专利名称：一种同时检测tnf、il-10和ctla-4基因多态性的芯片的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种人类免疫相关基因(TNF、IL-10和CTLA-4基因)多态性的芯片，尤其涉及一种能同时检测TNF-α -308，IL_10_1082，IL-10-592, CTLA-4-49位点基因多态性的玻璃基因芯片，属生物芯片诊断技术领域。
背景技术：
人体免疫系统是由免疫器官、免疫细胞、免疫因子等组成的庞大的系统，负责抵御外来多种类型病原菌的侵害，清除体内衰老、死亡或损伤的自身细胞以及识别和消灭体内产生的突变细胞。免疫调节细胞的功能异常或失衡，对多种自身免疫性疾病以及恶性肿瘤的产生具有重要影响。免疫调节细胞可以产生多种不同的细胞因子，作为细胞间信号传递分子，发挥调节免疫应答、参与免疫细胞的分化、发育和介导炎症反应等作用。这些细胞因子的合成及合成量为遗传基因所控制，差别的主要原因为基因序列上存在许多极小的遗传差异即单核苷酸多态性。TNF(肿瘤坏死因子)是体内具有多种生物活性的重要细胞因子，具有抗肿瘤，抗病毒感染及免疫调节作用。多项研究提示肿瘤患者体内TNF呈现过度表达。TNF-a-308 位点位于TNF-α基因启动子区，这一位点的基因多态性可能影响体内TNF的表达，进而影响机体免疫功能的改变。IL-10 (白细胞介素-10)是一种具有广泛免疫活性的免疫调节细胞因子，其作用包括诱导B细胞增殖和分化，抑制T细胞的增殖和细胞毒作用。近年来发现，某些肿瘤往往伴有血清IL-10水平增高及受体表达异常。提示IL-10失调会影响机体整个内环境的稳定，进而导致免疫功能的紊乱，直至诱导肿瘤的发生和发展。IL-10启动子区-1082位点和-592位点基因多态性可能影响着体内IL-10的表达，进而影响相关疾病的发生与发展。CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞抗原-4)是一种T细胞活性的负性调节因子，其高表达可导致细胞周期阻滞和细胞因子产量抑制，直接导致T细胞增殖期的消除。CTLA-4 49位点基因多态性可能影响T细胞活性，进而对免疫相关性疾病及肿瘤的发生产生影响。 综上所述，上述几个基因均为参与人体免疫调节的重要组成因素，明确这些基因序列上的基因类型可以了解人体先天性免疫功能以及了解人体罹患自身免疫性疾病及恶性肿瘤的风险。基因芯片技术是一种微型化、快速、高效进行基因检测的技术方法，迄今为止，在基因表达检测，基因突变检测，单核苷酸多态性和DNA序列测定等方面具有广泛的研究应用。然而，检索发现人类免疫相关基因(TNF，IL-10和CTLA-4基因)多态性检测的玻璃基因芯片，至今未见报道。
发明内容针对现有技术的不足，本实用新型提供了一种同时检测TNF-α -308，IL_10_1082， IL-10-592, CTLA-4-49位点多态性的玻璃基因芯片。该芯片能够克服现有技术存在的不能一次检测多个基因多态性的缺陷，满足疾病预防控制和临床医疗领域的需要。[0006]本实用新型所述同时检测TNF、IL-10和CTLA-4基因多态性的玻璃基因芯片，由 玻璃基片和阵列式分布于玻璃基片上的寡核苷酸探针与对照及空白的点涂层组成；其特征 在于所述的玻璃基片是表面有醛基化修饰层的玻璃片；所述点涂层的形状为圆形，涂层 区设1 2个，每涂层区设有8条不同位点的基因特异性检测探针、1条阳性对照探针和4 条阴性对照探针、以及一个由点样液做的空白，其中所述8条检测探针中的每种探针与对 照及空白分別以2X 2方式在玻璃基片表面阵列排布4个平行的点涂层，每个点涂层的直径 为0. 15mm,同组探针或对照或空白点涂层间距为0. 4mm，不同组探针或对照点涂层间距为 0. 5mm。其中所述的玻璃基片是长方形，面积是73mm 77mmX25mm 27mm ；厚度为0. 6mm 2. Omm0所述的涂层区面积优选5mmX 5mm。上述8条不同位点的基因特异性检测探针的基因序列分别是(TNF-a -308)-w :5，-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-GAGGGGCATGAGGACGGGGTT ；(TNF-a -308)-m :5，-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-GAGGGGCATGGGGACGGGGTT ；(IL-10-1082)-w :5，-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-TTCTTTGGGAAGGGGAAGTAG ；(IL-10-1082)-m :5，-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-TTCTTTGGGAGGGGGAAGTAG ；(IL-10-592)-w :5，-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-CCCCGCCTGTCCTGTAGGAAG ；(IL-10-592)-m :5，-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-CCCCGCCTGTACTGTAGGAAG ；(CTLA-4-49)_w :5，-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-GAACCTGGCTACCAGGACCTG ；(CTLA-4-49)-m :5，-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-GAACCTGGCTGCCAGGACCTG ；上述1条阳性对照探针的基因序列是日-actin :5，-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-TACTCTAACCGTACCGA ；上述4条阴性对照探针的基因序列分别是(TNF-a -30 -CK 5，-(NH2)-(CH2)6_Po1(dT)15-GAGGGGCATGCGGACGGGGTT ；(IL-10-1082)-CK :5，-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-TTCTTTGGGACGGGGAAGTAG ；(IL-10-592)-CK :5，-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-CCCCGCCTGTGCTGTAGGAAG ；(CTLA-4-49)-CK 5，-(NH2)-(CH2)6-Po1(dT)15-GAACCTGGCTCCCAGGACCTG上述检测探针与对照探针均以poly (dT) 15作为连接臂，并在探针的5’端加入带 氨基的六碳基团。上述表面有醛基化修饰层的玻璃片的制备方法是将未经任何化学修饰的载玻片 裸片，以体积百分比浓度为5%戊ニ醛水溶液浸泡，然后晾干制得。本实用新型所述的人类免疫相关基因(TNF，IL-10和CTLA-4基因)多态性检测玻 璃基因芯片实现了高通量检测的目的，具有如下优点和效果(1)采用的 TNF-a -308，IL-10-1082, IL-10-592, CTLA-4-49 多态性位点特异性引 物和检测探针，能够实现对TNF，IL-10和CTLA-4基因进行有效扩增和精确鉴定。(2)采用的将TNF，IL-10和CTLA-4基因多态性特异性探针点制在同一个检测微 阵列上，能够实现对多个基因位点的同时检測。总之，本实用新型涉及的芯片同时用于TNF-a-308，IL-10-1082, IL-10-592,CTLA-4-49位点基因多态性检测，确定人体免疫相关基因的基因型，提供人体免疫相关基因相关的遗传信息咨询，有望满足疾病预防控制和临床医疗领域的需要。
图1 本实用新型所述同时检测TNF、IL-10和CTLA-4基因多态性的玻璃基因芯片的探针排布图。其中，所述检测人类免疫相关(TNF，IL-10和CTLA-4基因)多态性芯片的探针排布如下表所示
权利要求1.一种同时检测TNF、IL-IO和CTLA-4基因多态性的玻璃基因芯片，由玻璃基片和阵列式分布于玻璃基片上的寡核苷酸探针与对照及空白的点涂层组成；其特征在于所述的玻璃基片是表面有醛基化修饰层的玻璃片；所述点涂层的形状为圆形，涂层区设1 2个， 每涂层区设有8条不同位点的基因特异性检测探针、1条阳性对照探针和4条阴性对照探针、以及一个由点样液做的空白，其中所述8条检测探针中的每种探针与对照及空白分别以2X2方式在玻璃基片表面阵列排布4个平行的点涂层，每个点涂层的直径为0. 15mm,同组探针或对照或空白点涂层间距为0. 4mm，不同组探针或对照点涂层间距为0. 5mm。
2.如权利要求1所述同时检测TNF、IL-10和CTLA-4基因多态性的玻璃基因芯片，其特征在于，所述的玻璃基片是长方形，面积是73mm 77mmX 25mm 27mm ；厚度为0. 6mm 2. Omm0
3.如权利要求1所述同时检测TNF、IL-10和CTLA-4基因多态性的玻璃基因芯片，其特征在于，所述涂层区的面积为5. OmmX5. 0mm。
专利摘要本实用新型公开了一种同时检测TNF、IL-10和CTLA-4基因多态性的玻璃基因芯片，由玻璃基片和阵列式分布于玻璃基片上的寡核苷酸探针与对照及空白的点涂层组成；其中所述的玻璃基片是表面有醛基化修饰层的玻璃片；所述点涂层的形状为圆形，涂层区设1～2个，每涂层区设有8条不同位点的基因特异性检测探针、1条阳性对照探针和4条阴性对照探针、以及一个由点样液做的空白。本实用新型的芯片可快速、高效对人类免疫相关基因TNF-α-308，IL-10-1082，IL-10-592，CTLA-4-49位点单核苷酸多态性进行同步检测，了解机体先天性免疫机能，对判断个体罹患自身免疫性疾病及恶性肿瘤的风险具有重要的意义。
文档编号C12Q1/68GK202164307SQ2010205901
公开日2012年3月14日 申请日期2010年11月4日 优先权日2010年11月4日
发明者刘杰, 吕丽燕, 宋卫国, 宋宝, 王兴武, 胡德蓉 申请人:山东省肿瘤医院