专利名称：用于数字核酸扩增的集成流路芯片装置的制作方法
技术领域：
本实用新型属生命科学、医学、化学及工学等多个领域检测装置，涉及一种用于数 字核酸扩增的集成流路芯片装置。
背景技术：
现已证明，人类的许多疾病都与基因有着直接或间接的关系，而基因是具有遗传 效应的DNA(脱氧核糖核酸)分子片段。因此，核酸的检测和分析不仅在遗传性疾病、肿瘤和 传染病等医学领域应用广泛，而且在法医学鉴定、食品安全、考古学等领域的地位也越来越 重要。然而，尽管核酸研究已经取得了令人瞩目的成绩，但同时也面临着更多的挑战。首先， 生物体的生长、发育不是由单一基因所决定的，而是多个基因协同作用的结果，是一个非常 复杂的过程。研究基因多样性以及基因突变或改造等问题都亟需有核酸高通量快速检测手 段。其次，核酸的含量非常低，目前很难直接检测，而往往采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，简称PCR)技术在体外扩增DNA，直到目的DNA浓度足以被检测为止。聚合酶链式反应技术发明至今已经三十多年了，在这期间技术得到了不断的发 展，近年来出现的实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)技术实现了 PCR从定 性到定量的飞跃。所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利 用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对待测模板进行定量分析的方 法。然而，这种传统的定量PCR方法也有着其不可避免的缺点①荧光定量PCR的测定点在 PCR扩增的指数期，而不同模板、不同条件下，PCR扩增达到平衡所需要的循环数是不确定 的。②如果目的片段的起始浓度过低的话，往往难以扩增到可检测水平。③待测样品的扩 增效率有可能和标准样品的有差异。1999年，Vogelstein等发展了一种叫做数字PCR(Digital PCR)的方法，将待测 DNA模板稀释并载入多孔板，使平均每两个以上孔中只有一个模板分子，在优化的条件下进 行传统的热循环PCR反应之后，和分子信标杂交以检测特异性扩增产物，阳性孔产生荧光。 与传统的荧光定量PCR相比，数字PCR是通过直接计数阳性孔的数目来定量核酸的起始拷 贝数，能够做到真正意义上的绝对定量测定，因此称之为数字PCR。2006年Ottesen等研制 出可以对细菌多个基因进行精确定量的微流控数字PCR芯片，同年美国Fluidigm公司开发 出了商品化的数字阵列PCR芯片，用实时PCR仪进行核酸扩增和定量检测。这种数字PCR 芯片涉及到一种基于多层软光刻工艺制备的PDMS弹性微阀，在这种结构中，流体通路位于 下层PDMS层中，由许多并行的串联着的小室组成；气体通路位于上层PDMS中，由许多与流 体通道相互垂直的通道组成。这种阀在没有外力作用时处于开放状态，当给气体通路施加 压力(如气压或水压)时，位于上下层之间的PDMS薄膜向下扩展，阀处于关闭状态，使得下 层液流通路被阻隔成若干个独立的反应室。上述的数字PCR芯片在肿瘤的分子检测、非侵入性产前诊断、生物的遗传学分析 及与拷贝数变异相关的疾病等方面均有着广阔的应用前景。《Nature》和《Nature Method)) 杂志的编辑Blow博士撰文指出数字PCR是PCR技术的新前沿，可以进行单细胞甚至单分子研究，通过直接计数而实现绝对定量。但是，这种基于PDMS弹性微阀的数字PCR芯片的制 作涉及到多层结构的对准、封接，制备过程周期长而复杂，目前商品化的芯片及配套仪器都 非常昂贵。因此，从数字PCR芯片技术的大规模应用前景来看，目前的这种制备方法及应用 成本均是不利的。
发明内容本实用新型的目的是提供一种成本低廉、易于操作的用于数字核酸扩增的集成流 路芯片装置，它由真空系统、前管路、缓冲瓶、后管路、毛细管、吸盘、封接层和通道层组成， 通道层与封接层进行封接后组成了集成流路芯片组件，吸盘置于集成流路芯片组件上，通 道层刻有通道，并设有出样口和进样口，通道由蜿蜒的主通道及位于主通道两侧的若干侧 室组成，主通道的两个末端分别接出样口和进样口，所述的侧室的横截面可以为正方形、圆 形、梯形或多边形，前管路一端连接真空系统，另一端连接缓冲瓶，后管路一端与缓冲瓶相 连，另一端与毛细管相连，毛细管穿过吸盘与集成流路芯片组件连通。主通道及侧室的大小可以根据需要来决定，通道的宽度从1 μ m至1000 μ m不等， 优选的宽度范围为50到1000 μ m，最好的范围在50到500 μ m之间，比如50 μ m，100 μ m， 200 μ m，300 μ m，400 μ m，500 μ m ；通道9的深度范围在1 μ m至1000 μ m之间，优选的范围在 1 μ m至Ij 500 μ m之间，最好的范围在10 μ m到100 μ m之间，比如10 μ m，20 μ m, 30 μ m, 50 μ m, 75 μ m，100 μ m;侧室的体积为皮升(pi)到纳升(nl)级别。通道层的制作材料可选用聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、环氧树脂、聚四氟乙烯、聚苯 乙烯(PC)、玻璃、PDMS等。通道层的制作根据不同的材料可选用不同的方法，比如激光刻蚀、化学蚀刻、光 刻、热压、浇注及注塑等方法。封接层的材料选用耐热透明胶带、PET膜、氟膜或是与通道层相同材料或不同材料 的平板。通道层与封接层进行封接，封接方法根据材料及应用不同可选用耐热透明胶带粘 合、热键合、耐热胶粘合、或是热压封接等；封接后用胶带将所有孔封闭以备用。若通道层选用的是非透明材料，且封接层选用的是硬质材料，则封接层需要预先 在与通道层的进样口与出样口相对应的位置钻好小孔及小孔，然后再进行封接。若通道层选用的是透明材料，可在其上的进样口和出样口的位置直接钻孔后与封 接层封接。若封接层选用的是PET薄膜、氟膜或透明胶带等软质材料，则封接层或通道层均 无需打孔，只需在使用时用针头将薄膜或胶带相对应于进样口和出样口的位置刺破即可。根据芯片通道层选用的材料及实验的需要不同，可将通道层的背面与铝片、铜片 或硅片等导热系数大的材料粘合。利用本实用新型可进行核酸数字扩增的方法，通过以下步骤完成(1)样品准备如果核酸扩增采用传统的PCR方法，则将模板DNA与STOR Premix EXTaq试剂盒 或I1aqman探针试剂盒混合；如果核酸扩增采用环介导等温扩增，则将模板DNA与LAMP反应试剂及DNA荧光染料 SYBR Green I 混合；(2)将封接层上的小孔或是通道层上的出样口 11处的透明胶带扎破，并将吸盘置 于此孔上，然后开始抽真空，使真空度达到0 13332. 2Pa，这样便可利用负压进行进样和 微流体分配；(3)根据主通道及侧室的大小，在芯片封接层上的小孔处或是通道层上的进样口 处加上适量样品，并将此处的胶带扎破，此时溶液会在负压的作用下进入主通道及其两侧 的小室，待溶液充满主通道和侧室后仍继续抽真空，直到主通道的液体被全被抽出，此时侧 室的样品不会被抽出而仍然保留，从而将样品分隔到成百上千个皮升到纳升级的小室中； 用少量双蒸水冲洗主通道；(4)向主通道内导入矿物油并使其充满主通道，从而将上千个侧室分隔开来；也 可以向主通道内导入低沸点溶液、热固性塑料等，目的都是为了将侧室的出口堵住，避免加 热后侧室内的溶液向主通道扩散；(5)用固化胶或耐热透明胶带将封接层上的小孔和小孔或通道层上的出样口和进 样口密封；(6)将集成流路芯片组件置于原位PCR仪或类似于原位PCR仪的热循环装置上，可 进行传统的PCR扩增；若对核酸进行环介导等温扩增，将集成流路芯片组件置于普通的热 板上，65度加热30-60分钟即可；(7)对扩增后的产物进行荧光成像，软件计数阳性孔。本实用新型的优点1.与多孔板上进行的数字PCR相比，本实用新型利用芯片微型化的特点，试剂和 样品的消耗量均很少，大大减少了实验成本；除此之外，本实用新型只需通过抽真空进行负 压进样，在几十秒的时间内便可使微量液体分配至成百上千个独立的小室中，大大提高了 实验速度。充分体现了当今分析设备微型化、便携化的发展趋势，在高通量、低消耗和大规 模平行处理方面具有极大的优势。另外，由于样品和试剂的分配都在芯片内部完成，不与外 界大气直接接触，可有效防止外界污染和交叉污染。2.本实用新型中的集成流路芯片可根据实验的需要或不同的实验条件而选择 不同的材料，种类繁多，选择面宽，例如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚四氟乙烯、聚苯乙烯 (PC)、聚碳酸酯(PC)、环氧树脂、玻璃等，如果是采用正压进样，还可以选用聚二甲基硅氧烷 (PDMS)。3.与现有的商品化数字PCR芯片相比，本实用新型不需要微阀便可使少量液体分 配到上千个独立的小室中，大大减少了芯片制作和使用的复杂程度。4.本实用新型结构及操作简单，因此无论是芯片还是其所需的配套仪器，其应用 成本都将会比目前商品化的基于PDMS弹性微阀的数字PCR芯片大大减少，为数字PCR技术 的推广与应用提供了一个良好的平台。
图1是本实用新型的装置示意图。图2为吸盘与芯片连接处的局部放大图。图3为芯片通道层示意图。[0034]图4为阳性孔计数软件工作框图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本实用新型作进一步说明。实施例1参见图1、图2、图3，一种用于数字核酸扩增的集成流路芯片装置，它由真空系统 1 (如真空泵)、前管路2、缓冲瓶3、后管路4、毛细管5、吸盘6、封接层7和通道层8组成，通 道层8与封接层7封接后组成了集成流路芯片组件，吸盘6置于集成流路芯片组件上，通道 层8刻有通道及进样口 12和出样口 11，通道由蜿蜒的主通道9及位于主通道9两侧的若干 侧室10组成，主通道9的两个末端分别接出样口 11和进样口 12，前管路2 —端连接真空系 统1，另一端连接缓冲瓶3，后管路4 一端与缓冲瓶3相连，另一端与毛细管5相连，毛细管 5穿过吸盘6与集成流路芯片组件连通。通道层8以厚500 μ m的黑色聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)为材料，采用激光刻蚀制 成；主通道9的宽度为100 μ m，深100 μ m ；侧室10为边长300 μ m的方形，深300 μ m，体积 为27nl ；侧室10的横截面还可以为圆形、梯形或其它多边形。封接层7根据应用不同，选用耐热透明胶带或是PET膜、氟膜、透明PMMA平板等如果封接层7选用的是PMMA平板等硬质材料，封接前需要在与通道层8的出样口 11与进样口 12相对应的位置钻好小孔13和小孔14，然后再进行封接，封接成功后用胶带 将所有孔封闭以备用；但如果封接层7选用的是PET膜、氟膜等软质材料，则无需预先打孔，只需在使用 时在与出样口 11与进样口 12相对应位置用针头刺破即可。出样口 11通过芯片封接层7上相对应的小孔13与吸盘6、毛细管5、后管路4、缓 冲瓶3及前管路2及真空系统1相连(参加图1、2)。所述的真空系统1通过抽真空，将置于芯片封接层7上的小孔14处的样品抽入主 通道9和侧室10，当样品充满主通道9和侧室10之后，继续抽真空，可将主通道9中的液体 抽出，而侧室10中的液体仍然保留，从而将样品分隔到成百上千个纳升级的小室中。实施例2参见图1、图2、图3，参照实施例1，一种用于数字核酸扩增的集成流路芯片装置， 它由真空系统1 (如真空泵)、前管路2、缓冲瓶3、后管路4、毛细管5、吸盘6、封接层7和通 道层8组成，通道层8与封接层7封接后组成了集成流路芯片组件，吸盘6置于集成流路芯 片组件上，通道层8上设有通道及进样口 12和出样口 11，通道由蜿蜒的主通道9及位于主 通道9两侧的若干侧室10组成，主通道9的两个末端分别接出样口 11和进样口 12。前管 路2 —端连接真空系统1，另一端连接缓冲瓶3，后管路4 一端与缓冲瓶3相连，另一端与毛 细管5相连，毛细管5穿过吸盘6与集成流路芯片组件连通。通道层8以环氧树脂为材料，采用浇注方法制得，也可以采用激光刻蚀的方法制 作；通道层8厚度为600 μ m。主通道9的宽度为50 μ m或100 μ m，深50 μ m或100 μ m (这 样写可以吗？)；侧室10为边长300 μ m的方形，深400 μ m，体积为36nl，所述的侧室10也 可以是梯形、圆形或多边形。芯片封接层7根据应用不同，可选用耐热透明胶带或是PET膜、氟膜、聚合物平板等如果封接层7选用的是硬质材料，封接前需要在与通道层8的出样口 11与进样口 12相对应的位置钻好小孔13和小孔14，然后再进行封接，封接成功后用胶带将孔封闭以备 用；但如果封接层7选用的是PET膜、氟膜等软质材料，则无需预先打孔，只需在使用 时在与出样口 11与进样口 12相对应位置用针头刺破即可。出样口 11通过芯片封接层7上相对应的小孔13及吸盘6、毛细管5、后管路4、缓 冲瓶3及前管路2与真空系统1相连(参见图1、2)。所述的真空系统1通过抽真空，将置于芯片封接层7上的小孔14上的样品抽入主 通道9和侧室10，当样品充满主通道9和侧室10之后，继续抽真空，可将主通道9中的液体 抽出，而侧室10中的液体仍然保留，从而将样品分隔到成百上千个纳升级的小室中。实施例3本实施例的用于数字核酸扩增的集成流路芯片装置的结构参见图1、图2、图3，参 照实施例1。它由真空系统1 (如真空泵)、前管路2、缓冲瓶3、后管路4、毛细管5、吸盘6、 封接层7和通道层8组成，通道层8与封接层7封接后组成了集成流路芯片组件，吸盘6置 于集成流路芯片组件上，通道层8上设有通道及进样口 12和出样口 11，通道由蜿蜒的主通 道9及位于主通道9两侧的若干侧室10组成，主通道9的两个末端分别接出样口 11和进 样口 12 ；前管路2 —端连接真空系统1，另一端连接缓冲瓶3，后管路4 一端与缓冲瓶3相 连，另一端与毛细管5相连，毛细管5穿过吸盘6与芯片组件连通。通道层8以Imm厚的玻璃为材料，采用标准的光刻、蚀刻技术制成。主通道9的 宽度为30 μ m，50 μ m，100 μ m;主通道9深20 μ m，30 μ m，50 μ m ；侧室10的横截面为边长 100 μ m，200 μ m或300 μ m的正方形，深50 μ m, 100 μ m, 200 μ m ；根据不同的宽度和刻蚀深 度，侧室10的体积为可为500pl，lnl，2nl，4. 5nl,8nl,9nl, 18nl ；侧室10也可以为五边形、 梯形或圆形；通道层8制作好以后，将进样口 12和出样口 11用直径Imm的钻头打通，然后将 通道面与芯片封接层7封接；相同性质的玻璃作为芯片封接层7，采用热键合与通道层8封 接；封接成功后用胶带将通道层8上的进样口 12和出样口 11封闭以备用。出样口 11通过吸盘6、毛细管5、后管路4、缓冲瓶3及前管路2与真空系统1相 连；所述的真空系统1通过抽真空，将置于进样口 12处的样品抽入主通道9和侧室10，当 样品充满主通道9和侧室10之后，继续抽真空，可将主通道9中的液体抽出，而侧室10中 的液体仍然保留，从而将样品分隔到成百上千个皮升或纳升级的小室中。实施例4数字化环介导等温扩增(Digital-Loop Mediated Isothermal Amplification, Digital-LAMP)本实施例采用实施例1的装置进样，并进行后续的数字化环介导等温扩增。具体步骤1、设计通道结构参见图3，并制成掩膜。2、芯片通道层8以0. 5mm的PMMA为材料，经激光刻蚀得到所需的通道结构，主通 道9宽100 μ m，深100 μ m ；侧室10形状为正方形，边长为300 μ m,深度为0. 5mm,即全部刻通。[0062]通道9和侧室10的尺寸可根据需要选择，通道9的宽度从10 μ m到1000 μ m不等， ΙΟμπι到1000 μ m深；侧室10的尺寸为nl到μ 1级，侧室可以是方形、圆形或梯形。3、将0. 6mm-2mm厚的铜片用胶水与芯片通道层8的背面粘合起来。与芯片通道层8背面粘合的材料除了铜片之外，还可以选择镍、硅片等导热系数 高、且不处理或经简单处理后与核酸扩增反应的试剂有相容性的材料。4、将芯片通道层8的通道面与耐热透明胶带封合。芯片通道层8还可采用PET膜、氟膜封合或与钻好孔的PMMA等聚合物平板用胶水 或热压封接，封接完后用透明胶带将打孔处封闭待用；5、采用商业化λ -DNA作为反应模板考察芯片的性能将模板DNA稀释到适当的浓 度并与适量的LAMP反应试剂及DNA荧光染料STOR Green I混合(1)将 500ng/ μ L 的 λ -DNA 溶液稀释为 5pg/ μ L、0. 5pg/ μ L、0. 05pg/ μ L， 0. 005pg/ μ L，作为DNA模板各取1 μ L进行PCR反应。(2)按照50uL体系配制LAMP反应混合物λ -DNA模板1 μ L，弓丨物 FIP (40 μ Μ) 2 μ L,弓丨物 BIP (40 μ Μ) 2 μ L，弓丨 *F3(5yM)2yL，弓丨 *Β3(5μΜ)2μ ， dNTP (2. 5mM each) 8 μ L，MgSO4 (50mM) 6 μ L, betaine (5M) 10 μ L, Bst 酶 2 μ L，Bstbuffer 5 μ L，SYBR Green I 2 μ L, ddH20 8 μ L0 LAMP 弓丨物如下F3 :5’ GTTGGGAAGGGCGATCG 3’B3 :5， ACTTTATGCTTCCGGCTCGTA 3，FIP :5’ ACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTTTTTGTGCGGGCCTCTTCGCTATTAC 3’BIP :5’ CGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACTTTTTGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGAT 3’6、将芯片封接层7上对应于出样口 11处的透明胶带刺破，并将吸盘6置于此孔 上，然后开始抽真空，使真空度达到0 13332. 2Pa。7、在芯片封接层7上对应于进样口 12处加上50 μ L的反应混合物，并将此处的胶 带扎破，此时溶液会在负压的作用下进入主通道9及其两侧的小室10，待溶液充满主通道9 和侧室10后仍继续抽真空，直到主通道9的液体被全被抽出，此时侧室10的样品不会被抽 出而仍然保留；少量双蒸水冲洗主通道9。8、向主通道9内导入矿物油并使其充满主通道9，从而将上千个侧室10分隔开来； 也可以向主通道9内载入难挥发性液体、热固性塑料，目的都是为了将侧室10的出口堵住， 避免加热后侧室10内的溶液向主通道9扩散。9、用固化胶或耐热透明胶带将胶带的刺破处密封。10、将芯片组件置于热板上，65度加热30分钟，以对核酸进行环介导等温扩增。 由于STOR Green I荧光染料只与双链DNA小沟结合，当它与DNA双链结合时，发出较原先 强800 1000倍的荧光，因此，发生扩增反应的侧室9将呈现绿色荧光，阴性将无颜色变 化。因此，如果有核酸分子被分配到某个独立的侧室10，该侧室在反应后将产生绿色的荧 光；如果核酸的浓度足够低，是每个侧室10最多能分到一个核酸分子，那么，通过对阳性孔 的计数就可以对起始的核酸模板量进行精确定量。11、对扩增后的产物进行荧光成像后，用自行开发的软件对对阳性孔进行计数及 分析。参见图4，软件由加法器、原始图像储存部、图像计算部、检测标准选择部及结果存储部等部分组成。原始图像储存部在数据图像进入处理软件之后将数据保存，并在中间结 果计算及最终结果输出中提供原始的数据；图像计算部包含边缘检测、阈值分析、区域选 择等关键步骤；检测标准选择部包含数种不同的检测标准，按一定的顺序执行，以适应不 同质量的图像数据的处理要求；结果存储部用来保存每次处理结果的数据，并在执行完 所有检测标准后，将结果累加输出。实施例5数字化聚合酶链反应(Digital-PCR)本实施例采用实施例2的装置进样，并进行后续的数字化聚合酶链反应。具体步骤1、参见图3设计通道结构，并制成掩膜；2、芯片通道层8以0. 6mm的耐热环氧树脂为材料，经激光刻蚀得到所需的通道结 构，主通道9宽100 μ m,深100 μ m ；侧室10形状为正方形，边长为300 μ m,深度为0. 4mm。通道9和侧室10的尺寸可根据需要选择，通道9的宽度从10 μ m到1000 μ m不等， ΙΟμπι到1000 μ m深不等；侧室10的尺寸为pi到nl级，侧室可以是方形、圆形或梯形。3、将0. 6mm-2mm厚的铝板用胶水与芯片通道层8的背面粘合起来。与芯片通道层8背面粘合的材料除了铝板之外，还可以选择铜片、镍、硅片等导热 系数高、且不处理或经简单处理后与核酸扩增反应的试剂有相容性的材料。4、以耐热氟膜或PET薄膜为芯片封接层7，经耐热胶粘合后热压与芯片通道层8封 接；5、采用商业化λ -DNA作为反应模板考察芯片的性能将模板DNA稀释到适当的浓 度并与适量的荧光定量PCR反应试剂混合1)将 500ng/yL 的 λ-DNA 溶液稀释为 5pg/μ L、0. 5pg/μ L、0. 05pg/μ L， 0. 005pg/ μ L，作为DNA模板各取2 μ L进行PCR反应。2)使用STOR Premix EX Taq试剂盒进行PCR扩增反应，按照50 μ L体积配制反 应液，SYBR Premix EX Taq (2 X) 25 μ L, PCR Forward Primer(IOyM)IyL, PCR Reverse Primer(IOyM)IyL, ddH20 21 μ L, DNA 模板 2.0 μ L。反应条件为95 °C 30sec 预变性， 95°C 5sec，60°C 30sec，共40个循环。所用λ -DNA的引物序列如下上游引物5，GATGAGTTCGTGTCCGTACAACTGG3，下游引物5，GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC3，PCR的扩增反应及检测还可以采用Taqman探针来完成。6、将芯片封接层7上对应于出样口 11处的薄膜刺破，并将吸盘6置于此处，然后 开始抽真空，使真空度达到0 13332. 2Pa。7、在芯片封接层7上对应于进样口 12处加上50 μ L的反应混合物，并将此处薄膜 扎破，此时溶液会在负压的作用下进入主通道9及其两侧的小室10，待溶液充满主通道9和 侧室10后仍继续抽真空，直到主通道9的液体被全被抽出，此时侧室10的样品不会被抽出 而仍然保留；少量双蒸水冲洗主通道9 ；8、向主通道9内载入矿物油并使其充满主通道9，从而将上千个侧室10分隔开来； 也可以向主通道9内载入低沸点液体、热固性塑料等，目的都是为了将侧室10的出口堵住， 避免加热后侧室10内的溶液向主通道9扩散。9、用固化胶或耐热透明胶带将薄膜的刺破处密封。[0100]10、将芯片组件置于原位PCR仪器上，95°C 30sec预变性，95°C 5sec，60°C 30sec, 共40个循环。由于STOR Green I荧光染料只与双链DNA小沟结合，当它与DNA双链结合 时，发出较原先强800 1000倍的荧光，因此，发生扩增反应的侧室9将呈现绿色荧光，阴 性将无颜色变化。因此，如果有核酸分子被分配到某个独立的侧室10，该侧室在反应后将产 生绿色的荧光；如果核酸的浓度足够低，使每个侧室10最多能分到一个核酸分子，那么，通 过对阳性孔的计数就可以对起始的核酸模板量进行精确定量。11、对扩增后的产物进行荧光成像后，通过软件对阳性孔进行计数及分析，参见图4。
权利要求1.一种用于数字核酸扩增的集成流路芯片装置，由真空系统(1)、前管路O)、缓冲瓶 (3)、后管路G)、毛细管(5)、吸盘(6)、封接层(7)和通道层(8)组成，道层(8)与封接层 (7)进行封接组成集成流路芯片组件，吸盘(6)置于集成流路芯片组件上，通道层(8)刻有 通道，并设有出样口(11)和进样口(12)，通道由蜿蜒的主通道(9)及位于主通道(9)两侧 的若干侧室(10)组成，主通道(9)的两个末端分别接出样口 (11)和进样口(12)，侧室(10) 的横截面为正方形、圆形或梯形，前管路O)的一端连接真空系统(1)，另一端连接缓冲瓶 (3)，后管路(4)的一端与缓冲瓶(3)相连，另一端与毛细管(5)相连，毛细管(5)穿过吸盘(6)与集成流路芯片组件连通。
2.根据权利要求1所述的一种用于数字核酸扩增的集成流路芯片装置，其特征在于， 主通道(9)的宽度从1 μ m至1000 μ m，深度范围在Iym至IOOOym之间，侧室(10)的体积 为皮升到纳升级别。
3.根据权利要求1所述的一种用于数字核酸扩增的集成流路芯片装置，其特征在于， 通道层(8)的材料选用聚甲基丙烯酸甲酯、环氧树脂、聚四氟乙烯、聚苯乙烯、玻璃或PDMS 中的一种，通道层(8)的制作方法选用激光刻蚀法、化学蚀刻法、光刻法、热压法、浇注法或注塑法。
4.根据权利要求1所述的一种用于数字核酸扩增的集成流路芯片装置，其特征在于， 封接层(7)的材料选用耐热透明胶带、PET膜、氟膜或与通道层⑶相同材料或不同材料的 平板。
5.根据权利要求1所述的一种用于数字核酸扩增的集成流路芯片装置，其特征在于， 通道层(8)与封接层(7)的封接方法选用耐热透明胶带粘合、热键合、耐热胶粘合或热压封 接法。
6.根据权利要求5所述的一种用于数字核酸扩增的集成流路芯片装置，其特征在于， 当通道层(8)选用非透明材料，封接层(7)选用硬质材料时，封接层(7)需要预先在与进样 口 (12)和出样口 (11)相对应的位置钻好小孔(14)及小孔(13)，然后再进行封接，封接后 用胶带将所有孔封闭以备用。
7.根据权利要求5所述的一种用于数字核酸扩增的集成流路芯片装置，其特征在于， 当通道层(8)选用透明材料，则在进样口(12)和出样口(11)的位置直接钻孔后与封接层(7)封接，封接后用胶带将所有孔封闭以备用。
8.根据权利要求5所述的一种用于数字核酸扩增的集成流路芯片装置，其特征在于， 当封接层(7)选用软质材料，则封接层(7)或通道层(8)均无需打孔，只需在使用时用针头 将薄膜或胶带相对应于进样口(1 和出样口(11)的位置刺破即可，软质材料选用PET薄 膜、氟膜或透明胶。
9.根据权利要求1述的一种用于数字核酸扩增的集成流路芯片装置，其特征在于，通 道层(8)的背面与导热系数大的材料粘合，导热系数大的材料选用铝片、铜片或硅片。
专利摘要本实用新型提供一种用于数字核酸扩增的集成流路芯片装置，由真空系统、前管路、缓冲瓶、后管路、毛细管、吸盘、封接层和通道层组成，通道层与封接层进行封接后组成集成流路芯片组件，通道层刻有通道，并设有出样口和进样口，通道由蜿蜒的主通道及位于主通道两侧的若干侧室组成，主通道的两个末端分别接出样口和进样口，前管路一端连接真空系统，另一端连接缓冲瓶，后管路一端与缓冲瓶相连，另一端与毛细管相连，毛细管穿过吸盘与集成流路芯片组件连通。本实用新型设计合理，微型化、便携化，操作简单，在几十秒的时间内可使微量液体分配至上千个独立小室中，减少芯片制作和使用的复杂程度，提高实验速度，可在核酸数字扩增中应用。
文档编号C12M1/00GK201901669SQ20102027029
公开日2011年7月20日 申请日期2010年7月23日 优先权日2010年7月23日
发明者吴青青, 朱强远, 牟颖, 金伟, 金钦汉, 黄江 申请人:浙江大学