专利名称：中国南海疣镐芋螺神经毒素及其编码序列和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种多肽及其编码序列和应用，尤其涉及一种芋螺神经毒素多肽及其编码序列和应用。
背景技术：
芋螺，亦称鸡心螺，系软体动物门，腹足纲，前鳃亚纲，芋螺科(Conidae)动物之总称。芋螺是一类肉食性海洋软体动物，分类学上属腹足纲前鳃亚纲芋螺科，它们通过其毒管中的芋螺毒素麻醉动物以帮助捕食.芋螺根据其食性可以分为三类食鱼性、食虫性和食螺性芋螺，其中食鱼性芋螺的毒素对人和哺乳动物毒性较大。芋螺毒素为其毒液中的有效成分，是一种具有独特神经药理作用的小肽，由7-41个氨基酸残基组成，一般富含二硫键。 根据其二硫键的构成情况可分为两大类含有多对二硫键及只含有一对或不含二硫键的。 在近499种芋螺中据认为有超过49999种芋螺毒素肽，根据其前体信号肽序列可以分为几个超家族，如M、A和0)超家族，每个超家族的前体拥有共同的高保守的信号序列。大量的研究表明，芋螺毒素具有独特的能够高特异选择性识别结合其作用靶(受体门控离子通道，电压门控离子通道)，产生拮抗剂(antagonist)或阻断剂(blocker)的作用。芋螺毒素识别其作用靶具有高特异性及选择性，它们只作用于某一类特定亚型的受体或通道。目前作用于受体门控离子通道的有nAchR拮抗剂、NMDA受体拮抗剂；作用于电压门控离子通道阻断剂的有Na+通道阻断剂、k+通道阻断剂Ca2+通道阻断剂等。目前已知的芋螺毒素大多是从食鱼芋螺中分离得到，食虫芋螺的毒液研究的相对较少。至今已有数种芋螺毒素申请美国专利，它们在镇痛、局部缺血性保护、癫痫治疗、某些疾病诊断和受体研究中具有广泛的应用价值，有的已进入临床研究或已被FDA正式批准为治疗新药，用作特异诊断试剂和镇痛药。如由Olivera等从幻芋螺(Conus magus)中分离的 ω-CTX,MVIIA,已被美国FAD正式批准为治疗顽痛的药物，其商品名Ziconotide。ω -芋螺毒素MVIIA是由25个氨基酸、3对二硫键组成的碱性亲水性小肽，C端酰胺化，N端为Cys。 可选择性抑制N型电压敏感性钙通道，广泛用作神经生物学探针和无致瘾性镇痛剂，并具有多种药物发展前景；沿脊髓传递的Ziconotide能阻断伤害感受器释放神经传递素，阻止疼痛信号传入大脑，临床表现出强大的镇痛作用，效果优于吗啡等现有的镇痛剂，用于艾滋病、癌症及神经痛患者的治疗，无成瘾性，且疗效确切。来源不同的ω-CTX，尽管其氨基酸序列不同，但在结构上的差异都不是很大，如来自地纹芋螺(C. geographus)的GVIA、GVIC、 GVIIA和GVOIB等，和来自幻芋螺MVIIA、MVIIC、以及来自线纹芋螺(C. striatus)的S03等 ω -CTX，在药理学方面有相似的作用。我国关于芋螺毒素研究的报道不多，大多为综述芋螺毒素的研究概况及应用前景。卢柏松等，魏开华等对我国的少数几种芋螺(线纹芋螺，织锦芋螺和桶形芋螺)的毒素基因或毒液成份进行了研究。我国近海的芋螺约有70种，主要分布在海南岛，西沙群岛和台湾，大多数种类的芋螺毒素研究还未展开。由于每种芋螺毒液都有自己特定的药理学作用范围和生物学活性，因而使芋螺毒素具有重要的理论研究价值和应用价值。多样性的芋螺毒素既可直接用作天然药物，又可以作为设计新药(用于治疗重大疑难杂症)的先导化合物。深入研究芋螺毒素，不仅对海洋制药工业具有重要意义，而且可为我国芋螺海洋资源的开发利用提供重要理论依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种中国南海疣镐芋螺神经毒素基因Ivl. 3。本发明另一目的是提供上述神经毒素基因Ivl. 3编码的多肽lvlc。本发明另一目的是提供上述多肽lvlc在制备神经生物学研究的工具药和镇痛药物中的应用。本发明所选择的疣镐芋螺属于中国南海食虫性疣镐芋螺(Conus lividus)，采自
海南省三亚市。本发明采用构建cDNA文库的方法，从中国南海疣镐芋螺毒管中克隆得到神经毒素基因Ivl. 3。中国南海疣镐芋螺毒管cDNA文库的构建分离毒管，提取总RNA反转录合成cDNA 第一链产物；再以A超家族的信号肽和3’ UTR为引物，以cDNA为模板通过PCR进行基因克隆，将PCR产物与pGEM-T Easy Vector相连，连接产物转化液分别涂平板，从平板上挑取单克隆进行测序。得到中国南海疣镐芋螺神经毒素基因Ivl. 3，其DNA序列如序列表中<400>1 序列所示。利用工具软件SEQT00L对上述神经毒素基因Ivl. 3的碱基序列进行分析，获得其最大读码框，长度l%bp，可编码65个氨基酸残基的前体肽。通过进一步分析，确定神经毒素基因Ivl. 3编码的多肽Ivlc的前体肽和推测的成熟肽氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示上述多肽Ivlc的成熟肽由16个氨基酸组成，分子量为1795. 04道尔顿，具有典型芋螺毒素多肽一级结构的特征，分子内具有两对二硫键，第一个和第三个半胱氨酸成一对二硫键，第二个和第四个半胱氨酸成另一对二硫键。本发明利用固相化学合成法合成上述多肽lvlc。采用仪器合成策略，运用 FmocPHOBtPDCC方法，Rink树脂及Fmoc-氨基酸，偶联剂为DCC-H0BT，哌啶脱Fmoc-基，合成步骤参考仪器合成手册进行。肽-树脂裂解试剂组成及肽回收方法与手工合成方法相同。 通过固相化学合成线性多肽，然后交叉环化成具有两对二硫键以及C末端酰胺化修饰的成熟肽，经HPLC鉴定通过固相化学合成法合成的多肽Ivlc纯度达到95%，MALDI-T0F鉴定其分子量正确。本发明提供的多肽Ivlc作用于青蛙坐骨神经-腓肠肌标本，可有效阻断神经一肌接头处的递质传递并抑制肌肉收缩；而在小鼠热板法测定生理模型上的中枢镇痛药效实验中，上述多肽Ivlc作用于小鼠时表现出明显的中枢镇痛效果，且药效优于阳性对照药利多卡因。因此，本发明提供的多肽Ivlc可应用于制备神经生物学研究的工具药和镇痛药物。
图1为中国南海疣镐芋螺毒管cDNA的凝胶电泳图。图2为pGEM-T Easy Vector载体环形图谱及相关的序列位点；
图3为神经毒素基因Lvl. 3编码的成熟肽序列与A超家族芋螺毒素成熟肽序列的比较结果；图4为固相化学合成多肽Ivlc的HPLC分析图；图5鉴定固相化学合成多肽Ivlc分子量的MALDI-T0F质谱图；图6为多肽Ivlc的电生理活性鉴定实验结果图；图7为多肽Ivlc生理模型上的镇痛药效实验结果图。
具体实施例方式以下结合具体实施例，来进一步说明本发明的技术方案。应理解，以下实施例只用于说明本发明而不以任何形式限制本发明。实施例1 疣镐毒管组织总RNA的提取及毒素cDNA克隆总RNA的提取参照Gibcol BRL公司的TRIZOL LS试剂说明书进行。Taq DNA聚合酶、10XPCRBuffer和dNTP购自鼎国公司；PCR引物由hvitrogen公司合成；其他有机试剂均为国产分析纯试剂，购自广州化学试剂厂。取活螺体，用石工锤破碎螺壳，暴露出螺肉，冰上小心并快速分离毒管组织，称重后迅速放入液氮并充分研磨，加入15倍重量体积的TRIZOL LS试剂(即Ig组织中加入15ml)，冰浴中充分勻浆，-80°C冰箱中保存以备提取总RNA。取50_100mg组织样品，用 0. 75ml TRIZOL LS试剂勻浆，15_30°C静置5min。然后加入0. 2mL氯仿，剧烈振荡15秒后，15-30°C静置2-15min。4°C、12，OOOrpm离心15min，取上层水相。加入0. 5ml异丙醇， 15-30°C静置IOmin后，4°C、12，OOOrpm离心lOmin，弃上清。再加Iml 75%乙醇漂洗沉淀， 5，OOOrpm离心5min，弃上清，真空干燥去除样品中痕量的乙醇，加入适量无RNase的去离子水。取1 μ 1进行琼脂糖胶电泳，1 μ 1用紫外分光光度计估算RNA的浓度与纯度，_20°C 保存备用。l)cDNA第一链的合成cDNA第一链的合成使用 Clontech 公司的 SMART PCR cDNA Synthesis Kit，按照说明书进行试验。在5 μ 1反应体系中加入下列组分(于冰上操作)1 μ g螺毒管总RNA， SMART Illolignucleotide和CDS 111/3，PCR引物各1 μ 1，以超纯水补齐体积，混勻，短暂离心。72°C温育2min，冰浴2min，短暂离心，使混合物集于管底。再依次加入2 μ 1 5 XFirst Strand BufferU μ 120mmol/L 的 DTTU μ 1 10mmol/L 的 dNTP Mix 禾口 1 μ 1 PowerScript RT后轻弹管壁，混勻并短暂离心。置PCR仪42°C反应Ihr逆转录合成第一链，冰浴终止反应，-40°C保存。2) A-超家族芋螺毒素的cDNA克隆PCR引物序列上游引物5，ATGGGCATGCGGATGAT 3，下游引物5，TGGACGATGTAATAACAGCAAG 3，
PCR体系PCR程序组分体积(μ D95 "C预变性3min
权利要求
1.一种中国南海疣镐芋螺神经毒素基因，其特征在于序列如序列表400<1>所示。
2.一种由根据权利要求1所述的芋螺神经毒素基因编码的多肽，其特征在于该多肽的成熟肽序列如序列表400<2>所示。
3.权利要求2所述神经毒素多肽在制备神经生物学研究的工具药和镇痛药物中的应
全文摘要
本发明提供一种中国南海疣镐芋螺神经毒素基因lv1.3及其编码的多肽lv1c，以及上述神经lv1c在制备神经生物学研究的工具药和镇痛药物中的应用。本发明采用构建cDNA文库的方法，从中国南海疣镐芋螺毒管中克隆得到的芋螺毒素基因lv1.3，通过工具软件SEQTOOL对碱基序列进行分析，确定上述芋螺毒素基因lv1.3编码的多肽lv1c的成熟肽氨基酸序列如序列表400所示。本发明提供的多肽lv1c能阻断神经肌接头的递质传递，小鼠热板法显示该多肽lv1c具有镇痛作用，可用于制备神经生物学研究的工具药和镇痛药物。
文档编号C12N15/12GK102154300SQ20101062011
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月31日 优先权日2010年12月31日
发明者任政华, 冯宇超, 吴赟, 强媛媛, 徐安龙, 王磊 申请人:中山大学