专利名称：一种利用葡萄糖酸盐废菌体制备葡萄糖氧化酶的方法
技术领域：
本发明属于葡萄糖氧化酶的一种制备方法，具体涉及葡萄糖酸盐系列产品的黑曲霉发酵废菌体中葡萄糖氧化酶的提取方法。
背景技术：
葡萄糖氧化酶是一种需氧脱氢酶，可以除去食品和容器中的氧，从而有效地防止食物的变质，广泛应用于茶叶、冰淇淋、奶粉、啤酒、果酒及其他饮料制品的包装中。目前葡萄糖氧化酶主要从培养黑曲霉或从霉菌中提取，通常利用黑曲霉、青霉发酵后获得的菌丝体，经过破壁，缓冲液，离心提取，获得胞内葡萄糖氧化酶的粗酶液；或直接利用发酵液经过滤、硫酸铵盐析沉淀、Sephadex脱盐、DEAE-纤维素离子交换层析及 SpehadexG-IOO凝胶层析进行分离纯化，制得一定量的酶制剂。其生产成本高，提取工艺繁琐，周期长，废水量大。
发明内容
为了克服现有生产方法中所存在的缺点，本发明提供了一种利用葡萄糖酸盐生产过程中的废菌体提取制备葡萄糖氧化酶的方法。本发明所述的利用葡萄糖酸盐生产中的废菌体制备葡萄糖氧化酶的方法，包括将葡萄糖酸盐发酵液经过板框过滤后，分离制得黑曲霉菌体；菌体洗涤后，经高压均浆机中均质处理，使其破壁自溶；通过两次超滤浓缩，得到粗制酶液，冷冻离心得到含有葡萄糖氧化酶的上清液；上清液经过盐析沉淀、透析、浓缩后得到食品级葡萄糖氧化酶。本发明所述制备葡萄糖氧化酶的方法具体操作方法如下
(1)过滤
将葡萄糖酸钠发酵液经过滤布孔径不大于0. 45 μ m的板框过滤后，分离得到废黑曲霉菌体；
(2)洗涤
将分离得到的废黑曲霉菌体，用体积比为1: (5 10)的蒸馏水或者pH5飞的Tris-HCl 缓冲液洗涤，去除菌丝体表面的杂质；
(3)破壁自溶
将清洗后的黑曲霉菌体，利用转速达1200(Tl5000rad/min的高压均浆机均质2 4hr， 进行破壁处理，并用用体积比为1 (5 10)、pH5飞的Tris-HCl缓冲液保存24hr，使菌体内葡萄糖氧化酶游离出来；
(4)超滤浓缩
将上述菌体液，先用分子量为2000(T150000 Dal超滤膜膜过滤，去除小分子蛋白质及盐类；再用分子量为15000(T300000Dal的超滤膜浓缩，去除大分子蛋白质；
(5)冷冻离心
将菌体液用Tris-HCl缓冲液静置48hr，采用1200(Tl5000rad/min的高压均浆机，在温度4°C，冷冻离心20-30min，得到含有葡萄糖氧化酶的上清液；
(6)盐析沉淀
将含有葡萄糖氧化酶的上清液，采用PH值为5、的5(Γ80%饱和度硫酸铵溶液进行盐析沉淀，过滤后得到葡萄糖氧化酶沉淀；
(7)透析
将葡萄糖氧化酶沉淀，用Tris-HCl缓冲液稀释后，采用0. 5^2%的碳酸氢钠和广3mmol/ L的EDTA进行透析；
(8)浓缩
将透析液在0、°C温度下，采用分子量为200(Γ6000的聚乙二醇行浓缩，得到葡萄糖氧化酶酶液成品。本发明制备葡萄糖氧化酶的方法所用的原料为生产葡萄糖酸盐系列产品(如葡萄糖酸钾、钠、锌、钙、铜等)的废弃物——发酵后分离出的废菌体，原料成本极低，所制得的葡萄糖氧化酶的成本不及现有技术的一半，所制备的葡萄糖氧化酶质量达到了我国《食品添加剂使用卫生标准》(GB 2760-1996)规定，完全可以在食品等行业中使用。
具体实施例方式实施例1
将约20m3的葡萄糖酸钠发酵液，经过板框过滤后，分离制得黑曲霉菌体3. 7吨(湿基)； 将所得的黑曲霉菌体，用1:10体积的Tris-HCl缓冲液洗涤，去除菌丝体表面的杂质；将黑曲霉菌体利用高压均浆机40Mpa破壁3hr，并用pH值5 6的Tris-HCl缓冲液保存24hr， 使菌体内葡萄糖氧化酶游离出来；将菌体液先用50000Dal膜超滤，去除小分子蛋白质及盐类；再用200000Dal膜超滤，去除大分子蛋白质，得到浓缩的葡萄糖氧化酶；将浓缩液用 Tris-HCl缓冲液静置48hr，15000 rad/min、4°C冷冻离心30min后，得到含有葡萄糖氧化酶的上清液；将上清液采用PH值为7的80%饱和度硫酸铵溶液进行沉淀，过滤后得到葡萄糖氧化酶沉淀；将沉淀用Tris-HCl缓冲液稀释后，透析；将透析液0°C采用聚乙二醇2000进行浓缩，得到比活为145U/mg的葡萄糖氧化酶酶液4. 9L。实施例2和实施例3操作步骤与实施例1基本相同，详细操作条件见下表 实施实例操作条件表
权利要求
1.一种利用葡萄糖酸盐废菌体制备葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于包括以下步骤 将葡萄糖酸盐发酵液经过板框过滤后，分离制得黑曲霉菌体；菌体洗涤后，经高压均浆机中均质处理，使其破壁自溶；通过两次超滤浓缩，得到粗制酶液，冷冻离心得到含有葡萄糖氧化酶的上清液；上清液经过盐析沉淀、透析、浓缩后得到食品级葡萄糖氧化酶。
2.如权利要求1所述的制备葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于葡萄糖酸盐发酵液的板框过滤分离所用的滤布孔径不大于0. 45 μ m。
3.如权利要求1所述的制备葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于黑曲霉菌体的洗涤，采用PH值为5飞Tris-HCl缓冲液，菌体与缓冲液体积比为1: (5 10)。
4.如权利要求1所述的制备葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于黑曲霉菌体破壁自溶， 采用转速达1000(Tl5000rad/min的高压均浆机均质处理2 4hr。
5.如权利要求1所述的制备葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于所述黑曲霉菌体的两次超滤浓缩分别采用2000(Tl50000Dal和15000(T300000Dal分子量的超滤膜。
6.如权利要求1所述的制备葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于所述葡萄糖氧化酶酶液的冷冻离心采用转速12000 15000 rad/min的高压均浆机采用1200(Tl5000rad/min的高压均浆机，在温度4°C，冷冻离心20-30min，得到含有葡萄糖氧化酶的上清液。
7.如权利要求1所述的制备葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于所述葡萄糖氧化酶上清液的盐析沉淀采用50、0%硫酸铵饱和度溶液，pH值为5 8，进行盐析沉淀。
8.如权利要求1所述的制备葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于所述葡萄糖氧化酶上清液的透析采用0. 5^2%的碳酸氢钠和广3mmol/L的EDTA进行透析。
9.如权利要求1所述的制备葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于所述葡萄糖氧化酶上清液的浓缩，采用分子量为2000 6000的聚乙二醇进行浓缩，温度为0、°C。
全文摘要
本发明涉及一种利用葡萄糖酸钠废菌体制备葡萄糖氧化酶的生产方法，包括将葡萄糖酸钠发酵液，经过板框过滤后，分离制得黑曲霉菌体；黑曲霉菌体经洗涤后，经高压均浆机中均质处理，使其破壁自溶；通过两次超滤浓缩，得到粗制酶液；冷冻离心后得到含有葡萄糖氧化酶的上清液；上清液经过盐析沉淀、透析、浓缩后得到食品级葡萄糖氧化酶。本发明方法所提取葡萄糖氧化酶达到我国《食品添加剂使用卫生标准》(GB2760-1996)规定。
文档编号C12N9/02GK102154233SQ20101061840
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月31日 优先权日2010年12月31日
发明者张树禄, 王一, 王勇, 马仕敏 申请人:山东西王生化科技有限公司