600nm分光光度计中测定其吸光度。获得培养8-48小时培养液与培养初始时刻混合液的吸光度差值，筛选出吸光度增加幅度较低者，取其原始待筛选催化菌株， 进一步验证其转化右旋磷霉素为左旋磷霉素能力。上述的牛肉膏蛋白胨培养基组成为按重量百分数计，牛肉膏0.5%，蛋白胨1%， NaCl 0.2%，余量为水；pH 7. 5，121°C湿热灭菌 20min。上述的待筛选催化菌株的催化培养基组成为按重量百分数计，右旋磷霉素 0. 5-3. 0 %, (NH4)2SO4O. 5-1. 0 %, NaCl 0.2%, KCl 0. 1 %, MgSO4 · 7H20 0. 01-0. 02 %, FeSO4 · 7H20 0. 01-0. 03%，KH2PO4O. 05-0. 15%，余量为水。pH 7. 5，121°C湿热灭菌 20min。 恒温震荡培养，培养温度^_37°C、摇床转速150-250rpm，培养时间3-7天。在把高浓度敏感菌悬液与待筛选菌株的无菌发酵液相混合时，混合液中可视敏感菌生长状况添加适量牛肉膏蛋白胨培养基，添加重量比例为牛肉膏蛋白胨培养基混合液=1 100-1 5。本发明的有益效果是在转化右旋磷霉素为左旋磷霉素的催化菌株的筛选过程中，需要对众多的待筛选菌株开展催化活性检测，但不同微生物的生长、催化等条件会迥异，这使得在筛选过程中，尽管该菌株可能具有催化能力，当因为催化条件等不适宜，导致经培养后发酵液中产物 (左旋磷霉素)浓度较低或极低。以往采用的琼脂块法和滤纸片法等要求发酵液中左旋磷霉素浓度较高才能在固体培养基上形成敏感菌抑菌圈。这样的话，采用以往筛选技术会遗漏大量具催化能力的待筛选菌株。本发明采用把低浓度敏感菌加入到催化发酵液中的策略，利用发酵液中的产物 (左旋磷霉素)浓度相对较低但产物量较大、敏感菌浓度相对较低的特点，若产物中有左旋磷霉素存在，则在检测中会观察到敏感菌的生长受到抑制，从而大幅度提高筛选灵敏度。本发明在催化培养后直接检测的是培养液的吸光度值变化，测定简便易行，从而可大大提高筛选效率。
具体实施例方式本发明的具体操作步骤如下首先，以牛肉膏蛋白胨培养基制备左旋磷霉素敏感菌株(如大肠杆菌或金黄色葡萄球菌等)的菌悬液，使其细菌浓度为IO8-IOltl个细菌/ml。再将可能把右旋磷霉素转化为左旋磷霉素的待筛选催化菌株接种于催化培养基中，经摇瓶培养20-120小时后，吸取发酵液，通过0. 45 μ m孔径滤膜过滤除去发酵液中的细菌，制成待筛选菌株的无菌发酵液。按一定比例把上述的敏感菌株的菌悬液与待筛选菌株的无菌发酵液相混合，使混合液中敏感菌终浓度为IO2-IO4个细菌/ml，把混合液于37°C温度下培养8_48小时，取该培养液于600nm 分光光度计中测定其吸光度。获得培养8-48小时培养液与培养初始时刻混合液的吸光度差值，选取吸光度不增加或增加幅度较低者，取其原始待筛选催化菌株，进一步验证其转化右旋磷霉素为左旋磷霉素能力。上述的牛肉膏蛋白胨培养基组成为按重量百分数计，牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl 0.2%，余量为水；pH 7. 5，121°C湿热灭菌 20min。上述的待筛选催化菌株的催化培养基组成为按重量百分数计，右旋磷霉素
0.5-3. 0 %, (NH4)2SO4O. 5-1. 0 %, NaCl 0.2%, KCl 0. 1 %, MgSO4 · 7H20 0. 01-0. 02 %, FeSO4 · 7H20 0. 01-0. 03%，KH2PO4O. 05-0. 15%，余量为水。pH 7. 5，121°C湿热灭菌 20min。 恒温震荡培养，培养温度^_37°C、摇床转速150-250rpm，培养时间3-7天。在把高浓度敏感菌悬液与待筛选菌株的无菌发酵液相混合时，混合液中可视敏感菌生长状况添加适量牛肉膏蛋白胨培养基，添加重量比例为牛肉膏蛋白胨培养基混合液=1 100-1 5。转化右旋磷霉素为左旋磷霉素催化菌株的鉴定。上述吸光度不减少或减少较小者，可能为右旋磷霉素转化左旋磷霉素催化菌株，利用薄层层析进一步来验证发酵液中是否存在左旋磷霉素。薄层层析方法具体如下展开剂为正丁醇、乙酸、水按体积比3 1 1混合，将展开后的层析板风干，置于上述20 X 30cm的生物鉴定平板上，待浸润后取下，37°C培养16小时至生物鉴定盘上或平板上产生抑菌圈，在层析板含有磷霉素相同位置产生抑菌圈。由抑菌圈位置计算相对迁移率即Rf值(比移值)，通过与标准左旋磷霉素比较Rf值，定性分析发酵液中是否存在左旋磷霄素。实施例首先，以大肠杆菌接种牛肉膏蛋白胨液体培养基，37°C下培养Mh，制备大肠杆菌株的菌悬液，使其细菌浓度为IO8-IOki个细菌/ml，即制成为高浓度敏感菌悬液。再将可能把右旋磷霉素转化为左旋磷霉素的待筛选催化菌株(通过左旋磷霉素抗性和/或右旋磷霉素利用的这两种特性采用常规技术初步判断菌株是否为可能转化的菌株)接种于催化培养基中，经摇瓶培养72小时后，吸取发酵液，通过0. 45 μ m孔径滤膜过滤除去发酵液中的细菌，制成待筛选菌株的无菌发酵液。然后，按一定比例把上述的高浓度敏感菌悬液与待筛选菌株的无菌发酵液相混合，使混合液中敏感菌终浓度为IO3个细菌/ml，把混合液于37°C温度下培养12小时，取该培养液于600nm分光光度计中测定其吸光度。获得培养12小时与培养初始时刻混合液的吸光度差值(见表1)，筛选出吸光度增加幅度较低者，取其原始待筛选催化菌株，进一步验证其转化右旋磷霉素为左旋磷霉素能力。上述的牛肉膏蛋白胨培养基组成为按重量百分数计，牛肉膏0.5%，蛋白胨1%， NaCl 0.2%，余量为水；pH 7. 5，121°C湿热灭菌 20min。上述的待筛选催化菌株的催化培养基组成为按重量百分数计，右旋磷霉素
1.0%, (NH4)2S040. 8%，NaCl 0. 2%, KCl 0.1%, MgSO4 · 7H20 0. 02%, FeSO4 · 7Η200· 02%， KH2PO4O. 10%，余量为水。pH 7. 5，121°C湿热灭菌20min。恒温震荡培养，培养温度30°C、摇床转速200rpm，培养时间5天。在把高浓度敏感菌悬液与待筛选菌株的无菌发酵液相混合时，混合液中可视敏感菌生长状况添加适量牛肉膏蛋白胨培养基，添加重量比例为牛肉膏蛋白胨培养基混合液 =1 100-1 5 (本实施例为 1 50)。转化右旋磷霉素为左旋磷霉素催化菌株的定性鉴定。上述吸光度减少较小者，可能为右旋磷霉素转化左旋磷霉素催化菌株，利用薄层层析进一步来验证发酵液中是否存在左旋磷霉素。薄层层析方法具体如下展开剂为正丁醇、乙酸、水按体积比3 1 1混合，将展开后的层析板风干，置于上述20 X 30cm的生物鉴定平板上，待浸润后取下，37°C培养16小时至生物鉴定盘上或平板上产生抑菌圈，在层析板含有磷霉素相同位置产生抑菌圈。由抑菌圈位置计算相对迁移率即Rf值(比移值)，定性分析发酵液中是否存在左旋磷霉素，通过与标准左旋磷霉素比较 Rf值。在本实施例中，选取3号和14号菌株继续鉴定其产物是否为左旋磷霉素，其中3 号菌株的产物被鉴定为左旋磷霉素。表1.待筛选菌株培养初始时刻的混合液和培养第12小时的培养液吸光度值
雜菌· 号123456789101112131415培働台时刻吸贼值0.350.430.310.460.370.50.340.290.410.360.310.440.380.280.42髒第12小时吸贼值0.690.880.420.750.890.730.650.760.820.680.530.880.760.440.93吸光度值差0.340.450.110.290.520.230.310.470.410320.220.440.380.160.5权利要求
1.一种转化右旋磷霉素为左旋磷霉素生物催化菌株的筛选方法，其特征是首先，制备左旋磷霉素敏感菌株的菌悬液，使其细菌浓度为IO8-IOltl个细菌/ml ；然后，将左旋磷霉素敏感菌株的菌悬液加入经0. 45 μ m孔径滤膜过滤除菌的待筛选催化菌株的无菌发酵液中，在培养初始时刻和培养一段时间后，取发酵液于600nm分光光度计中测定其吸光度；选取培养一段时间后吸光度增加幅度最低或较低者，进一步验证其原始待筛选菌株是否具有转化右旋磷霉素为左旋磷霉素能力。
2.按照权利要求1所述的转化右旋磷霉素为左旋磷霉素生物催化菌株的筛选方法， 其特征是以牛肉膏蛋白胨培养基制备左旋磷霉素敏感菌株的菌悬液，使其细菌浓度为 IO8-IO10个细菌/ml ；将可能把右旋磷霉素转化为左旋磷霉素的待筛选催化菌株接种于催化培养基中，经摇瓶培养20-120小时后，吸取发酵液，通过0. 45 μ m孔径滤膜过滤除去发酵液中的细菌，制成待筛选菌株的无菌发酵液。
3.按照权利要求2所述的转化右旋磷霉素为左旋磷霉素生物催化菌株的筛选方法， 其特征是牛肉膏蛋白胨液体培养基组成为按重量百分数计，牛肉膏0.5%，蛋白胨1%， NaCl 0. 2%, pH 7. 5，余量为水；121°C湿热灭菌 20min。
4.按照权利要求2所述的转化右旋磷霉素为左旋磷霉素生物催化菌株的筛选方法，其特征是左旋磷霉素敏感菌株为大肠杆菌或金黄色葡萄球菌。
5.按照权利要求2所述的转化右旋磷霉素为左旋磷霉素生物催化菌株的筛选方法，其特征是，待筛选催化菌株的催化培养基组成为按重量百分数计，右旋磷霉素0. 5-3.0%, (NH4)25040· 5-1. 0 %, NaCl 0. 2 %, KCl 0. 1 %, MgSO4 · 7Η200· 01-0. 02 %, FeSO4 · 7Η20 0.01-0. 03%, KH2PO4O. 05-0. 15%，余量为水；pH 7. 5，121 °C湿热灭菌 20min，恒温震荡培养，培养温度^_37°C、摇床转速150-250rpm，培养时间3-7天。
6.按照权利要求2所述的转化右旋磷霉素为左旋磷霉素生物催化菌株的筛选方法，其特征是把敏感菌株的菌悬液与待筛选菌株的无菌发酵液相混合，使混合液中敏感菌终浓度为IO2-IO4个细菌/ml，把混合液于37°C温度下培养8_48小时，取该培养液和培养初始时刻的混合液于600nm分光光度计中测定其吸光度，获得培养8-48小时培养液与培养初始时刻混合液的吸光度差值，筛选出经培养一段时间吸光度不增加或增加幅度较低者，取其原始待筛选催化菌株，进一步验证其转化右旋磷霉素为左旋磷霉素能力。
7.按照权利要求6所述的转化右旋磷霉素为左旋磷霉素生物催化菌株的筛选方法，其特征是左旋磷霉素敏感菌株的菌悬液与待筛选菌株的无菌发酵液相混合时，混合液中视敏感菌生长状况添加牛肉膏蛋白胨培养基，添加重量比例为牛肉膏蛋白胨培养基混合液 =1 100-1 5。
全文摘要
本发明涉及生物医药和生物技术领域，具体为一种催化右旋磷霉素为左旋磷霉素菌株的高灵敏筛选方法。首先，制备左旋磷霉素敏感菌株的菌悬液，使其细菌浓度为108-1010个细菌/ml；然后，将左旋磷霉素敏感菌株的菌悬液加入经0.45μm孔径滤膜过滤除菌的待筛选催化菌株的无菌发酵液中，在培养初始时刻和培养一段时间后，取发酵液于600nm分光光度计中测定其吸光度；选取培养一段时间后吸光度增加幅度最低或较低者，进一步验证其原始待筛选菌株是否具有转化右旋磷霉素为左旋磷霉素能力。该方法既大幅度提高转化右旋磷霉素为左旋磷霉素生物催化菌株筛选方法的灵敏度，也因为检测方法简便易行而大大提高筛选效率。
文档编号C12N1/00GK102154104SQ201010616820
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月30日 优先权日2010年12月30日
发明者周丽沙, 周凯, 孔双, 季光辉, 张大鹏, 徐慧, 杨伟超, 王若超, 纪悦, 赵华, 金玉坤, 韩斯琴 申请人:东北制药集团股份有限公司, 中国科学院沈阳应用生态研究所