专利名称：：一种利用兼性厌氧菌发酵制氢的方法
技术领域：
：本发明涉及一种生物制氢的方法，尤其是一种利用兼性厌氧菌制氢的方法。
背景技术：
：随着经济的快速发展和人民生活水平的不断提高，我国能源消费总量也迅速增力口。在目前所用的商品能源中95%是化石能源，但是由于化石能源开发利用过程中引起的环境问题，严重制约着可持续发展。在世界化石能源资源快速消耗，环境污染日益严重和气候变暖威胁逐渐增大的形势下，为了支持中国政府提出的到2020年单位国内生产总值二氧化碳排放比2005年较少40%至45%的目标，氢等可再生能源的开发利用尤其要受到高度重视。氢作为一种清洁的新型能源，大大地减轻了对环境的污染，保护了自然界的生态平衡，而且它本身可再生，储量十分丰富，能量密度高，是汽油的2175倍，热转化率也很高。因此，它最有希望成为未来人类的清洁能源。相对于日益完善的氢能利用下游体系，氢气却没有在以可再生资源为原料生产方面实现突破。目前，氢气主要来源还是化石燃料的重整转化(占96%)和电解水制氢(占4%)，这显然未能摆脱原有的化石能源体系。因此，如何可持续地从自然界获取氢气尤其受到人们的关注。生物制氢是解决这一问题的重要途径之一。现代生物制氢的研究始于20世纪70年代的能源危机，到90年代随着对温室效应的进一步认识，生物制氢作为可持续发展的工业技术再次引起人们的重视。生物制氢包括光驱动制氢和厌氧发酵制氢两种路径。与光合生物制氢相比，厌氧发酵制氢具有产氢率高、产氢速率快、产氢持续稳定、反应装置的设计操作简单、原料来源广泛且成本低等特点，更易于实现规模化生产，因而成为生物制氢研究的主要方向。厌氧发酵制氢菌种包括专性厌氧菌和兼性厌氧菌，其中，专性厌氧菌的培养、运输及工业化条件苛刻，而兼性厌氧菌具有广泛的适应性，是生物制氢工业化更理想的细菌。目前，兼性厌氧菌种类比较单一，缺乏新型菌种，产氢效率偏低，并且制氢条件待进一步优化。通过专利检索，目前已有专利主要是对发酵底物和发酵装置的研究，如植物秸秆生物制氢发酵液的制备方法(01140458.2沈建权等)，一种污泥与有机垃圾混合生物制氢的方法(申请号200710032658·0周少奇等)，生物发酵制氢装置(申请号00231651·X沈建权)和高效发酵法生物制氢膨胀床设备(申请号=03260012.7任南琪等)等，而对于发酵菌种特别是高效产氢菌种的筛选研究相对薄弱，仅有一种生物制氢方法及其专用菌(申请号200910088408.8邢新会等)，但该方法所用菌种是通过基因导入后的重组菌，操作较复杂，且发酵条件要求严格厌氧，不易推广。所以，对于兼性厌氧新型菌种的筛选以及制氢工艺条件的探索优化迫在眉睫。
发明内容为了解决现有技术存在的生物制氢法操作复杂，发酵条件要求严格的问题，本发明主要包括一种利用兼性厌氧菌制氢的方法，该方法是在非严格厌氧条件下，，使用产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)CICC10293，以葡萄糖为发酵底物，采用分批发酵的方式，20小时即可高效完成制氢过程。本发明的技术方案是本发明所选用的兼性厌氧菌具体为肠杆菌禾斗(Enterobacteriaceae)肠杆菌属(Enterobacter)的产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)CICC10293，该菌属原养型兼性厌氧革兰氏阴性菌，购自中国工业微生物菌种保藏中心(ChinaCenterofIndustrialCultureCollection，CICC)。—种利用兼性厌氧菌发酵制氢的方法，使用兼性厌氧菌为肠杆菌禾斗(Enterobacteriaceae)肠杆菌属(Enterobacter)的产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)CICC10293,以蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、水的混合液为培养基，以葡萄糖为发酵底物，在发酵初期，最好能够保证处于厌氧或是近厌氧环境，采用分批发酵的方法，制备得到氢气，其中，所述的培养基中蛋白胨的浓度为46g/L，牛肉膏为24g/L，NaCl为46g/L，在产生气体后的发酵中就不需要保证处于厌氧或是近厌氧环境了，此时对环境中的氧气浓度没有什么要求。具体方法为无菌操作下，配制培养基并灭菌，将产气肠杆菌的高浓缩菌液以2%5%体积比例接种于培养基，所述的高浓缩菌液的菌液浓度为Sxio9NSxio11ceIl/mL,在温度为2050°C、维持pH在58，170r/min的摇床振荡培养2448h后，将得到的培养好的菌液转移到已灭菌的浓度为560g/L葡萄糖发酵底物中，封闭后继续在温度2050°C、转速170r/min摇床振荡培养，并连接氢气收集装置收集氢气。更优选的方法是在无菌操作下，按照560g/L比例向培养基中添加葡萄糖发酵底物，灭菌后得到培养发酵基，将产气肠杆菌的高浓缩菌液以2%5%体积比例接种至培养发酵基，封闭后于温度为2050°C、pH在58的范围内，170r/min的摇床振荡培养，并连氢气接收集装置氢气。在培养基中添加K2HPO411.5g/L,FeSO4·4Η200·10.2g/L产氢效果会更好。反应中控制反应过程pH在67产氢特性更佳。产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)CICC10293为兼性厌氧菌，对培养环境氧气要求不严格。影响厌氧发酵产氢的主要因素是菌种接种方式、培养基配置、发酵底物浓度，PH和温度等。本发明经过对多种发酵条件组合配置试验，对比分析发现以下最佳工艺条件可以达到产氢效率的最优化培养基配制具体为蛋白胨5g/L，牛肉膏3g/L，NaCl5g/L，K2HPO4L5g/L，FeSO4·4H200.2g/L；葡萄糖为发酵底物，浓度为20g/L；发酵pH为6.07.0;采用最基本的分批发酵方式，在40°C条件下进行恒温振荡培养，振荡频率为170r/min，培养时间约为20h，至气体产生停止。经试验，产氢量可达到134mLH2/100mL液体培养基，产氢效率高，对发酵条件要求低，具有广阔的应用前景。有益效果首先，在现有的各种产气菌种中挑选出一种效果最好的发酵制氢菌种，此菌种为兼性厌氧菌，具有生长迅速，产氢效率高，对厌氧条件要求低等优点；其次，只在发酵初期要求在厌氧或是近厌氧环境，产生气体后，对环境的要求就没有那么严格了，非厌氧条件下就一样可以正常发酵；再次，详尽地优化了该菌种的最佳发酵工艺条件，达到发酵底物的利用率和产氢效率最大化，确定发酵底物为浓度是20g/L的葡萄糖，培养基配制为蛋白胨5g/L，牛肉膏3g/L，NaCl5g/L，K2HPO4L5g/L，FeS04·4Η200.2g/L，在pH为6.07.0，温度为40°C条件下采用分批发酵的方式进行恒温振荡培养，振荡频率为170r/min，培养时间约为20h，产氢量可达到134mLH2/100mL液体培养基。图1为本发明所用实验装置简图。其中，1为液体取样口，2为反应瓶，3为气体纯化瓶，4为气体取样口，5为气体收集装置，6为水准瓶。图2为产氢量随时间变化图。图3为不同发酵底物浓度产氢量图。图4为不同温度下产氢量图。图5为不同pH值下产氢量随时间变化图。具体实施例方式高浓缩菌液的制备将菌株产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)CICC10293接种到牛肉膏蛋白胨培养液里，每升培养液含有蛋白胨46g、牛肉膏24g、氯化钠46g，蒸馏水IOOOmL,并控制pH为68，于30°C下培养2448h，得到高浓缩菌液，菌液浓度为5XIO9SXio11CelVmL本发明所用实验装置简图如图1所示，其中，1为液体取样口，2为反应瓶，3为气体纯化瓶，4为气体取样口，5为气体收集装置，6为水准瓶。反应瓶2中盛有培养基和作为底物的葡萄糖。气体纯化瓶3中盛有饱和氢氧化钠溶液，气体收集装置用来收集气体。实施例1菌种接种方式的选择确定培养基组分为蛋白胨5g/L，牛肉膏3g/L，NaCl5g/L，调节初始pH=7.0,以此作为基础培养基；所有灭菌均为115°C高温灭菌25min；(1)方案一配制基础培养基并灭菌，将Enterobacteraerogenes高浓缩菌液以2%5%体积比例接种于基础培养基(无菌操作)，在温度为30°C、170r/min的摇床振荡培养2448h后，将得到的培养好的菌液转移到已灭菌的浓度为20g/L葡萄糖发酵底物中，发酵液总量为450mL，封闭后继续在温度40°C、转速170r/min摇床振荡培养，并连接氢气收集装置。(2)方案二按照20g/L比例向基础培养基添加葡萄糖作为发酵底物，灭菌后得到培养发酵基，将Enterobacteraerogenes高浓缩菌液以2%5%体积比例直接接种至培养发酵基(无菌操作)，发酵液总量为450mL，封闭后于温度为40°C、170r/min的摇床振荡培养并连氢气接收集装置。发酵初期，均以氮气吹洗发酵产氢装置35min，保证装置处于厌氧或者近厌氧状态。在培养过程中，收集气体并实时记录气体产量，定时取发酵液样测定PH和葡萄糖分解率等指标；氢气含量测量采用气相色谱仪TCD热导器检测；pH测定采用pH酸度计；葡萄糖分解率采用菲林比色法测定。实验结果表明方案一产气总持续时间约6小时，产气速度快，pH迅速降低，产氢量212mL，氢气比率20%，葡萄糖分解率为71%；方案二产气总持续时间约20小时，初始为菌种的繁殖阶段，产气速率低，在616小时产气速率最高，pH值缓慢降低，产氢量494mL，氢气比率34.5%，葡萄糖分解率为83.05%。对比发现，方案二具有较高的产氢效率优势，适合于发酵过程中应用。实施例2最佳发酵基组分配置的确定依据实施例1的结果，在应用方案二基础上，进一步对发酵条件进行优化，探索最佳的发酵培养基组分配置，进行下面的试验分别配制3种发酵培养基，编号为13，其组成分别见下表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>调节发酵培养基初始pH=7.0，于115°C高温灭菌25min，将Enterobacteraerogenes高浓缩菌液以2%5%体积比例接种(无菌操作)，发酵液总量为450mL，发酵条件均相同。在培养开始之前，均以氮气吹洗35min至厌氧或近厌氧环境后置于温度为40°C,170r/min的摇床振荡培养并连接氢气收集装置，持续时间为20小时。发酵过程中收集气体，并实时记录气体产量；氢气含量测量采用气相色谱仪TCD热导器检测；pH测定采用PH酸度计；葡萄糖分解率采用菲林比色法测定，产氢量随时间变化见附图2。通过实验发现，编号1、2、3培养基氢气产量分别为229mL、337mL、494mL。葡萄样分解率为55.3%、76%、83.05%。实验表明，一定量缓冲溶液K2HPO4，可明显降低pH值下降的速度和幅度，使酸度维持在适合产气肠杆菌生长活性的范围中，利于产氢过程的发生；同时如文献中所述添加适当浓度的Fe2+促进了产氢酶的产生，促进产氢；与编号1相比较，编号3的发酵培养基组分配置可提高氢气产量50%以上。实施例3最佳发酵底物浓度的确定依据实施例1和2的结果，通过改变发酵底物初始浓度，探索提高产氢效率的可能。配制基础培养基，组成为蛋白胨5g/L，牛肉膏3g/L，NaCl5g/L，K2HPO4L5g/L，FeSO4·4H200.2g/L，设置4组平行实验，分别设定初始底物葡萄糖浓度为5、10、20、30、40和60g/L，总发酵液量为450mL，其他发酵条件均相同。在培养开始之前，均以氮气吹洗35min至厌氧或近厌氧环境，置于温度为40°C，170r/min的摇床振荡培养并连接氢气收集装置，持续时间为20小时。发酵过程中收集气体，并实时记录气体产量；氢气含量测量采用气相色谱仪TCD热导器检测；pH测定采用pH酸度计；葡萄糖分解率采用菲林比色法测定，不同发酵底物浓度产氢量见附图3。通过试验发现，不同浓度底物产氢量分别为234mL、329mL、494mL、466mL、414mL、322mL，当底物浓度为20g/L时，产氢量最高。底物浓度较低时，可被利用葡萄糖量较少，底物浓度过高，产氢量程迅速降低趋势，这是因为底物浓度会造成发酵方式或者气体动力扩散的改变。实施例4最佳发酵温度的确定依据实施例1、2和3的结果，按照最佳培养基组分配置配制，在发酵底物浓度条件下，调节初始PH为7.0，总发酵液量为450mL，设置5组平行试验，分别设置环境温度20、30、35、40、50°C，在170r/min的摇床振荡培养并连接氢气收集装置，持续时间为20小时。在培养开始之前，均以氮气吹洗35min至厌氧或近厌氧环境。发酵过程中收集气体，并实时记录气体产量；氢气含量测量采用气相色谱仪TCD热导器检测；pH测定采用pH酸度计；葡萄糖分解率采用菲林比色法测定，不同温度下产氢量见附图4。实验表明，40°C条件下产氢效率最高，达到494mL，温度过高或者过低都会因影响菌的活性而导致产氢能力降低。实施例5最佳发酵pH确定(1)依据实施例1和2的结果，为探索最佳发酵pH条件，进行以下试验发酵培养基组分为实施例2中编号3的培养基组分配置，设置4组平行实验，通过添加适量NaOH和HCl分别调节初始pH为5、6、7和8，发酵液总量为450mL其他发酵条件均相同。在培养开始之前，均以氮气吹洗35min至厌氧或近厌氧环境置于温度为40°C，170r/min的摇床振荡培养并连接氢气收集装置，时间为20小时。发酵过程中收集气体，并实时记录气体产量；氢气含量测量采用气相色谱仪TCD热导器检测；pH测定采用pH酸度计；葡萄糖分解率采用菲林比色法测定，产氢量随时间变化见附图5。通过实验发现，发现初始pH为6、7时，产氢量分别为428mL、494mL，具有较高的产氢效率。(2)在上述试验基础上，进一步进行下面试验发酵培养基组分为实施例2中编号3的培养基组分配置，设置2组对比试验，均调节初始PH值为7.0，发酵液总量为450mL发酵条件均相同。在培养开始之前，均以氮气吹洗35min至厌氧或近厌氧环境置于温度为40°C，170r/min的摇床振荡培养并连接氢气收集装置，时间为20小时。其中一组将设计通过pH酸度计实时测定发酵液pH值，并通过添加酸碱调节PH约保持67范围之内，另一组不做处理，作为对照；发酵过程中收集气体，并实时记录气体产量；氢气含量测量采用气相色谱仪TCD热导器检测；pH测定采用pH酸度计；葡萄糖分解率采用菲林比色法测定，产氢量随时间变化见附图5。通过实验发现，保持发酵液酸度在67范围产氢量达600mL，葡萄糖分解率为97%，利于发酵产氢的持续和高效进行，而对照组pH降低迅速，pH值的降低影响菌的活性而导致产氢能力降低。综上所述，产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)CICC10293作为兼性厌氧产氢菌种，可用于发酵底物为葡萄糖的发酵制氢过程中，通过试验发现，其最佳的发酵工艺条件是①最佳菌种接种时机未基础培养基与发酵底物共存时；②最佳培养基配制为蛋白胨5g/L，牛肉膏3g/L，NaCl5g/L，K2HPO4L5g/L，FeS04·4H200.2g/L③最佳发酵底物葡萄糖的浓度为20g/L④最佳发酵温度为40°C；⑤最佳发酵初始pH为7，且维持发酵发酵pH的平衡利于产氢的发生。权利要求一种利用兼性厌氧菌发酵制氢的方法，其特征在于，使用兼性厌氧菌为肠杆菌科(Enterobacteriaceae)肠杆菌属(Enterobacter)的产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)CICC10293，以蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、水的混合液为培养基，以葡萄糖为发酵底物，采用分批发酵的方法，制备得到氢气，其中，所述的培养基中蛋白胨的浓度为4～6g/L，牛肉膏为2～4g/L，NaCl为4～6g/L。2.根据权利要求1所述利用兼性厌氧菌发酵制氢的方法，其特征在于，具体方法为无菌操作下，配制培养基并灭菌，将产气肠杆菌的高浓缩菌液以2%5%体积比例接种于培养基，所述的高浓缩菌液的菌液浓度为5X109SxiO11ceIVmL,在温度为2050°C、维持PH在58，170r/min的摇床振荡培养2448h后，将得到的培养好的菌液转移到已灭菌的浓度为560g/L葡萄糖发酵底物中，封闭后继续在温度2050°C、转速170r/min摇床振荡培养，并连接氢气收集装置收集氢气。3.根据权利要求2所述利用兼性厌氧菌发酵制氢的方法，其特征在于，无菌操作下，按照560g/L比例向培养基中添加葡萄糖发酵底物，灭菌后得到培养发酵基，将产气肠杆菌的高浓缩菌液以2%5%体积比例接种至培养发酵基，封闭后于温度为2050°C、pH在58的范围内，170r/min的摇床振荡培养，并连氢气接收集装置氢气。4.根据权利要求13任一所述利用兼性厌氧菌发酵制氢的方法，其特征在于，在培养基中添加K2HPO4I1.5g/L,FeSO4·4Η200·10.2g/L。5.根据权利要求4所述利用兼性厌氧菌发酵制氢的方法，其特征在于，pH在67。6.根据权利要求5所述利用兼性厌氧菌发酵制氢的方法，其特征在于，所述的发酵培养基中各成分的浓度为蛋白胨5g/L，牛肉膏3g/L，NaCl5g/L,K2HPO41.5g/L，FeSO4·4H200.2g/L；葡萄糖底物浓度为20g/L；在pH为6.O7.O、温度为40°C条件下采用分批发酵的方式进行恒温振荡培养，振荡频率为170r/min，培养时间20h。全文摘要本发明提供了一种利用兼性厌氧菌发酵制氢的方法，具体涉及到菌种筛选和发酵条件优化两个方面。筛选出兼性厌氧菌为产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)CICC10293；经过试验得到，该菌种最佳发酵工艺条件是培养基配制具体为蛋白胨4～6g/L，牛肉膏2～4g/L，NaCl4～6g/L，K2HPO41～1.5g/L，FeSO4·4H2O0.1～0.2g/L；发酵底物为葡萄糖，浓度为20g/L；发酵采用分批发酵的方式；在pH为6.0～7.0，温度为40℃条件下进行恒温振荡培养，振荡频率为170r/min；培养时间约为20h，至氢气产生停止。产氢量可达到134mLH2/100mL液体培养基，产氢效率高，对发酵环境条件要求低，具有广阔的应用前景。文档编号C12R1/01GK101824437SQ201019026129公开日2010年9月8日申请日期2010年3月2日优先权日2010年3月2日发明者王瑞兴,袁晓明,钱春香申请人:东南大学