专利名称：一种人41型腺病毒(Ad41)包装细胞株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因治疗和重组疫苗领域中一种腺病毒Ad41的包装细胞及其应用。
背景技术：
肠道作为基因治疗的靶器官有诸多优点(a)给药方式简便，可以直接口服给药或选择内窥镜给药；(b)肠道上皮的表面积大，便于载体的充分吸附和感染；(c)肠道上皮的隐窝细胞是干细胞，对其的感染能延长目的基因的表达时间(Croyle MA, Stone M, Amidon GL, Roessler BJ. In vitro and in vivo assessment of adenovirus41 as a vector for gene delivery to the intestine. Gene Ther，1998，5(5) :645-654. [pubmed 9797869])。粘膜是多数病原微生物入侵机体的第一道屏障，口服给药的疫苗能激发粘膜免疫和系统免疫，是今后疫苗研究的重要方向。腺病毒载体(Adenovector，Ad)由于具有遗传稳定、感染细胞效率高、不整合入细胞基因组(安全性好)等优点被广泛用于基因治疗和重组疫苗研究。人F组腺病毒包括Ad40和Ad41两个成员，能引起婴幼儿急性胃肠炎，是天然的肠道病原，被称为肠腺病毒(entericadenovirus)(Tiemessen CT, Kidd AH. The subgroup F adenoviruses. J Gen Virol, 1995, 76 (Pt 3) :481-497. bubmed :7897343])。研究表明 Ad41 对胃酸和肠消化液有很强的耐受性，对分化的肠上皮细胞感染能力强，是理想的用于肠道给药的基因治疗载体(Favier AL, Burmeister WP, Chroboczek J. Unique physicochemical properties ofhuman enteric Ad41 responsible for its survival and replication in thegastrointestinal tract. Virology,2004,322 (1) :93-104. bubmed : 15063120])。前期研究中，发明人从婴幼儿腹泻标本中分离到一株野生型Ad41病毒，以其基因组DNA为基础，构建了穿梭质粒pSh41-CMV和骨架质粒pAdbone41。利用这2个质粒，能够构建携带目的基因的重组Ad41质粒，腺病毒质粒经限制性内切酶RiieI线性化后，转染 ^3E12包装细胞，能够拯救和扩增重组Ad41病毒。但 3E12的病毒包装能力较弱，重组病毒需要扩增10-12代，病毒产量才能达到IO12颗粒(viral particles, vp) (Lu ZZ, Zou XH, Dong LX, Qu JG, Song JD, Wang M, Guo L, Hung T. Novel recombinant adenovirus type 41vector and its biological properties. J Gene Med,2009,11(2) 128-138. [pubmed 19097028])。293细胞是腺病毒Ad5El区转化的人胚肾细胞，组成型表达Ad5El基因(包括 ElA, E1B19K和E1B55K)。腺病毒E1B5^(蛋白具有型特异性，Ad5的E1B5^(不能完全替代 Ad41ElB55K的生物功能，野生型Ad41在293细胞复制困难，El区缺失的重组Ad41载体无法在293细胞拯救和包装。^3E12包装细胞是表达Ad41 E1B5^(的293细胞，如果进一步提高Ad41 E1B55K 表达量，有可能提高Ad41病毒包装效率。腺病毒晚期基因mRNA的5’非翻译区含有一段共有序列，它来源于主要晚期启动子下游的3个外显子，被称为三联体前导序列 (tripartiteleader sequence, TPL)，TPL 有利于病毒晚期 mRNA 的转运和翻译(Huang W,Flint SJ. The tripartite leader sequence of subgroup Cadenovirus major late mRNAs can increase the efficiency of mRNAexport. J Virol,1998,72(1) :225-235. [pubmed :9420219] ；Dolph PJ, Racaniello V, Villamarin A, Palladino F, Schneider RJ. Theadenovirus tripartite leader may eliminate the requirement forcap-binding protein complex during translation initiation. J Virol,1988,62 (6) :2059-2066. [pubmed :2835510])。研究表明，如果将TPL添加于启动子和目的基因编码区之间，转录后 TPL位于目的基因mRNA 5’非翻译区，这样能够提高目的基因的表达量(Sheay W, Nelson S, Martinez I,Chu ΤΗ, Bhatia S, Dornburg R. Downstreaminsertion of the adenovirus tripartite leader sequence enhancesexpression in universal eukaryotic vectors. Biotechniques，1993，15(5) :856-862. [pubmed :8267981])。
发明内容
本发明中，发明人克隆了 Ad41的TPL，将其插入到pcDNA3-ElB5^(载体的CMV启动子和Ad41 E1B5^(基因之间，构建了新的Ad41 E1B5^(表达载体；转染293细胞，筛选建立了 1株新的包装细胞^3TE7。相对^3E12，293TE7细胞对重组Ad41 DNA的拯救能力提高了 23倍，重组病毒包装能力提高了 8-13倍。在一个实施方案中，本发明提供了一种腺病毒Ad41包装细胞株^3TE7，其于2010 年10月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所(邮编100101)，其保藏号为CGMCC No. 4M8，分类命名为人胚肾细胞。在另一个实施方案中，本发明提供了一种Ad41 E1B55K真核表达质粒 PCDNA3TPL-E1B55K，其特征在于在pcDNA3质粒的多克隆位点处插入腺病毒Ad41的三联体前导序列TPL、腺病毒Ad41 E1B5^(基因。优选地，其中TPL位于CMV启动子和Ad41 E1B55K 基因之间。在一个优选的实施方案中，上述的真核表达质粒PCDNA3TPL-E1B55K的Ad41 E1B55K基因来源于人腺病毒Ad41。在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含上述真核表达质粒 PCDNA3TPL-E1B55K的腺病毒Ad41包装细胞株，优选地所述细胞为293细胞。。在另一个实施方案中，本发明提供了一种构建上述的包装细胞株的方法，其特征在于包括下述步骤(1)以上述质粒pcDNA3TPL_ElB5^(转染四3细胞；(2)以G418筛选持续、稳定、高水平表达Ad41 E1B55K的293细胞；(3)挑取阳性细胞进行克隆、扩增培养，选择重组Ad41包装能力强的克隆化细胞持续培养作为野生型或重组Ad41包装细胞。在另一个实施方案中，本发明提供了一种使用上述方法构建的包装细胞株。在另一个实施方案中，本发明提供了一种生产重组腺病毒Ad41的方法，使用前述任一种包装细胞株。在一个优选的实施方案中，所述真核表达质粒pcDNA3TPL_ElB5^(被稳定整合到前述包装细胞的染色体上。
在另一实施方案中，本发明提供了一种生产重组腺病毒Ad41的方法，其中使用了上述的包装细胞株。利用本包装细胞株能够拯救或扩增El区缺失的重组Ad41腺病毒。采用DNA转染或病毒感染的方式将重组病毒的基因组运输到包装细胞的细胞核，重组Ad41基因组缺失El区(包括E1A，E1B19K和E1B55K基因)，而包装细胞表达Ad5 E1A、Ad5 E1B19K和 Ad41ElB55K能够替代Ad41 El的功能，结果重组病毒基因组复制，结构蛋白表达，在细胞内包装形成完整的具有感染性的Ad41病毒颗粒。由于Ad41是天然的肠道病原，预计本发明产生的重组Ad41病毒在肠道基因治疗和口服重组疫苗研究中有广阔的应用前景。
图1是Ad41 E1B55K真核表达质粒pcDNA3TPL_ElB5^(构建示意图。图中Amp 氨苄青霉素抗性开放读码框(ORF) ；CMVp 巨细胞病毒启动子；TPL :Ad41三联体前导序列；Ad41 E1B55K :Ad41ElB55K ORF ；pAl :BGH多聚 A信号；SV40p :SV40 启动子；Neo 新霉素抗性 ORF ； pA2 :SV40 多聚 A 信号；ColEl =ColEl 起点。图2是荧光显微镜观察携带GFP报告基因的重组Ad41病毒(Ad41_GFP)在克隆化细胞的复制。293TE克隆化细胞传代到M孔板，1天后，各孔接种5X IO5Vp (viral particle)的Ad41_GFP病毒，接毒后7天和9天荧光显微镜观察并照相，这里给出的是 293TE7，293TE14，293TE15 和 293TE17 的结果。图3是^3TE7细胞与^3E12细胞比较病毒包装能力的结果。拯救或扩增的子代病毒利用293细胞测定感染滴度。限制性内切酶RiieI线性化的重组病毒质粒pAd41_GFP 转染^3TE7、293E12或293细胞，结果显示^3TE7细胞拯救产生的病毒约为^3E12的23 倍，而293细胞中未检出重组病毒(A)；当用5 X IO5Vp的重组病毒AcMl-GFP感染IX IO5包装细胞时，在感染7-9天后，293TE7细胞产生的子代病毒数量为^3E12细胞的8_13倍，比 293细胞产生的病毒量高IO4倍(B)。图4是免疫荧光检测 3TE7细胞中Ad41 E1B5^(表达的结果。结果显示^3TE7细胞中Ad41 E1B5^(表达水平明显高于细胞，而对照293细胞不表达Ad41 E1B55K。
具体实施例方式本文涉及的pcDNA3-ElB5^(质粒、pAd41_GFP质粒、纯化的重组Ad41_GFP病毒和 ^3E12细胞由前期工作构建或保存，请见中国发明专利(鲁茁壮，屈建国，洪涛。复制缺陷型重组腺病毒Ad41载体系统及其应用，申请号200810U6855. 3，申请日期2008年7月1 日；具体参见说明书第8页第1段关于pcDNA3-ElB5^(质粒的构建，说明书第9页第2段关于pAd41-GFP质粒的构建，说明书第8页实施例4重组腺病毒Ad41_GFP的制备，以及说明书第7页实施例3包装细胞系的构建，以上内容通过引用的方式纳入本文)或文献(LuZZ, Zou XH, Dong LX, Qu JG, Song JD, Wang M, Guo L, Hung T. Novel recombinant adenovirus type 41 vector and its biologicalproperties. J Gene Med,2009,11(2) 128-138. [pubmed :19097028]，以上内容通过引用的方式纳入本文)实施例1、Ad41 E1B55K真核表达质粒pcDNA3TPL_ElB55K的构建
l)Ad41 TPL 的克隆Ad41-GFP为携带GFP基因的重组Ad41病毒。指数生长的^3E12细胞接种25cm2 培养瓶，培养基为含有8%胎牛血清(FBS，Hyclone公司)的DMEManvitrogen公司)，1天后接种AcMl-GFP病毒2 X IO8Vp ；感染48小时后，去除培养基，以5ml IOmM磷酸盐缓冲液 (PBS)洗涤细胞1次，添加TRIzol (Invitrogen公司)lml，按TRIzoI说明书操作提取细胞 RNA。使用引物 tpl-R2(SEQ ID NO 1 :agcatggcct cctcgtca)用 AMV 逆转录酶(Promega 公司)将RNA逆转录为cDNA (依据AMV逆转录酶说明书操作)。使用tpl_Fl (SEQ IDNO 2 actttcttcc gcatcgctgt)和 tpl-R2 为引物，以 KOD-Plus 耐热 DNA 聚合酶(Toyobo 公司) 进行第1轮PCR扩增；反应体系为灭菌水32 μ 1，IOXPCR缓冲液5 μ l，2mM dNTP 5μ 1, 25mM MgSO4 2 μ 1，引物(10 μ Μ)各 1· 5 μ 1，cDNA 模板 2 μ 1, KOD-plus DNA 聚合酶 1μ 1，共计 50μ 1。反应条件为94°C 2min ； 94 °C 30s, 55 °C 30s, 68 °C 30 s，30 个循环；68°C 5min。 以第一轮 PCR 产物为模板，再使用 tpl-Fl 和 tpl-Rl(SEQ ID NO 3 :cgcatctgtc gcaacacc) 为引物，进行第2轮PCR扩增(反应体系和反应条件同第一轮反应)。第2轮PCR反应结束后，添加重组iTaq DNA聚合酶(Takara公司)1 μ 1 (5U)，72度保温lOmin，以便在PCR产物3， 端添加A。加A后的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，切下目的条带，利用DNA凝胶回收试剂盒(Takara公司)回收。将回收的PCR产物克隆到pMD18_T载体(Takara公司)中，得 pMD-TPL 质粒。具体步骤为:pMD18-T 载体 1 μ 1 (50ng)，PCR 产物 1 μ 1 (15ng)，灭菌水 3 μ 1， Solution I 5μ 1(DNA连接试剂盒，Takara公司)；16°C连接3小时，取5 μ 1转化T0P10感受态细菌(Tiangen公司)，挑取3个菌落，用液态LB培养基扩大培养后，保存菌种，提取质粒pMD-TPL。对插入片段进行测序，测序结果与Ad41基因组序列比对，可知Ad41 TPL序列为SEQID NO :4 中所示的序列(Genbank accession no. HM565136)。2)将 Ad41 TPL 插入 pcDNA3_ElB55K 质粒 CMV 启动子下游以 pMD-TPL 为模板，添力口弓丨物 0901TPL_F3(SEQ ID NO 5 :ccccaagctt actttcttcc gcatcgctgt)和 0901TPL-R3(SEQ ID NO 6 :ccccaagctt gcgactgtga ttggctcgat), 以 KOD-Plus扩增TPL序列，所得PCR产物(220bp)经琼脂糖凝胶电泳后回收，方法同步骤 1)。取PCR产物200ng, HindIII限制性内酶切酶IOU(Takara公司)，反应缓冲液4ul,并补加水至40ul，于37°C酶切3小时，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后回收210bp条带；取 pcDNA3-ElB55K质粒500ng, HindIII酶10U,以40 μ 1酶切体系于37°C酶切3小时，补加牛小肠碱性磷酸酶CIP(NEB公司)0. 2 μ 1，于37°C继续保温15min，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收约6. 8kb条带。上述210bp和6. 8kb DNA片段各取2 μ 1，补加4μ 1灭菌水和Solution I 8μ 1(DNA连接试剂盒，Takara公司)，16°C连接2小时，取5μ 1转化 Τ0Ρ10感受态细菌，挑取菌落，扩大培养，提取质粒pcDNA3TPL-ElB55K(参见图1)。在质粒 pcDNA3TPL-ElB55K 中，TPL 位于 CMV 启动子和 Ad41 E1B55K 基因之间。实施例2、293TE克隆化细胞株的建立和筛选1) 293TE克隆化细胞的建立对数生长的293细胞接种6孔细胞培养瓶，添加含8 %胎牛血清(FBS，Hyclone 公司)的DMEM培养基anvitrogen公司)^iil/孔，于37°C下和饱和湿度下培养。1天后， 将4μ g pcDNA3TPL-ElB55K质粒添加到250 μ 1无血清DMEM培养基中，将10 μ 1脂质体 (Lipofectamine2000, Invitrogen公司)添加到所述250 μ 1无血清DMEM培养基中，2者混勻后室温静置20min，再直接添加到含293细胞的6孔板的1个孔中，混勻后继续培养。转染1天后，使用含0. 胰蛋白酶的磷酸盐缓冲液(PBS)消化细胞，取1/100或1/1000的细胞接种于直径IOcm的细胞培养皿中，每皿添加含G418(终浓度0. 8mg/ml)的8% FBS DMEM IOml, 5-7天换液1次，筛选10-14天；挑取20株克隆化细胞，扩大培养并冻存，分别命名为 293TE1-293TE20。2) 293TE克隆化细胞的筛选对数生长的^3TE1_293TE20传代到M孔板中，密度为1 X IO5细胞/孔，每株细胞传2孔；配制含AcMl-GFP病毒1 X 106vp/ml的2% FBS DMEM培养基，弃去M孔板中原有培养基，添加新配制的含重组病毒的培养基0. 5ml/孔，培养5天后，更换1次2% FBS DMEM培养基，继续培养5天。每2-3天荧光显微镜观察各孔荧光细胞数量和荧光强度的变化(部分克隆的代表性结果如图2所示)，以此作为病毒复制强弱的指标，GFP+细胞多、荧光强说明病毒复制强。记录荧光细胞数量较多孔的编号，最终筛得3株产毒能力较强的克隆化细胞^3TE7J93TE12和^3TE20，其中^3TE7的产毒能力最强。实施例3J93TE7病毒拯救和病毒包装能力的定量分析1) 293TE7与^3E12病毒拯救能力的比较腺病毒质粒pAd41-GFP 15 μ g，限制性内切酶RneI 25U(NEB公司)，10X酶切缓冲液20 μ 1，以200 μ 1体系酶切6小时。采用酚-氯仿法抽提质粒，乙醇沉淀回收 DNA。将^3ΤΕ7、293Ε12和四3细胞分别传代到6孔板中，1天后，按照脂质体使用说明书(Lipofectamine2000，hvitrogen 公司)操作，将 PmeI 酶切线性化的 pAd41-GFP 转染 293TE7J93E12和293细胞(具体步骤同实施例2第1)部分)。转染1天后，将培养基更换为2% FBS DMEM，继续培养10天(第5天换液1次)。将培养物于_80°C和室温之间冻融3 次，以12000g离心2分钟去除细胞碎片，将上清利用293细胞测定病毒感染滴度。如图3A 所示，293TE7产生的重组Ad41-GFP病毒滴度是^3E12细胞的23倍，而在转染pAd41_GFP 的293细胞中未检出重组病毒。病毒感染滴度的具体测定方法如下对数生长的293细胞按照1. 5 X IO4细胞/孔接种96孔细胞培养板，每孔含100 μ 10% FBS DMEM培养基，培养18- 小时。病毒液用 2% FBS DMEM培养基进行10倍梯度稀释，稀释IO1-IO6倍，每孔取100μ 1病毒稀释液添加到 96孔板中，每个稀释度添加8个孔(96孔板中的1列)。培养2天后，荧光显微镜下观察， 先确定适宜的稀释度(每孔约5-50个GFP+的绿色荧光细胞)，计数该稀释度下各孔GFP+ 细胞个数，得出单个孔的均数，病毒原液的感染滴度(IU/ml)计算公式为单孔GFP+细胞个数/每孔添加的病毒稀释液体积(0. lml) X稀释倍数。2)293TE7与^3E12、293细胞病毒包装能力的比较对数生长的^3TE7、293E12和293细胞按照1 X IO5细胞/孔的密度分别传代到2 块M孔板中，每块培养板中每株细胞传6个孔；继续培养18- 小时后，将纯化的Ad41-GFP 病毒用2% FBS DMEM稀释为1 X 106vp/ml，并且去除培养板中原有培养液，加入病毒稀释液 0. 5ml，每株细胞感染3孔，另3孔补加2% FBS DMEM 0. 5ml作为对照。于感染后7天或9 天，分别将培养板直接转移到-80°C下。培养物冻融3次，离心去除细胞碎片，上清利用四3 细胞测定子代病毒感染滴度(图3B)。结果表明^3TE7包装重组Ad41的能力约为^3E12 细胞的8-13倍，比四3细胞高IO4倍以上。
实施例4、免疫荧光检测^3TE7细胞Ad41 E1B55K的表达将对数生长的^3TE7、293E12或四3细胞传代于96孔板，继续培养18- 小时后，去除培养基，用PBS洗涤1次；加入冰甲醇并于_20°C下固定15min，吸去固定液，用含
牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液(1% BSA-PBS，漂洗液)洗涤2次，每次5min ；将抗Ad41 E1B55K小鼠抗血清用漂洗液1 100稀释，每孔50 μ 1，室温下振摇Ih;再用漂洗液洗涤3 次，每次5min;然后加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的山羊抗小鼠IgG(中杉金桥公司) 室温结合Ih (用漂洗液1 200稀释)；再用漂洗液洗涤3次后，于荧光显微镜下观察绿色荧光。结果如图4所示，293TE7细胞中Ad41 E1B5^(表达量高于^3E12 Q93细胞不表达 Ad41 E1B5^()，这说明TPL有促进目的蛋白表达的作用，较高的Ad41 E1B5^(表达水平有利于提高^3TE7的病毒包装能力。
权利要求
1.一种腺病毒Ad41包装细胞株^3TE7，其保藏号为CGMCC No. 4248
2.一种Ad41 E1B55K真核表达质粒pcDNA3TPL_ElB55K，其特征在于在pcDNA3质粒的多克隆位点处插入腺病毒Ad41的三联体前导序列TPL、腺病毒Ad41 E1B5^(基因。
3.权利要求2所述的真核表达质粒pcDNA3TPL-ElB55K，其特征在于TPL位于CMV启动子和Ad41 E1B5^(基因之间。
4.权利要求2或3所述的真核表达质粒pcDNA3TPL-ElB55K，其特征在于所述Ad41 E1B55K基因来源于人腺病毒Ad41。
5.一种包含权利要求2或3所述的真核表达质粒pcDNA3TPL-ElB5^(的腺病毒Ad41包装细胞株。
6.权利要求5所述的腺病毒Ad41包装细胞株，其特征在于所述细胞为293细胞。
7.—种构建权利要求1所述的包装细胞株的方法，其特征在于包括下述步骤(1)以权利要求2或3所述的质粒pcDNA3TPL-ElB5^(转染293细胞；(2)以G418筛选持续、稳定、高水平表达Ad41E1B5^(的293细胞；(3)挑取阳性细胞进行克隆、扩增培养，选择重组Ad41包装能力强的克隆化细胞持续培养作为野生型或重组Ad41包装细胞。
8.一种使用权利要求7所述方法构建的腺病毒Ad41包装细胞株。
9.权利要求5、6或8所述的腺病毒Ad41包装细胞株，其中所述真核表达质粒 pcDNA3TPL-ElB5^(被稳定整合到所述细胞的染色体上。
10.一种生产重组腺病毒Ad41的方法，其中使用了权利要求1、5、6、8或9所述的包装细胞株。
全文摘要
本发明涉及基因治疗和重组疫苗领域中一种人41型腺病毒(Ad41)的包装细胞株及其应用，具体地说，本发明涉及一种人41型腺病毒(Ad41)包装细胞株293TE7及其应用，该包装细胞株稳定表达Ad41 E1B55K基因，可以用于包装野生型Ad41或E1区缺失的重组Ad41。
文档编号C12R1/91GK102533657SQ20101062298
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月28日 优先权日2010年12月28日
发明者洪涛, 王敏, 邹小辉, 鲁茁壮 申请人:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所