专利名称：为增强转基因植物的干旱抗性和提高其产量而工程化nf-yb转录因子的制作方法
技术领域：
本发明总地涉及转基因植物，其过表达编码在转录调节中有活性的多肽之分离的多核苷酸，由此提高所述植物的产量。
背景技术：
人口增加和气候变化使得全球食物、饲料和燃料短缺的可能性成为近年来的尖锐聚焦点。农业消耗70%人类所用的水，同时在世界许多地方降雨量下降。此外，随着从农田改为市区和城郊而对土地使用的改变，较少公顷的耕地可用于种植农作物。农业生物技术尝试通过可以增加作物产量的植物遗传改变来满足人类增长的需求，例如，通过赋予更好的对非生物胁迫的耐受性或通过提高生物量。在此将作物产量定义为每英亩收获的相关农业产品(如籽粒、粮草或种子)的蒲式耳量。作物产量受到非生物胁迫的影响，如干旱、热、盐度和冷胁迫，并且受到植物大小 (生物量)的影响。传统植物育种策略相对缓慢，并且通常在赋予提高的非生物胁迫耐受性中是不成功的。玉米中通过常规育种的谷粒产量提高最近达到了一个平台期。玉米的收获指数，即，收获时产量生物量与总累积生物量的比例，在过去几百年的为谷粒产量的选择性育种过程中，基本保持不变。因此，最近在玉米中发生的产量提高是每单位耕地面积提高的总生物量产生的结果。通过提高种植密度获得了这种提高的总生物量，这导致了适应性的表型变化，如叶角的减小，这可以降低下部叶的遮挡，和雄花穗的大小，这可以提高收获指数。当土壤水分耗尽时或者如果在干旱期间不能获得水，作物产量受到限制。如果叶的蒸腾作用超过来自根部的水分供应，将产生植物水分缺乏。可用的水供给涉及土壤中保持的水量和植物用其根系获得水的能力。水从叶的蒸腾作用与通过气孔的光合作用的二氧化碳固定相关。这两个过程正相关，使得通过光合作用的高二氧化碳流入与通过蒸腾作用的水分丢失密切相关。随着水从叶蒸腾出来，叶水的势能降低，气孔在水力过程中趋于闭合，限制光合作用的量。由于作物产量取决于光合作用中的二氧化碳固定，因此水吸收和蒸腾作用是作物产量的起作用的因素。能够使用较少的水来固定相同含量的二氧化碳或在较低水势能下能够正常作用的植物具有进行更多光合作用的潜能，并因此在许多农业系统中具有产生更多生物量和经济产量的潜能。农业生物技术已经在模式植物系统、作物的温室研究和田间试验中使用了试验， 以尽力研发呈现出提高产量的转基因植物，通过非生物胁迫耐受性提高或通过提高的生物量。例如，水利用率(WUE)是常常与干旱耐受性相关的参数。还利用了植物对干燥、渗透压休克和温度极值的应答的研究来确定植物对非生物胁迫的耐受性或抗性。低水可用性下的生物量的增加可能是由于相对提高的生长效率或降低的水消耗引起的。在选择用于提高作物的性状时，水使用降低，而生长没有变化将在水输入成本高的灌溉农业系统中具有特别的价值。不需要相应的水使用上涨的生长提高对于所有农业系统具有适用性。在许多水供给不受限制的农业系统中，生长提高，即使以水使用增加为代价也
提高了产量。农业生物技术还利用表示转基因对作物产量潜在影响的其他参数的测量。对于饲料作物，如苜蓿、青贮玉米和干草，植物生物量与总产量相关。然而，对于谷类作物，已经使用其他参数来估算产量，如植物大小，如通过总植物干重、地上部分干重、地上部分鲜重、 叶面积、茎干材积、植物高度、莲座(rosette)直径、叶长、根长、根量、分蘖数和叶数所测量的。早期发育阶段的植物大小通常与发育后期的植物大小相关。具有较大叶面积的较大植物通常比较小的植物可以吸收更多的光和二氧化碳，因此将很可能在相同的时间段内获得较高的重量。对于植物大小和生长速率，存在强遗传成分，因此对于许多不同的基因型，一个环境条件下的植物大小很可能与另一个环境条件下的大小相关。这样，使用标准环境来模拟农田中的作物在不同的位置和时间遇到的不同的和动态的环境。收获指数在许多环境条件下是相对稳定的，并且因此植物大小和谷物产量之间的牢固相关性是可能的。植物大小和谷物产量内在地相关，因为大部分谷物生物量取决于植物的叶和茎当前或存储的光合作用生产力。如同非生物胁迫耐受性一样，在生长室或温室中的标准化条件下，测量早期发育的植物的大小，是测量由转基因的存在赋予的潜在产量优势的标准实践方法。NF-Y转录因子，作为包含NF-YA、NF-YB和NF-YC的三个蛋白质的三聚体，结合 CCAAT-盒共有序列以调控不同组的基因，所述三聚体以高亲和性和特异性结合DNA以激活转录。NF-Y 亚基 NF-YA、NF-YB、NF-YC 各自也称为 CBF-B/HAP2、CBF_A/HAP3 和 CBF-C/HAP5。 所有三个亚基含有保守的核心结构域，其包含组蛋白折叠，其是三个螺旋的核心，其中长的中间螺旋在每端侧翼为较短的一个螺旋。这些结构域涉及不同的功能，包括DNA-结合、亚基相互作用和核转运。在真菌和动物中发现了 NF-Y亚基的单个基因，然而，多个基因存在于植物中。在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中，存在多个编码不同NF-Y亚基的基因。NF-YA具有10个基因；NF-YB，13个基因；NF-YC，13个基因。在稻基因组中，存在相似的多样性。对于NF-YA， 存在10个基因；NF-YB，11个基因；NF-YC，7个基因。相似地，在小麦(Triticum aestivum) 基因组中，NF-YA基因家族由10个基因组成，NF-TO基因家族由11个基因组成，并且14个基因构成NF-YC基因家族。在所有情况中，每个物种中的不同NF-Y基因在组织和环境处理中得到不同的表达，表明各自是处于独立的转录调控下。U. S.专利申请公开2005/0022266公开了将玉米(Zea mays)Hap3转录因子在CaMV 35S启动子控制下转化至植物中提高了干旱耐受性。U.S.专利申请公开2008/040973公开了将植物在水分充足的条件下生长时，使用35S启动子和该转录因子导致降低的产量。 US2008/040973进一步公开了使用无增强子(enhancerless)稻肌动蛋白启动子和玉米 NF-YB基因使得转基因植物产生较少的NF-TO蛋白，并且该转基因植物在干旱和水分充足的条件下都显示出提高的产量。U. S.专利 No. 7，482，511 公开了作为 PpCABF-3 的小立碗藓(Physcomitrella patens)的 NF-YB 转录因子 ESD65，U. S.专利 No. 7，164，057 公开了作为 PpCABF-I 的小立碗藓NF-YB转录因子EST69。U. S.专利申请公开2007/0199107公开了其中特定的NF-YB转录因子作为转基因得到过表达的一种转基因植物，并表明与没有包含该转基因的野生型植物相比该转基因植物较早开花。尽管降低转基因植物中的NF-TO蛋白的水平提高了产量，但对进一步提高作物产量存在着持续的需求。发明概述本发明通过结合来自不同物种或一个物种内基因家族的不同成员的不同结构域而提供了新的NF-Y复合物的功能组合。列于表1中的NF-YB多核苷酸、嵌合多核苷酸和多肽能够提高转基因植物的产量。表 权利要求
1.一种用表达盒转化的转基因植物，该表达盒包含有效地连接的a)编码启动子的分离的多核苷酸；和b)编码全长多肽的分离的多核苷酸，该多肽是嵌合NF-TO转录因子；其中转基因植物与不包含表达盒的相同品种的野生型植物相比，显示了提高的产量。
2.权利要求1的转基因植物，其中NF-YB多肽依次包含i)源自小立碗藓NF-YB转录因子、双子叶植物NF-YB转录因子或单子叶植物NF-YB转录因子的N-端结构域；ii)源自小立碗藓NF-YB转录因子、双子叶植物NF-YB转录因子或单子叶植物NF-YB转录因子的中心保守结构域；iii)源自小立碗藓NF-YB转录因子、双子叶植物NF-YB转录因子或单子叶植物NF-YB 转录因子的C-端结构域。
3.权利要求2的转基因植物，其中双子叶植物NF-TO转录因子源自拟南芥。
4.权利要求2的转基因植物，其中单子叶植物NF-TO转录因子源自玉米。
5.权利要求1的转基因植物，进一步限定为选自玉米、小麦、黑麦、燕麦、小黑麦、稻、大麦、大豆、花生、棉花、油菜、卡诺拉、木薯、胡椒、向日葵、万寿菊属、马铃薯、烟草、茄子、西红柿、野豌豆属物种、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳属物种、油椰、椰子、多年生牧草和饲料作物的物种。
6.一种对于转基因是纯合的种子，该转基因包含有效地连接的a)编码启动子的分离的多核苷酸；和b)编码全长嵌合NF-TO转录因子多肽的分离的多核苷酸；其中从所述种子生长的转基因植物与不包含表达盒的相同品种的野生型植物相比，显示了提高的产量。
7.权利要求6的种子，其中NF-YB多肽依次包含i)源自小立碗藓NF-YB转录因子、双子叶植物NF-YB转录因子或单子叶植物NF-YB转录因子的N-端结构域；ii)源自小立碗藓NF-YB转录因子、双子叶植物NF-YB转录因子或单子叶植物NF-YB转录因子的中心保守结构域；iii)源自小立碗藓NF-YB转录因子、双子叶植物NF-YB转录因子或单子叶植物NF-YB 转录因子的C-端结构域。
8.权利要求7的种子，其中双子叶植物NF-TO转录因子源自拟南芥。
9.权利要求8的种子，其中单子叶植物NF-TO转录因子源自玉米。
10.权利要求7的种子，进一步限定为选自玉米、小麦、黑麦、燕麦、小黑麦、稻、大麦、大豆、花生、棉花、油菜、卡诺拉、木薯、胡椒、向日葵、万寿菊属、马铃薯、烟草、茄子、西红柿、野豌豆属物种、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳属物种、油椰、椰子、多年生牧草和饲料作物的物种。
11.一种提高植物产量的方法，该方法包括步骤a)用表达载体转化植物细胞，该表达载体包含有效地连接的i)编码启动子的分离的多核苷酸；和ii)编码全长嵌合NF-TO转录因子多肽的分离的多核苷酸；b)从转化的植物细胞再生转基因植物；和c)从再生的转基因植物选择耐干旱植物。
12.一种分离的多核苷酸，其具有选自SEQ ID NO 7 ；SEQ ID NO 9 ；SEQ ID NO 11 ；SEQ ID NO 13 ；SEQ ID NO 15 ；SEQ ID NO 17 ；SEQ ID NO 19 ；SEQ ID NO 21 ；SEQ ID NO 23 ； SEQ ID NO 25 ；SEQ ID NO 27 ；SEQ ID NO 29 ；SEQ ID NO 35 ；SEQ ID NO 37 ；SEQ ID NO 39 ；SEQ ID NO 41 ；SEQ ID NO 43 ；SEQ ID NO 45 ；SEQ ID NO 47 ；SEQ ID NO 49 ；SEQ ID NO 51 和 SEQ ID NO 53 的序列。
13.一种分离的多核苷酸，其编码具有选自以下的氨基酸序列的多肽SEQ ID NO 8 ； SEQ ID NO 10 ；SEQ ID NO 12 ； SEQ ID NO 14 ；SEQ ID NO 16 ； SEQ ID NO 18 ；SEQ ID NO 20 ；SEQ ID NO 22 ；SEQ ID NO 24 ；SEQ ID NO 26 ；SEQ ID NO 28 ；SEQ ID NO 30 ；SEQ ID NO 34 ；SEQ ID NO 36 ；SEQ ID NO 38 ；SEQ ID NO 40 ；SEQ ID NO 42 ；SEQ ID NO 44 ；SEQ ID NO 46 ；SEQ ID NO 48 ；SEQ ID NO 50 ；SEQ ID NO 52 禾口 SEQ ID NO :54。
全文摘要
公开了多核苷酸，其能够增强转化以含有该多核苷酸的植物的产量。还提供了使用这些多核苷酸的方法以及含有这些多核苷酸作为转基因的转基因植物和农产品(包括种子)。
文档编号C12N15/82GK102300992SQ201080005549
公开日2011年12月28日 申请日期2010年1月25日 优先权日2009年1月28日
发明者R·库尔卡尼 申请人:巴斯夫植物科学有限公司