专利名称：具有抑制平滑肌细胞增生活性的肝素片段及其制备方法
技术领域：
本发明涉及具有抑制平滑肌细胞增生活性的肝素片段及其制备方法。
背景技术：
肝素是糖胺聚糖家族中一种高度硫酸化的重要成员。它在肥大细胞中合成后，被 运输到各种组织器官中，因此其在生物体内广泛存在。生物体内肝素单链的分子量高达 60，000-100，OOODa，许多条肝素链又通过肽段连接，形成巨大蛋白聚糖分子。商用肝素分 子量是由上述的糖胺聚糖降解而来的，巨型糖链在生产过程中多处被打断，形成了分子量 范围大约在5000-25000Da之间产品。由此可以看出，肝素是由不同长度的混合链组成，链 与链之间则又有差异，导致了肝素组分的高度异质性。根据对肝素链的组成和寡糖序列分 析，现在已经基本清楚肝素的总体结构和组成。链中主要以糖醛酸残基(L-iduronic acid, IdoA ；D-glucuronic acid, GlcA)和六糖胺(D-glucoamine)形式交替出现。肝素最早的临床用途是作为抗凝和抗血栓出现的。后来研究表明它还有抗平滑肌 细胞增生、抗炎症、抗肿瘤调节人体免疫功能等生物活性。同时它可以治疗和预防因外伤、 哮喘、动脉粥样硬化、高血压、充血性心力衰竭、肺出血、肾炎综合症、急性肾小球肾炎、小儿 先天性心脏病等引起的平滑肌增生，预防血管狭窄，避免或减少小儿和成人肺动脉高压症， 预防和治疗冠心病和心肌梗塞患者经冠状动脉“搭桥术” “球囊扩充术” “安装支架术”和脑 栓塞患者经“颅内血管分流术”平滑肌增生引起的心，脑血管再狭窄症(restenosis)。因此 肝素具有多种药用的潜力。但是，肝素作为一种高度硫酸化的多糖，在使用过程中会引起明 显的出血症状，这一主要的副作用限制了肝素的临床应用。解决这一问题的途径在于分别明确肝素中起抗凝活性的寡糖片段的结构和其它 生物学活性的片段结构。到目前为止，肝素的抗凝活性寡糖片段是唯一被阐明的结构。它是一个含有 3-0-硫酸基团五糖片段。肝素五糖与抗凝血酶的作用包括两个步骤首先，五糖序列中非还原端三糖序列 与ATIII形成一个低亲和性的识别复合物，诱导ATIII构象变化导致高亲和性复合物的形 成。三糖序列能够完全激活ATIII，还原端的二糖序列对激活过程并不重要，但是它能稳定 激活后的构象。除此而外，肝素的结构中其它生物学功能的结构域尚不清楚。SPR传感技术是基于一种名为表面等离子体谐振(Surface Plasmon Resonance, SPR)的物理光学现象发展起来的一种传感技术。其基本原理是利用附着于特制金属薄膜 表面的物质分子(或亲和结合分子复合物)质量的改变会引起附近局部折射率的变化，将 这种变化转化成电信号输出，从而实时检测金属膜表面分子相互作用的情况。操作程序包 括以下几个步骤将特异的生物分子(受体)通过化学或物理方法固定于金膜表面，制成检 测芯片；通入缓冲液到芯片表面，清洗获得平衡基线；然后通入待检测样品(即含配体的溶 液)，检测配体和受体的结合反应；再通入缓冲液，检测反应形成的复合物的解离；最后通入再生液彻底洗脱掉待检样品，使得芯片得以再生。该技术的优点在于样品的免标记、无 损伤检测，实时检测和待检测分子的可回收性。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种制备具有抑制平滑肌细胞增生活性的肝素片段的 方法。本发明所提供的制备具有抑制平滑肌细胞增生活性的肝素片段的方法，包括如下 步骤(1)用肝素酶酶解肝素，得到肝素酶解产物；(2)用SPR传感技术从所述肝素酶解产物中分离得到具有抑制平滑肌细胞增生活 性的肝素片段。上述过程中，所述用sra传感技术从所述肝素酶解产物中分离得到具有抑制平滑 肌细胞增生活性的肝素片段的方法包括如下步骤1)在芯片上固定连接刺激平滑肌细胞增生的碱性成纤维细胞生长因子，得到连接 有刺激平滑肌细胞增生的碱性成纤维细胞生长因子的芯片；2)使所述肝素酶解产物与步骤1)得到的芯片相互作用，所述肝素酶解产物中的 一部分与所述芯片上的碱性成纤维细胞生长因子特异结合，其余部分未与所述芯片上的碱 性成纤维细胞生长因子结合，去掉未与所述芯片上的碱性成纤维细胞生长因子结合的部 分，得到连接有与碱性成纤维细胞生长因子特异结合的肝素酶解产物的芯片；3)将所述与碱性成纤维细胞生长因子特异结合的肝素酶解产物从步骤2)得到的 芯片上洗脱下来，即得到具有抑制平滑肌细胞增生活性的肝素片段。上述过程中，所述刺激平滑肌细胞增生的碱性成纤维细胞生长因子为人脑源碱性 成纤维细胞生长因子。上述过程中，所述步骤3)中，所述洗脱中，所用的洗脱液为浓度为2M的氯化钠水 溶液或浓度为2M的碳酸氢铵水溶液。上述过程中，所述芯片为表面连接有葡聚糖的CM5芯片。上述过程中，所述用肝素酶酶解肝素的方法包括如下步骤所述方法中，在所述步 骤(1)后，步骤(2)前，包括将所述肝素酶解产物进行如下纯化的步骤将所述肝素酶解产 物用超滤膜进行超滤，取截留分子量在1000Da-8000Da之间的肝素酶解产物。上述过程中，所述酶解的方法包括如下步骤将所述肝素与所述肝素酶混合，在 25°C、振荡的条件下反应；所述振荡的转速为100-200转每分钟，具体为150转每分钟；所 述肝素与所述肝素酶的投料比为IOg肝素1U肝素酶。上述过程中，所述步骤1)中，所述在芯片上固定连接刺激平滑肌细胞增生的碱性 成纤维细胞生长因子的方法包括如下步骤用所述刺激平滑肌细胞增生的碱性成纤维细胞 生长因子的溶液与所述芯片相互作用；所述刺激平滑肌细胞增生的碱性成纤维细胞生长因 子溶液的浓度为10微克/毫升；所述步骤2)中，所述使所述肝素酶解产物与步骤1)得到的芯片相互作用的方法 是使所述肝素酶解产物的溶液与步骤1)得到的芯片相互作用；所述肝素酶解产物溶液中 肝素酶解产物的浓度为lmg/ml。
上述过程中，所述方法中，在所述步骤1)前，包括将所述芯片表面的葡聚糖活化 的步骤。上述过程中，所述肝素酶是发酵鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp. HC-6155) CGMCC NO. 0660 得到的。上述过程中，所述肝素酶是按照包括如下步骤的方法制备得到的1)将所述发酵鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp. HC-6155) CGMCC NO. 0660 接种 于发酵培养基中，30°C培养40小时，离心收获菌体；所述发酵培养基组成由NaCl、K2HP04、MgS04、肝素、大豆粉和水组成，NaCl在培养基 中的浓度为1克/L，K2HPO4在培养基中的浓度为2. 5克/L，MgSO4在培养基中的浓度为0. 5 克/L，肝素在培养基中的浓度为2克/L，大豆粉在培养基中的浓度为2克/L。2)用渗透压稳定液悬浮所述菌体，12，OOOr/min离心20分钟，去掉上清液；再用低 盐溶液悬浮所述菌体，12，000r/min离心20分钟，收集上清液，记作上清液I ；最后用高盐溶 液再次悬浮所述菌体，12，000r/min离心20分钟，再次收集上清液，记作上清液II ；合并所 述上清液I和所述上清液II，得到肝素酶粗酶液；低盐溶液是将2mmol MgSO4溶解于IL 20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中得 到的；高盐溶液是将300mmol NaCl溶解于IL的IOmM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液 中得到的；渗透压稳定液是20% (质量百分含量)蔗糖的水溶液。3)将所述肝素酶粗酶液依次用SP Sepharose XL强阳离子交换凝胶和SOURCE 30S强阳离子交换凝胶进行纯化；用SP Sepharose XL强阳离子交换凝胶进行纯化的方法中，包括如下洗脱步骤 以NaCl浓度为0. 12M的磷酸盐缓冲液作为起始液，以NaCl浓度为0. 18M的磷酸盐缓冲液 作为终止液，进行线性梯度洗脱，洗脱时间为120分钟，所述洗脱过程中NaCl浓度梯度变化 速率恒定，每次收集2ml洗脱液，收集NaCl浓度为0. 16M的磷酸盐缓冲液所洗脱下来的溶 液；用SOURCE 30S强阳离子交换凝胶进行纯化的方法中，包括如下洗脱步骤以 NaCl浓度为0. 05M的磷酸盐缓冲液作为起始液、以NaCl浓度为0. 15M的磷酸盐缓冲液作为 终止液，进行线性梯度洗脱，洗脱时间为120分钟，所述洗脱过程中NaCl浓度梯度变化速率 恒定，每次收集2ml洗脱液，收集NaCl浓度为0. IM的磷酸盐缓冲液所洗脱下来的溶液；由上述任一所述方法得到的具有抑制平滑肌细胞增生活性的肝素片段也属于本 发明的保护范围。本发明方法基于表面等离子体谐振波谱技术检测分子间亲和作用的原理，从高生 理活性和低副作用的寡糖混合物中筛选功能专一性寡糖片段。该方法具有实时，非标记和 灵敏的特点，可以真实的筛选出具有生理功能的寡糖。本发明方法制备得到的肝素片段具 有抑制平滑肌细胞增生的功能，在浓度较低时，其对平滑肌细胞的抑制率均高于肝素；而且 与肝素比，本发明得到的肝素片段具有很低的抗凝活性，只有原始肝素的1. 9%。因此，本发 明方法及制备得到的肝素片段可用于临床，克服了肝素在使用过程中会引起明显的出血症 状的缺陷，使肝素抗平滑肌细胞增生性能的实际应用成为可能。因此，本发明方法及产品具有广阔的应用前景。
图1为肝素酶解产物图谱。图2为肝素酶解产物的抗胎儿脐动脉平滑肌细胞增生活性分析。图3为肝素酶解产物的抗肿瘤活性分析。图4为碱性成纤维细胞生长因子的饱和藕联。图5为肝素酶解产物与芯片表面因子相互作用。图6为芯片三通道同时结合肝素酶解产物过程示意图。图7为回收的肝素片段的高效液相色谱分析。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、具有抑制平滑肌细胞增殖活性的肝素片段及其制备一、制备具有抑制平滑肌细胞增生活性的肝素片段(一 )肝素酶酶解肝素截留分子量为8，000和1，000的超滤膜均购自美国Pall公司。肝素购自Sigma公司，产品目录号为H3393;此肝素产品不含肽段，全部是多糖。1、本实验中所用的肝素酶按照如下方法制备鞘氨醇杆菌(Sphingobacteriumsp. HC-6155) CGMCC No. 0660 (专利申请号 02148066. 4)。菌发酵斜面保存的肝素酶产生菌株鞘氨醇杆菌经活化后，接种于液体发酵培养 基中，30°C培养40小时后，5500r/min离心收获菌体。液体发酵培养基组成由NaCl、K2HP04、MgSO4、肝素、大豆粉和水组成，NaCl在培养 基中的浓度为1克/L，K2HPO4在培养基中的浓度为2. 5克/L，MgSO4在培养基中的浓度为 0. 5克/L，肝素在培养基中的浓度为2克/L，大豆粉在培养基中的浓度为2克/L。NaCl购自北京现代东方精细化学品有限公司，K2HPO4购自国药集团化学试剂有限 公司，MgSO4购自广东汕头市西陇化工厂，肝素购自Sigma公司，大豆粉购自北京双旋微生物 培养基制品厂。低盐溶液将2mmol MgSO4溶解于lL20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中得到 的，PH7.4 ；高盐溶液将300mmol NaCl溶解于IL的IOmM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中 得到的，PH7.4。用渗透休克的方法，即用渗透压稳定液(20%蔗糖水溶液)、低盐溶液和高盐溶液 依次处理细胞，以释放细胞周质中的肝素酶。具体做法如下首先用渗透压稳定液悬浮细 胞，12，000r/min离心20分钟，去掉上清液；再用低盐溶液悬浮细胞，12，000r/min离心20 分钟，收集上清液；最后用高盐溶液再次悬浮细胞，12，000r/min离心20分钟，再次收集上清液。
将上述低盐处理获得的上清液和高盐处理获得的上清液合并作为肝素酶粗酶液， 透析后依次用SP Sepharose XL强阳离子交换凝胶和SOURCE 30S强阳离子交换凝胶进 行纯化。上柱前皆用20mM pH7. 4的磷酸盐缓冲液进行平衡。在SP-S印harose (Amersham Biosciences产品)中，加入2ml粗酶液，然后在0-120分钟的时间范围内，用含有
0.12-0. 18M NaCl的磷酸盐缓冲液进行线性梯度洗脱(即以NaCl浓度为0. 12M的磷酸盐缓 冲液作为起始液，以NaCl浓度为0. 18M的磷酸盐缓冲液作为终止液，进行线性梯度洗脱)， NaCl浓度梯度变化速率恒定，每次收集2ml洗脱液，收集在0. 16M NaCl梯度附近的酶活力 峰，对洗脱下来的液体进行透析和浓缩，作为Source_30S (Amersham Biosciences产品)层 析的起始样品；Source_30S (Amersham Biosciences产品)中，加入2ml起始样品，然后在 0-120分钟的时间范围内，用含有0. 05-0. 15M NaCl的磷酸盐缓冲液进行线性梯度洗脱(即 以NaCl浓度为0. 05M的磷酸盐缓冲液作为起始液，以NaCl浓度为0. 15M的磷酸盐缓冲液 作为终止液，进行线性梯度洗脱)，NaCl浓度梯度变化速率恒定，每次收集2ml洗脱液，收集 在0. IM NaCl梯度附近的酶活力峰，脱盐和浓缩，得到肝素酶粉末。酶活定义每分钟生成1 μ mol不饱和糖醛酸所需酶量；将肝素酶粉末溶解于20mM pH7. 4的磷酸盐缓冲液中，得到酶液。将2g肝素溶于100ml 20mM pH7. 4的磷酸盐缓冲液中，得到肝素底物溶液，肝素在 肝素底物溶液中的浓度为20mg/ml。酶活检测将0. Iml酶液和0. Iml肝素底物溶液混合，36 °C反应10分钟后，用
1.8ml 50mM的盐酸终反应，测定A232nm。对照管将0. Iml酶液和0. Iml肝素底物溶液混合，再加入1. 8ml 50mM的盐酸， 36°C反应10分钟后，测定A232nm。结果，肝素酶粉末的酶比活为0. 5U/mg。2、用上述肝素酶酶解肝素肝素底物溶液的组成将IOg肝素溶于100ml 20mM pH7. 4的磷酸盐缓冲液中，得 到肝素底物溶液。酶解方法将100ml肝素底物溶液和20mg肝素酶(肝素与肝素酶的投料比为 IOg IU肝素酶)，放置于密封容器中，25°C水浴温和振荡(转速为150转每分钟)；间隔 12小时取样测定酶解产物在波长下的吸光度值A232nm的变化，直至酶解产物的吸光值不 再变化(最后的吸光值为3. 0)。将酶解产物用截留分子量为8，OOODa的超滤膜超滤，取滤出液；将滤出液用 截留分子量为1，OOODa的超滤膜超滤，取被截留部分；得到酶解产物中分子量范围在 IOOODa-SOOODa之间的组分，即为肝素酶解产物，将肝素酶解产物冷冻干燥，备用。将肝素和酶解产物分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，所用凝胶浓度为20%，电泳结 束后，用0. 08%的天青A染色直到有清晰条带出现，立即用蒸馏水冲洗除去多余染液，结果 如图1所示。图1中，第1和第4泳道是肝素的分子分布；第3泳道是酶法制备的肝素酶解 产物的分子分布。实验设3次重复，结果一致。(二)用SPR传感技术分离具有抑制平滑肌细胞增殖活性的肝素片段1、在芯片上固定连接碱性成纤维细胞生长因子
人脑源碱性成纤维细胞生长因子Q^parin binding growth factor-2， basicbrain-derived growth factor, 17KDa))购自 Invitrogen 公司，产品目录号为 PHG0024 ；SPR传感芯片采用CM5芯片。(1) CM5芯片的活化依次注射35 μ L浓度分别为0. 05mol/L和0. 2mol/L的N-羟 基硫代琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)到芯片表面，流 速为5μ L/min，使CM5芯片表面的葡聚糖活化，得到表面为活化的葡聚糖分子的CM5芯片。 CM5芯片的3条通道均被活化处理，分别记作通道1、通道2、通道3，通道4不活化作为对照。(2)饱和固定人脑源碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)人脑源碱性成纤维细胞生长因子溶液的浓度为10微克/毫升；设置仪器的流速为10微升每分钟，通入HBS缓冲液(pH 7. 4) (PharmaciaBiosensor AB公司)(溶液成分如下:10mmol/L 4—2(2—羟基)哌嗪-1-乙基 磺酸、150mmol/L NaCl,3. 4mmol/L EDTA.O. 005% (V/V)表面活性剂P20)到芯片表面，清洗 获得平衡基线；注射5微升bFGF溶液于涂有葡聚糖芯片的表面；反复进样，直到响应值不 再上升，封闭，通道4作为对照通道。如此碱性成纤维细胞生长因子和芯片表面已经活化 的葡聚糖分子发生化学藕联，获得饱和偶联bFGF的芯片，1，2，3通道的响应值分别达到约 5000RU (图4)。(该响应值为起点和终点之差)。2、肝素酶解产物和人脑源碱性成纤维细胞生长因子结合(1)肝素酶解产物与细胞生长因子的结合能力检测设定流速恒定为50 μ l/min, 将样品分别配制成系列浓度梯度，肝素酶解产物为0，3. 9,7. 8，31. 3，62. 5，125，250nM。每次 进样后，芯片表面用 50 μ 1 2Μ NaCl 溶液(NaCl 溶解于 IOOmM sodium acetatebuffer (pH 4. 0)再生。结果，肝素片段在不同浓度条件下获得的和因子的结合和解离特征谱图如图5所 示。A图为酶法制备的肝素寡糖(即肝素酶解产物)；B图为化学法肝素寡糖(即肝素裂解 产物)。两种样品各自与因子结合能力常数如表1所示。ka为结合速度系数，kd为解离速 度系数，KD为解离常数。KD值越小，说明二者的结合能力越强。表1、各种相互作用的动力学分析*
权利要求
1.一种制备具有抑制平滑肌细胞增生活性的肝素片段的方法，包括如下步骤(1)用肝素酶酶解肝素，得到肝素酶解产物；(2)用SI^R传感技术从所述肝素酶解产物中分离得到具有抑制平滑肌细胞增生活性的 肝素片段。
2.根据权利要求ι所述的方法，其特征在于所述用sra传感技术从所述肝素酶解产 物中分离得到具有抑制平滑肌细胞增生活性的肝素片段的方法包括如下步骤1)在芯片上固定连接刺激平滑肌细胞增生的碱性成纤维细胞生长因子，得到连接有刺 激平滑肌细胞增生的碱性成纤维细胞生长因子的芯片；2)使所述肝素酶解产物与步骤1)得到的芯片相互作用，所述肝素酶解产物中的一部 分与所述芯片上的碱性成纤维细胞生长因子特异结合，其余部分未与所述芯片上的碱性成 纤维细胞生长因子结合，去掉未与所述芯片上的碱性成纤维细胞生长因子结合的部分，得 到连接有与碱性成纤维细胞生长因子特异结合的肝素酶解产物的芯片；3)将所述与碱性成纤维细胞生长因子特异结合的肝素酶解产物从步骤幻得到的芯片 上洗脱下来，即得到具有抑制平滑肌细胞增生活性的肝素片段。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述刺激平滑肌细胞增生的碱性成 纤维细胞生长因子为人脑源碱性成纤维细胞生长因子；所述步骤幻中，所述洗脱中，所用 的洗脱液为浓度为2M的氯化钠水溶液或浓度为2M的碳酸氢铵水溶液。
4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于所述芯片为表面连接有葡聚糖的 CM5芯片；所述方法中，在所述步骤1)前，包括将所述芯片表面的葡聚糖活化的步骤。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述步骤(1) 后，步骤( 前，包括将所述肝素酶解产物进行如下纯化的步骤将所述肝素酶解产物用超 滤膜进行超滤，取分子量在1000Da-8000Da之间的肝素酶解产物。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述酶解的方法包括如下步骤 将所述肝素与所述肝素酶混合，在25°C、振荡的条件下反应；所述振荡的转速为100-200转 每分钟，具体为150转每分钟；所述肝素与所述肝素酶的投料比为IOg肝素1U肝素酶。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述步骤1)中，所述在芯片上 固定连接刺激平滑肌细胞增生的碱性成纤维细胞生长因子的方法包括如下步骤用所述刺 激平滑肌细胞增生的碱性成纤维细胞生长因子的溶液与所述芯片相互作用；所述刺激平滑 肌细胞增生的碱性成纤维细胞生长因子溶液中刺激平滑肌细胞增生的碱性成纤维细胞生 长因子的浓度为10微克/毫升；所述步骤幻中，所述使所述肝素酶解产物与步骤1)得到的芯片相互作用的方法是使 所述肝素酶解产物的溶液与步骤1)得到的芯片相互作用；所述肝素酶解产物的溶液中肝 素酶解产物的浓度为lmg/ml。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述肝素酶是发酵鞘氨醇杆菌 (Sphingobacterium sp. HC-6155)CGMCC N0. 0660 得到的。
9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于所述肝素酶是按照包括如下步 骤的方法制备得到的1)将所述发酵鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp. HC-6155) CGMCC NO. 0660接种于发酵培养基中，30°C培养40小时，离心收获菌体；所述发酵培养基由NaCl、K2HPO4, MgSO4、肝素、大豆粉和水组成，NaCl在发酵培养基中 的浓度为1克/L，K2HPO4在发酵培养基中的浓度为2. 5克/L，MgSO4在发酵培养基中的浓度 为0. 5克/L，肝素在发酵培养基中的浓度为2克/L，大豆粉在发酵培养基中的浓度为2克 /L；2)用渗透压稳定液悬浮所述菌体，12，OOOr/min离心20分钟，去掉上清液；再用低盐溶 液悬浮所述菌体，12，000r/min离心20分钟，收集上清液，记作上清液I ；最后用高盐溶液再 次悬浮所述菌体，12，000r/min离心20分钟，再次收集上清液，记作上清液II ；合并所述上 清液I和所述上清液II，作为肝素酶粗酶液；低盐溶液是将2mmol MgSO4溶解于IL 20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中得到的； 所述低盐溶液的PH值是7. 4;高盐溶液是将300mmol NaCl溶解于IL的IOmM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中得 到的；所述高盐溶液的PH值是7. 4 ；渗透压稳定液是20% (质量百分含量)蔗糖的水溶液；3)将所述肝素酶粗酶液依次用SPSepharose XL强阳离子交换凝胶和SOURCE 30S 强阳离子交换凝胶进行纯化；用SP Sepharose XL强阳离子交换凝胶进行纯化的方法中，包括如下洗脱步骤以 NaCl浓度为0. 12M的磷酸盐缓冲液作为起始液，以NaCl浓度为0. 18M的磷酸盐缓冲液作为 终止液，进行线性梯度洗脱，洗脱时间为120分钟，所述洗脱过程中NaCl浓度梯度变化速率 恒定，每次收集2ml洗脱液，收集NaCl浓度为0. 16M的磷酸盐缓冲液所洗脱下来的溶液；用SOURCE 30S强阳离子交换凝胶进行纯化的方法中，包括如下洗脱步骤以NaCl浓 度为0. 05M的磷酸盐缓冲液作为起始液、以NaCl浓度为0. 15M的磷酸盐缓冲液作为终止 液，进行线性梯度洗脱，洗脱时间为120分钟，所述洗脱过程中NaCl浓度梯度变化速率恒 定，每次收集2ml洗脱液，收集NaCl浓度为0. IM的磷酸盐缓冲液所洗脱下来的溶液。
10.由权利要求1-9中任一所述方法得到的具有抑制平滑肌细胞增生活性的肝素片段。
全文摘要
本发明公开了一种具有抑制平滑肌细胞增生活性的肝素片段及其制备方法。该方法包括如下步骤(1)用肝素酶酶解肝素，得到肝素酶解产物；(2)用SPR传感技术从所述肝素酶解产物中分离得到具有抑制平滑肌细胞增生活性的肝素片段。本发明方法制备得到的肝素片段具有抑制平滑肌细胞增生的功能，在浓度较低时，其对平滑肌细胞的抑制率均高于肝素；而且与肝素比，本发明得到的肝素片段具有很低的抗凝活性，只有原始肝素的1.9％。因此，本发明方法及制备得到的肝素片段可用于临床，克服了肝素在使用过程中会引起明显的出血症状的缺陷，使肝素抗平滑肌细胞增生性能的实际应用成为可能。因此，本发明方法及产品具有广阔的应用前景。
文档编号C12N9/24GK102146425SQ20101911407
公开日2011年8月10日 申请日期2010年2月8日 优先权日2010年2月8日
发明者樊崢, 程秀兰, 钞亚鹏, 钱世钧 申请人:中国科学院微生物研究所