牙齿的制造方法

专利名称：牙齿的制造方法
技术领域：
本发明涉及一种制造具有期望尺寸的牙齿的方法等。
背景技术：
牙齿是一种最外层具有被称为珐琅质的坚硬组织、其内层具有被称为象牙质的坚硬组织，并且在其内侧具有生成象牙质的成牙质细胞(odontoblast)和在中心部具有牙髓的器官。牙齿常会因龋齿或牙周病而缺失，但由于牙齿的有无大大地影响到外观和食物味道，因而对牙齿再生技术的关注正在增加。此外，对牙齿再生技术的关注也正在因为要维持健康和高质量的生活而增加。牙齿为一种通过胎儿期生成过程的诱导而形成，并由多个细胞种所构建的功能单位。牙齿不是由成人体内如造血干细胞或间叶干细胞之类的干细胞通过生成细胞种的干细胞系统生成的，因此，目前无法仅通过由再生医疗进行的干细胞移植(干细胞移植疗法)使牙齿再生。虽然已经识别出在牙齿生成过程中特异性表达的基因，并通过人为诱导牙胚来研究牙齿再生，但仅通过特定基因并不能完全诱导牙齿的再生。因此，近年来一直在研究使用来自于分离的牙胚的组织或细胞来重建牙胚，并通过移植该重建牙胚来制得再生牙齿的方法。本发明的发明人目前为止已经发现，在由胶原蛋白凝胶(collagen gel)等构成的支持载体内部以彼此接触的方式配置第一细胞凝集块与第二细胞凝集块，并将第一及第二细胞凝集块在支持载体内部进行培养，可有效地诱导细胞分化，从而制作出具备特有的细胞排列与方向性的再生牙胚和再生牙齿(例如参照专利文献1)。其中，第一细胞凝集块实质上仅由间叶细胞和上皮细胞中的任一种构成，第二细胞凝集块实质上仅由任何的另一种细胞构成，所述间叶细胞和上皮细胞中的至少一种来源于牙胚。并且，在将口腔内上皮细胞或其初代培养细胞作为上皮细胞使用时(例如参照专利文献2)、将来自羊膜的细胞作为间叶细胞使用时(例如参照专利文献3)或将分化诱导全能性干细胞得到的细胞作为间叶细胞使用时(例如参照专利文献4)，也同样可以制得具备特有的细胞排列和方向性的再生牙胚或再生牙齿。但是，由于牙齿的尺寸根据部位不同而不同，并且存在个体差异，因此从使适合于缺失牙齿部位的牙齿再生的观点来说，控制再生牙胚或再生牙齿的尺寸是非常重要的。然而，上述文献中并未研究控制再生牙齿尺寸的方法。而且，上述方法中有时会得到再生牙齿的集合体。在这种情况下，虽然可以将每个牙齿从集合体中分离作为移植片来使用，但从目前尚未充分开发三维细胞操作技术，且尚未充分阐明生成生物学中的形态控制机制的观点来说，很容易预料到控制牙齿集合体中包含的牙齿个数或每个牙齿的尺寸是很难的。作为制作具有期望尺寸或形状的再生牙齿的方法，有人提出了将牙胚细胞混合物接种于由聚乙醇酸-聚乳酸共聚物等构成的生物可降解性聚合物的固化而形成的支架 (scaffold)上，再移植至动物体内而形成牙齿，其中，所述牙胚细胞混合物含有形成牙乳头或象牙质的来自牙髓的间叶细胞和有助于珐琅质形成的上皮细胞。在该方法中，尝试通过使用所需形状的支架来控制牙齿形状。然而，再生牙齿来自于由上皮细胞层与间叶细胞层构成的牙胚，而且已知牙胚是因上皮细胞层和间叶细胞层之间发生随时间的上皮-间叶相互作用而生长。因此，使用支架无法得到充分的细胞间相互作用，因而也有人建议最好不使用支架(例如参照非专利文献1)。此外，从牙齿形成的速度比支架分解时间快来说，可以预料会有可能形成混有支架的牙齿，而且细胞排列和牙齿形状的重现性未必高。另一方面，一般认为，如果重建牙胚中的间叶组织不完整，就无法获得正常的牙冠形状。但是，有人报道，使用间叶细胞凝集块(将组织通过酶处理等分离，并通过离心处理得到的凝集块)来代替间叶组织，如果进一步增加细胞数量，即可在体外(in vitro)培养中获得更大尺寸的牙胚，并且牙尖数也增加(例如参照非专利文献1)。然而，即使将该牙胚移植至生物体内，与正常牙齿相比，牙冠形状或牙尖数会发生变化，而无法获得正确形状的牙齿。在该报道中，即使是由上皮细胞凝集块和间叶细胞凝集块的组合构成的重建，也无法获得正确形状的牙齿。在该报道中，结果仅显示，在使用上皮组织与间叶细胞凝集块的重建中，虽然只要使用间叶组织就可以制作出正确的形态，但通过使细胞个数增加，只能部分消除牙齿制造中必须使用单一化的间叶细胞的限制。此外，有人报道在用上皮组织和间叶细胞凝集块制作重建牙胚时，若增加间叶细胞的数目，则制造的牙齿数目增加，但对牙齿的尺寸不产生影响(非专利文献2)。在该报道中，得出下述结论牙齿和牙尖的最终尺寸分别由间叶组织和上皮组织的内在因子决定， 即，间叶细胞和上皮细胞分别具有与牙齿和牙尖的最终尺寸有关的内在记忆。此外，本发明的发明人发现，作为控制所要制造的牙齿数目及形态的方法，可在使用上皮细胞集合体和间叶细胞集合体来制造重建牙胚时，使构成珐琅质结节的区域含有数目与牙齿的期望数目相同的上皮组织以形成上皮细胞集合体(专利文献幻。根据该方法， 可得到含有期望数目牙齿的牙齿集合体。然而，必须取得与目标牙齿的数目相同的上皮组织以组成构成珐琅质结节的区域。此外，专利文献5中未对牙齿尺寸的控制进行研究。[专利文献1]国际公开第2006/U9672号公报[专利文献2]日本特开2008-29756号公报[专利文献3]日本特开2008-206500号公报[专利文献4]日本特开2008-200033号公报[专利文献5]日本特开2008-29757号公报[非专利文献 l]Hu et al. Tissue Engineering Volume 12, Number 8,2006, 2069-2075[非专利文献2] J. Cai et al. Developmental Biology 304(2007)499-507

发明内容
[发明所要解决的问题]牙齿根据生长部位而具有适合其功能的尺寸及形状，即使是相同的白齿，依部位不同，其尺寸及形状也不同。此外，牙齿尺寸也存在个体差异。因此，在为了治疗缺失牙齿而制作再生牙胚或再生牙齿时，为了在移植的个体中发挥其适当的功能，控制尺寸是很重要的。此外，根据发明人的经验，再生牙胚的尺寸可依据各种条件加以变化，但由于细胞固有的“记忆”而无法高重现性地获得相同尺寸的牙齿。因此，本发明的目的在于提供一种制造具有期望尺寸的牙齿的方法，尤其是制造牙冠宽度为期望长度的牙齿的方法。[解决问题采用的手段]本发明的发明人为了解决上述问题进行多次深入研究，结果发现，再生牙齿的牙冠宽度取决于支持载体内部的间叶细胞集合体和上皮细胞集合体在预定方向上的接触长度，而不是取决于各自的细胞数目，因此，可以通过调节所述接触长度来控制再生牙齿的牙冠宽度。进一步地，发明人还发现，将间叶细胞和上皮细胞的集合体分别形成近似柱状时， 可以通过控制该柱在轴向上的接触长度来形成在一个方向上具有期望长度的牙齿；尤其是，可以通过将接触长度设定为期望长度的75% -125%，来制得具有该期望长度的再生牙齿；控制牙齿尺寸的同时，还可以控制牙尖数；可以通过将接触长度设定在预定的数值以下，来制得单个牙齿等，从而完成了本发明。S卩，本发明涉及〔1〕制造在一个方向上具有期望长度的牙齿的方法，所述方法包括下述步骤在支持载体内部以紧密接触的方式配置第一细胞集合体和第二细胞集合体，其中，所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体分别由间叶细胞与上皮细胞中的任一种构成；以及在所述支持载体内部对所述第一细胞集合体及所述第二细胞集合体进行培养；并且，所述方法通过调节所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体在预定方向上的接触长度来调节所述牙齿的尺寸。〔2〕制造在一个方向上具有期望长度的牙齿的方法，所述方法包括下述步骤通过改变第一细胞集合体和第二细胞集合体在预定方向的接触长度来制作多种构造体，其中，所述构造体是在支持载体内部以紧密接触的方式配置所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体而形成的，所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体分别由间叶细胞与上皮细胞中的任一种构成；在所述支持载体内部分别对所述多种构造体进行培养；测定前述步骤中制造的牙齿在所述方向上的长度，并求出该长度与所述接触长度的相关关系；基于所述相关关系，算出为制造在一个方向上具有期望长度的牙齿所需的所述第一细胞集合体与所述第二细胞集合体的接触长度；在支持载体内部以紧密接触的方式配置第一细胞集合体和第二细胞集合体，以使所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体具有前述步骤中算出的接触长度，其中，所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体分别由间叶细胞与上皮细胞中的任一种构成；以及在所述支持载体内部对所述第一细胞集合体和第二细胞集合体进行培养。。〔3〕制造在一个方向上具有期望长度的牙齿的方法，所述方法包括下述步骤通过改变近似柱状的第一细胞集合体和近似柱状的第二细胞集合体在轴向上的接触长度来制作多种构造体，其中，所述构造体是在支持载体内部以紧密接触的方式配置所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体以使各柱的轴向相互平行而形成的，所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体分别由间叶细胞与上皮细胞中的任一种构成；
在所述支持载体内部分别对所述多种构造体进行培养；测定前述步骤中制造的牙齿在所述方向上的长度，并求出该长度与所述接触长度的相关关系；基于所述相关关系，算出为制造在一个方向上具有期望长度的牙齿所需的所述第一细胞集合体与所述第二细胞集合体的接触长度；在支持载体内部以紧密接触的方式配置近似柱状的第一细胞集合体和近似柱状的第二细胞集合体，以使所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体在轴向上的接触长度达到前述步骤中算出的接触长度并使各柱的轴向相互平行，其中，所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体分别由间叶细胞与上皮细胞中的任一种构成；以及在所述支持载体内部对所述第一细胞集合体和第二细胞集合体进行培养。〔4〕制造在近远中方向和/或颊舌方向上具有期望长度的白齿的方法，所述方法包括下述步骤通过改变近似柱状的第一细胞集合体和近似柱状的第二细胞集合体在轴向和/ 或在垂直于轴的方向上的接触长度来制作多种构造体，其中，所述构造体是在支持载体内部以紧密接触的方式配置所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体，以使各柱的轴向互相平行而形成的，所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体分别由间叶细胞与上皮细胞中的任一种构成；在所述支持载体内部分别对所述多种构造体进行培养；测定前述步骤中制造的白齿在近远中方向和/或颊舌方向上的长度，并求出所述轴向上的接触长度与所述白齿在近远中方向上的长度的相关关系，和/或所述垂直于轴的方向上的接触长度与所述白齿在颊舌方向上的长度的相关关系；基于所述相关关系，算出为制造在近远中方向和/或颊舌方向上具有期望长度的臼齿所需的所述第一细胞集合体与第二细胞集合体在轴向和/或在垂直于轴的方向上的接触长度；在支持载体内部以紧密接触的方式配置近似柱状的第一细胞集合体和近似柱状的第二细胞集合体，以使所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体在轴向和/或在垂直于轴的方向上的接触长度达到前述步骤中算出的长度并使各柱的轴向互相平行，其中，所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体分别由间叶细胞与上皮细胞中的任一种构成；以及在所述支持载体内部对所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体进行培养。〔5〕制造在一个方向上具有期望长度的牙齿的方法，所述方法包括下述步骤在支持载体内部以紧密接触的方式配置近似柱状的第一细胞集合体和近似柱状的第二细胞集合体，以使各柱的轴向互相平行，所述第一细胞集合体与第二细胞集合体在轴向上的接触长度约为所述期望长度的75 % -125 %，其中，所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体分别由间叶细胞与上皮细胞中的任一种构成；在所述支持载体内部对所述第一细胞集合体及所述第二细胞集合体进行培养。〔6〕如上述〔5〕记载的方法，其中，在所述支持载体内部配置所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体的步骤包括下述步骤制作多个构造体，所述构造体是在所述支持载体内部配置所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体而形成的；测定所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体在轴向上的接触长度；以及选择所述测定的接触长度约为所述期望长度的75% -125%的构造体。〔7〕制造单个牙齿的方法，所述方法包括下述步骤在支持载体内部以紧密接触的方式配置第一细胞集合体和第二细胞集合体，其中，所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体分别由间叶细胞与上皮细胞中的任一种构成；以及在所述支持载体内部对所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体进行培养；并且，将所述第一细胞集合体与所述第二细胞集合体的最大接触长度设定在预定值以下。〔8〕如上述〔1〕至〔7〕中任一项记载的方法，其中，所述细胞集合体均为细胞凝集块。〔9〕如上述〔1〕至〔8〕中任一项记载的方法，其中，所述间叶细胞和所述上皮细胞中的至少一种来源于牙胚。〔10〕修复口腔内的牙齿缺损部分的方法，所述方法包括将采用上述〔1〕至〔9〕中任一项所述的方法制得的牙齿移植至所述缺损部分。〔11〕如上述〔10〕记载的方法，其中，所述方法是将上述〔1〕至〔9〕中任一项所述的方法制得的牙齿在不分成2个以上部分的情况下照原样移植至所述缺损部分。〔12〕如上述〔10〕或〔11〕记载的方法，其中，所述间叶细胞和所述上皮细胞来源于具有所述缺损部分的个体。〔13〕如上述〔10〕至〔12〕中任一项记载的方法，其中，所述口腔内为非人类的哺乳动物的口腔内。〔14〕设计方法，该方法用于设计在预定条件下制造在一个方向上具有期望长度的牙齿的方法，所述设计方法包括在以下情况下确定为制造具有期望尺寸的牙齿所需的第一细胞集合体和第二细胞集合体在一个预定方向上的接触长度的方法，所述情况为在支持载体内部以紧密接触的方式配置所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体，且所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体分别由间叶细胞与上皮细胞中的任一种构成；并且，所述确定接触长度的方法包括下述步骤通过改变所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体在预定方向的接触长度来制作多种构造体，其中，所述构造体是在所述支持载体内部以紧密接触的方式配置所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体而形成的，所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体分别由间叶细胞与上皮细胞中的任一种构成；在所述支持载体内部分别对所述多种构造体支持载体进行培养；测定前述步骤中制造的牙齿在所述方向上的长度，并求出该长度与所述接触长度的相关关系；基于所述相关关系，算出为制造在一个方向上具有期望长度的牙齿所需的所述第一细胞集合体与所述第二细胞集合体的接触长度。〔15〕设计方法，该方法用于设计在预定条件下制造单个牙齿的方法，其中，所述设计方法包括在以下情况下确定为制造单个牙齿所需的第一细胞集合体和第二细胞集合体的最大接触长度的方法，所述情况为在支持载体内部以紧密接触的方式配置所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体，且所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体分别由间叶细胞与上皮细胞中的任一种构成；并且，确定所述最大接触长度的方法包括下述步骤通过改变所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体的最大接触长度来制作多种构造体，其中，所述构造体是在支持载体内部以紧密接触的方式配置所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体而形成的，所述第一细胞集合体和第二细胞集合体分别由间叶细胞与上皮细胞中的任一种构成；在所述支持载体内部分别对所述多种构造体进行培养；测定前述步骤中制造的牙齿的个数，求出为制造该单个牙齿所需的所述第一细胞集合体与所述第二细胞集合体的最大接触长度。〔16〕如上述〔14〕或〔15〕记载的方法，其中，所述间叶细胞和所述上皮细胞中的至少一种来源于牙胚。[发明效果]根据本发明，当在支持载体内部以紧密接触的方式配置间叶细胞集合体与上皮细胞集合体，然后通过调节间叶细胞与上皮细胞在预定方向上的接触长度时，可控制制作的再生牙胚及再生牙齿在所述接触长度方向上的牙冠宽度。特别地，当将间叶细胞集合体与上皮细胞集合体形成近似柱状，然后通过控制该柱的轴向上的接触长度时，可形成在所述轴向上具有期望长度的牙齿。此外，依据本发明，也可设计用于制造牙齿的方法，所述方法包括确定接触长度以使得能够制造期望尺寸的牙齿。此外，根据本发明的方法，与各细胞集合体中含有的细胞数量无关，只要能得到预定的接触长度就能制造具有期望长度的牙齿，因此有可能以较少的细胞来有效地达到期望尺寸。进一步地，在本发明中，通过将各个细胞集合体之间的接触长度设定在预定值以下，可得到单个牙齿而非多个牙齿的集合体，因此不需经过分离步骤即可照原样作为移植片使用。


图1是表示在制作重建牙胚时，将上皮细胞集合体和间叶细胞集合体的接触长度设为450 μ m以下、450 μ m至900 μ m、900 μ m至1500 μ m的情况下，器官培养第0天、第2 天、第5天、第7天的相差显微镜像。图中箭头前端表示将来形成牙冠的牙冠区域的两端；图2是表示将来形成牙冠的牙冠区域的宽度的模式图，作为表示器官培养第7天的再生牙胚尺寸的指标，测定了所述牙冠区域的宽度；图3是表示在制作重建牙胚时，上皮细胞集合体和间叶细胞集合体的接触长度与器官培养第7天的再生牙胚尺寸之间关系的直方图；图4是表示在制作重建牙胚时，上皮细胞集合体和间叶细胞集合体的接触长度与器官培养第7天的再生牙胚尺寸之间关系的直线图；图5是表示牙冠宽度的模式图，作为表示通过将再生牙胚移植至肾包膜之下而生成的再生牙齿的尺寸指标，测定了所述牙冠宽度；图6是表示在制作重建牙胚时，将上皮细胞集合体和间叶细胞集合体的接触长度设为450 μ m以下、450 μ m至900 μ m、900 μ m至1500 μ m的情况下，肾包膜下移植第21天的
再生牙齿的实体显微镜像。图中箭头前端表示牙冠的两端；图7是表示在制作重建牙胚时，上皮细胞集合体和间叶细胞集合体的接触长度与肾包膜下移植第21天的再生牙齿的牙冠宽度之间关系的直方图；图8是表示在制作重建牙胚时，上皮细胞集合体和间叶细胞集合体的接触长度与肾包膜下移植第21天的再生牙齿的牙冠宽度之间关系的直线图；图9是在制作重建牙胚时，将上皮细胞集合体和间叶细胞集合体的接触长度设为 450 μ m以下、450 μ m至900 μ m、900 μ m至1500 μ m的情况下，肾包膜下移植后第21天的再生牙齿的计算机断层扫描(CT)影像；图10是表示在制作重建牙胚时，上皮细胞集合体和间叶细胞集合体的接触长度与肾包膜下移植21天后的再生牙齿的牙尖数之间关系的直线图；图11是表示在重建牙胚中，将圆柱状上皮细胞集合体和间叶细胞集合体的接触长度设于一定范围，在改变各个集合体中包含的细胞数目的情况下，对所得的再生牙胚的牙冠区域的宽度进行测定的结果；图12是表示在重建牙胚中，将圆柱状上皮细胞集合体和间叶细胞集合体的接触长度设于一定范围，在改变各个集合体中包含的细胞数目的情况下，对所得的再生牙齿的牙冠宽度进行测定的结果；以及图13是表示在重建牙胚中，将圆柱状上皮细胞集合体和间叶细胞集合体的接触长度设于一定范围，在改变各个集合体中包含的细胞数目的情况下，对所得的再生牙齿的牙尖数进行测定的结果。
具体实施例方式本发明所述的制造期望牙齿的方法包括在支持载体内部以紧密接触的方式配置第一细胞集合体和第二细胞集合体，其中，所述第一细胞集合体和第二细胞集合体分别由间叶细胞与上皮细胞中的任一种构成；以及在所述支持载体内部对所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体进行培养；并且，所述方法通过调节所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体在一个方向上的接触长度来调节牙齿的尺寸。在本发明中，“牙齿”是指连续具备内侧的象牙质层及外侧的珐琅质层的组织，同时意指具备有牙冠或牙根的方向性的组织。牙齿的方向性可由牙冠或牙根的排列来进行限定。可以根据形状或组织染色等目视确认牙冠或牙根。牙冠是指具有珐琅质和象牙质的层状构造的部分，牙根则不存在珐琅质层。本领域技术人员可以很容易地根据组织染色等对象牙质及珐琅质在其形态上进行限定。此外，珐琅质可以根据成釉细胞(enameloblast)的存在而进行限定，并且成釉细胞的存在可根据牙釉蛋白(amelogenin)的有无来进行确认。另一方面，象牙质可以根据成牙质细胞的存在而进行限定，并且成牙质细胞的存在可根据牙本质涎蛋白(dentinsialoprotein,DSP)的有无来进行确认。可以根据本领域公知的方法很容易地确认牙釉蛋白及牙本质涎蛋白，例如可列举原位杂交法(in situ hybridization)、抗体染色等。在本发明中，“牙胚”及“牙蕾”是基于生成阶段而特别提及以示区别时所使用的表达。此时的牙胚是指已确定将来会形成牙齿的初期胚，在牙齿的生成阶段普遍使用的从蕾状期(Bud stage)至钟状期(Bell stage)的阶段，尤其是未观察到作为牙齿坚硬组织特征的象牙质和珐琅质蓄积的组织。另一方面，“牙蕾”是指本发明中所使用的“牙胚”阶段之后的组织，从作为牙齿坚硬组织特征的象牙质和珐琅质蓄积开始的阶段，至牙齿从牙龈萌出并出现普通作为牙齿的功能之前的阶段的组织。从牙胚至牙齿的生成经历蕾状期、帽状期、钟状早期及钟状晚期等各个时期。在蕾状期，上皮细胞向间叶细胞以增厚的方式内陷， 在帽状期，上皮细胞则以包覆间叶细胞的方式内陷。到了钟状期早期及钟状期晚期，上皮细胞部分形成外侧的珐琅质，间叶细胞部分在内部形成象牙质。牙胚的生成通过由细胞因子 (cytokine)等介导的上皮细胞与间叶细胞的细胞间相互作用来控制而形成牙齿。在本发明中，“间叶细胞”是指来源于间叶组织的细胞及将该细胞进行培养得到的细胞，而“上皮细胞”是指来源于上皮组织的细胞及将该细胞进行培养得到的细胞。此外，在本发明中，“牙周组织”是指作为牙齿主要结构的、形成于外层的牙槽骨及牙根膜。本领域技术人员可以很容易地根据组织染色等对牙槽骨及牙根膜在其形态上进行限定。本发明中所述的“在支持载体内部以紧密接触的方式配置第一细胞集合体和第二细胞集合体，其中，所述第一细胞集合体和第二细胞集合体分别由间叶细胞与上皮细胞中的任一种构成的步骤(以下有时也称为“配置步骤”)”已经记载在例如专利文献1至5中， 其内容可全部引入本说明书以作为引证。所述第一细胞集合体和第二细胞集合体实质上分别仅由间叶细胞或仅由上皮细胞构成。“实质上仅由间叶细胞构成”在本发明中是指，该细胞集合体发挥与仅由间叶细胞构成的细胞集合体相同的功能，并尽可能不含除间叶细胞以外的细胞。“实质上仅由上皮细胞构成”的情况也相同。此处，细胞集合体是指细胞紧密接触的状态，可以是组织，也可以是由分散的细胞制备的细胞凝集块。如果使用组织，会易于制得细胞排列或形状正确的牙齿，但得到的数量会受限。由于细胞凝集块也可使用培养细胞，比较容易获得，因此优选细胞凝集块。根据本发明所述的方法，即便使用细胞凝集块也可制得细胞排列或形状正确的再生牙齿。对于构成细胞集合体的间叶细胞及上皮细胞，只要是由使用它们形成的重建牙胚来生成再生牙齿，其来源于生物体内的任何组织均可。优选地，从使重现生物体内的细胞排列并具有特有的构造和方向性的牙齿有效形成的观点来说，间叶细胞及上皮细胞中的至少一种来源于牙胚。更优选地，间叶细胞及上皮细胞均来源于牙胚。从细胞分化阶段的幼年性(juvenility)和均质性的观点来说，优选所述牙胚为蕾状期至帽状期的牙胚。作为来自于牙胚以外的间叶细胞，可以使用来自于生物体内其他间叶组织的细胞。优选为不含血液细胞的骨髓细胞或间叶细胞，更优选为口腔内间叶细胞或颚骨内部的骨髓细胞、来自于头部神经脊细胞的间叶细胞、可分化成这些间叶细胞的间叶前体细胞或其干细胞等。专利文献3中记载有使用来自羊膜的细胞作为间叶细胞的例子，专利文献4 中记载有使用将全能性干细胞分化诱导的细胞作为间叶细胞的例子，其内容可全部引入本说明书以作为引证。作为来自于牙胚以外的上皮细胞，可以使用来自于生物体内其他上皮组织的细胞。优选为皮肤或口腔内的黏膜或牙龈的上皮细胞，更优选为未成熟的上皮前体细胞，可分化成皮肤或黏膜等分化的例如角化的或不完全角化的上皮细胞，所述上皮前体细胞可以是例如非角化上皮细胞或其干细胞等。专利文献2记载有利用口腔内上皮细胞或其初代培养细胞作为上皮细胞的例子，其内容可全部引入本说明书以作为引证。牙胚及其他组织可以从哺乳动物的灵长类(例如人类、猿等)、有蹄类(例如猪、 牛、马等)、小型哺乳类的啮齿类(例如小鼠、大鼠、兔等)，还有犬、猫等各种动物的颚骨等中采取。牙胚及组织的采取直接应用组织采取中通常使用的条件即可，也可以在无菌状态下取出并保存在适当的保存液中。需要说明的是，作为人类的牙胚，除第三大臼齿即所谓智齿的牙胚之外，还可列举胎儿牙胚，但从利用自身组织的观点来说，优选使用智齿的牙胚。 此外，对于小鼠，优选使用胎龄为10天至16天的牙胚。对于由牙胚制备间叶细胞及上皮细胞，首先将分离自周围组织的牙胚根据形状分离成牙胚间叶组织及牙胚上皮组织。此时，可以使用酶来促进分离。作为酶，可列举分散酶 (dispase)、胶原酶(collagenase)、胰蛋白酶(trypsin)等。本发明的细胞凝集块是指来自于间叶组织或上皮组织的细胞凝集形成的物质，可以通过使零散地分散间叶组织或上皮组织而得到的细胞或由该细胞的初代或继代培养而得到的细胞凝集来制备。为了使细胞分散，可以使用分散酶、胶原酶、胰蛋白酶等酶类。为了得到足够的细胞数，在制备细胞凝集块之前进行分散细胞的初代或继代培养时，作为用于培养的培养基， 可以使用普遍用于动物细胞培养的培养基，例如达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco' s Modified Eagle' s Medium,DMEM)等。可以添加促进细胞增殖的血清，或者也可以添加替代血清的物质，例如FGF、EGF、PDGF等细胞增殖因子或转铁蛋白(transferrin)等已知血清成份。需要说明的是，添加血清时的浓度可以根据当时的培养状态加以适当改变，但通常可定为10%前后。细胞培养采用通常的培养条件，例如在温度约37°C、C02浓度5%的培养箱内进行培养。此外，还可以适当添加链霉素(str印tomycin)等抗生素。为了使细胞凝集，例如可对细胞悬浮液进行离心处理。在使间叶细胞及上皮细胞的细胞凝集块两者紧密接触时，优选预先使其各自呈高密度状态，以确保其进行细胞相互作用。高密度状态是指与构成组织时的密度大致相等的程度，例如5X IO7个细胞/ml IX IO9个细胞/ml，优选为IX IO8个细胞/ml 1 X IO9个细胞/ml，最优选为2X IO8个细胞/ml 8X IO8个细胞/ml。使细胞凝集块呈高密度的方法无特殊限定，例如可通过离心处理使细胞凝集并进行沉淀。离心处理因不损害细胞活性，并且可简便地实现高密度化，因此为优选方式。离心处理可使用施予300Xg 1200Xg、优选为500Xg IOOOXg离心力的旋转数进行3分钟 10分钟。低于300Xg的离心处理会无法充分提高细胞密度，而另一方面，高于1200Xg的离心处理有时会使细胞受到损伤。采用离心分离来制备高密度的细胞凝集块时，通常在用于细胞离心分离的管等容器中制备细胞悬浮液后，进行离心分离，留下作为沉淀物的细胞，再尽可能地除去上清液。 此时，优选的是目标细胞以外的成分(例如培养液、缓冲液等)的量不大于细胞容量，最优选的是不含目标细胞以外的成分。如果将这种高密度的细胞集合体按照下述方法在支持载
13体内紧密接触，细胞就会接触紧密，且有效地发挥细胞间相互作用。作为本发明所使用的支持载体，只要是能在其内部培养细胞的支持载体均可， 优选为与上述培养基的混合物。所述支持载体的材料无特殊限定，可列举例如胶原蛋白、琼脂糖凝胶、羧甲基纤维素、明胶、琼脂、水凝胶(hydrogel)、CellmatriX(商品名)、 MebiolgeK商品名)、Matrigel(商品名)、弹性蛋白、纤维蛋白(fibrin)、层粘连蛋白 (Iaminin)、细胞外基质混合物、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、乳酸/乙醇酸共聚物(PLGA) 等。这些支持载体可以在将细胞集合体配置在其内部时，具有大致能够维持配置位置的硬度，可列举凝胶状、纤维状、固体状的支持载体。其中，优选为具有适当硬度或保持力的胶原蛋白、琼脂糖凝胶、羧甲基纤维素、明胶、琼脂、水凝胶、Cellmatrix, Mebiolgel, Matrigel, 细胞外基质混合物、弹性蛋白、纤维蛋白、层粘连蛋白。能够维持细胞在其位置的硬度例如只要是可以适应三维培养的硬度均可，即，保持细胞排列的同时不阻碍因增殖引起的肥大化的硬度均可，本领域技术人员可以很容易地确定。此外，本发明使用的支持载体，可具备可保持细胞不分散并且细胞集合体呈紧密接触状态的保持力。紧密接触状态意味着上述高密度的间叶细胞及上皮细胞的细胞集合体，即使在间叶细胞与上皮细胞的接触面附近，也维持同等程度的高密度。可维持紧密接触状态的支持载体例如胶原蛋白，在最终浓度为ang/ml :3mg/ml的浓度，即根据以 JIS-K6503-1996为基准的方法(测定用直径12. 7mm的柱塞(plunger)压下4mm时所需的载荷(load))使凝胶强度(jelly strength)达到120g 250g的浓度下使用，可以提供适当的硬度。其他种类的支持载体只要是根据相同的评定方法具有相同的强度，均可以优选作为本发明的支持载体使用。此外，也可以通过将一种或多种支持载体混合，来获得与目标凝胶强度相当的硬度的支持载体。将第一及第二细胞集合体配置在支持载体内的方法并无特殊限定，然而细胞集合体为细胞凝集块时，例如上述离心分离得到的沉淀物，可用微量注射器(microsyringe)等将其插入支持载体内进行配置。当细胞集合体为组织时，可利用注射器的针尖等将其配置在支持载体内的任意位置。在本发明中，将第一和第二细胞集合体以彼此紧密接触的方式配置在支持载体内的方法并无特殊限定，例如，可将一种细胞集合体配置在支持载体内以后，再将另一种细胞集合体以按压于其上的方式配置，使两者紧密接触。更具体而言，在支持载体内适当改变上述注射器针尖的位置，可使其中一种细胞集合体按压于另一种细胞集合体上。需要说明的是，当细胞集合体采用上皮组织或间叶组织时，优选使该组织的在原来牙胚中与间叶组织或上皮组织接触的面与另一种细胞集合体接触来配置。此外，优选在配置后设置对支持载体进行固化的步骤。由此，细胞可进一步凝集， 达到更高密度的状态。例如为胶原蛋白凝胶时，可通过在培养温度下静置数分钟 数十分钟进行固化。此时，细胞集合体内除细胞以外的成分越少越能实现更高密度的状态。本发明中的“在支持载体内部对所述第一细胞集合体及所述第二细胞集合体进行培养的步骤(以下，有时也称为“培养步骤”)”已记载于例如专利文献1至5中，其内容可全部引入本说明书以作为引证。培养时间根据配置在支持载体内部的细胞数、细胞集合体的状态、培养条件、动物种类等不同，本领域技术人员可进行适当选择。移植至口腔内时，为使其作为功能性牙齿长出，优选为培养至少1天，更优选为3天以上。通过延长培养时间可进一步促进重建牙胚的形成，以累积象牙质与珐琅质并形成牙冠与牙根。为了得到期望的状态，可培养例如6天以上、30天以上、50天以上、100天以上或300天以上，也可在培养过程中改变培养基或培养条件。对于支持载体内部的培养步骤，可以将其内部包覆有第一及第二细胞集合体的支持载体单独培养，也可在其他动物细胞等的存在下培养。单独培养支持载体时，培养条件可采用一般动物细胞培养时使用的条件。此外，在培养过程中，可添加来源于哺乳动物的血清，也可添加已知的可促进这些细胞增殖或分化的各种细胞因子。作为此类细胞因子，可列举FGF、BMP等。从细胞集合体的气体交换或营养供给的观点，以及不与其他动物细胞接触或混合并且能够在体外(in vitro)进行所有步骤的观点来说，将支持载体内部的培养优选为器官培养。在器官培养中，一般是在适于动物细胞增殖的培养基上使多孔性膜漂浮(float)，将内部包覆有第一及第二细胞集合体的支持载体载置于该膜上再进行培养。此处使用的多孔性膜优选具有多个0.3 5μπι左右的孔，例如可列举Cell Culture Insert(商品名)或 Isopore Filter(商品名)。另一方面，如果支持载体内部的培养在其他动物细胞的存在下进行，可受到来自动物细胞的各种细胞因子等的作用，而形成在早期具有特有的细胞排列的牙齿。在其他动物细胞的存在下进行培养时，可以利用分离细胞或培养细胞在生物体外培养，也可将每个内部包覆有第一及第二细胞集合体的支持载体移植至生物体来培养。特别是，由于可以在早期形成牙齿和/或牙周组织，因此优选移植至生物体内进行的培养。作为生物体所采用的动物可列举哺乳动物，优选为猪、鼠等非人类的哺乳动物， 最优选为与牙胚组织相同种属的动物。移植至与牙胚组织不同种属的动物进行培养时，优选使用改造成免疫不全的动物。作为适于生物体内生成生成的生物体部位，为了使动物细胞的器官或组织尽可能地正常生成，优选为肾包膜下、肠系膜(mesentery)、皮下等。移植后的培养时间根据移植时的牙齿尺寸和生成成的牙齿尺寸而不同，但一般可定为3天 400天。例如，移植至肾包膜下时，根据移植的牙胚尺寸和再生的牙齿尺寸也不同，但优选为7天 60天左右。移植至生物体培养时，也可在生物体外进行预培养。通过预培养，可巩固细胞间的结合和第一及第二细胞集合体间的结合，并进一步巩固细胞间相互作用。结果，细胞间相互作用得到巩固，并能够缩短整体的生长生成时间。预培养的时间无特殊限定，但由于通过例如3天以上，优选为7天以上的预培养， 可使牙胚成长为牙蕾，因此可以缩短移植后的培养时间。例如，当移植至肾包膜下并进行培养，且进行器官培养作为其预培养时，该器官培养优选设为1 7天。由上述配置步骤及培养步骤得到的牙齿具有牙齿特有的细胞排列(构造)，即内侧为象牙质，外侧为珐琅质，优选在正确位置上具有牙齿前端(牙冠)和牙根的方向性，并且能充分发挥作为牙齿的功能。因此，可广泛用作牙齿的替代物。此外，可用作对阐明牙齿生成过程研究有用的研究工具。进一步地，通过延长培养时间，除了可形成牙齿本身之外，还可形成将牙齿支撑于颚骨上并固定的牙槽骨或牙根膜等牙周组织。由此，可进一步提高移植后的牙齿的实用性。此外，还可以仅分离使用牙周组织。本发明的特征在于，在上述配置步骤中，通过调节第一细胞集合体与第二细胞集合体在预定方向上的接触长度，来调节由此得到的牙齿在一个方向上的长度。接触长度可依据配置在支持载体内的细胞集合体的尺寸、形状、位置等来进行调节。例如，使用微量注射器将细胞凝集块配置在支持载体内时，通过改变注射器的针径，或者一边挤压出细胞凝集块，一边使针尖在支持载体内移动，可适当改变细胞集合体的尺寸、 形状、位置，并可调节两个细胞集合体在任意方向的接触长度。当使用间叶组织与上皮组织作为细胞集合体时，通过在配置在支持载体内之前调节该组织的形状或尺寸，并调节将其配置在支持载体内的位置，可调节两个细胞集合体的接触长度。此外，本发明中所述的“接触长度的调节”还包含通过制作多个构造体(在构造体中，以紧密接触的方式在支持载体内配置第一及第二细胞集合体)，测定两个细胞集合体的接触长度，并选择所测定的接触长度为期望长度的构造体，可制得具有期望接触长度的重建牙胚。接触长度的测定可通过例如相差显微镜来观察而进行。此处，牙齿在一个方向上的长度意指任意方向上的牙冠宽度，例如，优选采用颊舌方向(垂直于牙列的方向)的宽度或近远心(mesiodistal)方向(与牙列平行的方向)的宽度，但不限于上述这些宽度。本领域技术人员可适当进行牙冠宽度的测定。需要说明的是，若调节第一细胞集合体与第二细胞集合体在预定的一个方向上的接触长度而形成再生牙胚，通常，对于已生成的牙齿的牙冠，可调节其与接触长度同一方向的长度。本发明所述的制造在一个方向上具有期望长度牙齿的方法的一个实施方式，包括下述步骤通过改变第一细胞集合体和第二细胞集合体在预定方向的接触长度来制作多种构造体，其中，所述构造体是在支持载体内部以紧密接触的方式配置所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体而形成的；在所述支持载体内部分别对所述多种构造体进行培养； 测定前述步骤中制造的牙齿在所述方向上的长度，并求出该长度与所述接触长度的相关关系；基于所述相关关系，算出为制造在一个方向上具有期望长度的牙齿所需的所述第一细胞集合体与所述第二细胞集合体的接触长度。可按照上述配置步骤、培养步骤及接触长度的调节方法的说明来进行以下步骤 通过改变第一细胞集合体和第二细胞集合体在预定方向的接触长度来制作多种构造体，其中，所述构造体是在支持载体内部以紧密接触的方式配置所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体而形成的；然后在所述支持载体内部分别对所述多种构造体进行培养的步骤。接触长度与牙齿在一个方向上的相关关系可按照公知方法或以其为基准的方法来求出。例如，可制作表示接触长度与牙齿长度(牙冠宽度)的关系的各种图表，也可制作表示接触长度与牙齿长度的关系的关系式。另外，还可以调查提供某牙齿长度的接触长度的分布，确定提供预定牙齿尺寸的接触长度的范围。基于求出的相关关系，算出为制造在一个方向上具有期望长度的牙齿所需的所述第一细胞集合体与所述第二细胞集合体的接触长度的步骤，可将例如上述关系式或图表中求出的牙齿尺寸内推来执行。这样，确定所需的接触长度后，在与关于上述多个构造体的配置步骤大致相同的条件下，在支持载体内以所述接触长度配置第一细胞集合体与第二细胞集合体使其紧密接触，在与关于上述多个构造体的培养条件大致相同的条件下进行培养，可制得期望尺寸的牙齿。此处，“大致相同的条件^t指使接触长度相同时，能够以高重现性制得在一个方向上具有相同长度的牙齿的条件。在用于确定接触长度的配置步骤、培养步骤，与用于制造在一个方向上具有期望长度的牙齿的配置步骤、培养步骤中，优选使培养条件相同，例如支持载体的种类、温度、培养基的组成、培养场所(器官培养或活体内培养)等。此外，在将第一及第二细胞集合体配置在支持载体内时，在将来生成的牙齿中假定会成为应具有期望长度的部位的部分，其接触长度优选为上述所算出的长度。第一及第二细胞集合体的接触面的哪个方向在将来生成的牙齿中会成为哪个方向，可由本领域技术人员进行适当确定。例如，在制造近远中方向的长度A长于颊舌方向的长度B的臼齿时，以使第一及第二细胞集合体的接触面呈大体为长方形，并使其较长的边成为提供近远中方向的长度A的接触长度的方式来配置即可。此外，本发明所述的制造在一个方向上具有期望长度的牙齿的方法的其他实施方式，包括下述步骤通过改变所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体在轴向上的接触长度，来制作多种构造体，其中，所述构造体是在支持载体内部以紧密接触的方式配置近似柱状的第一细胞集合体和第二细胞集合体以使各柱的轴向平行而形成，所述近似柱状的第一细胞集合体和第二细胞集合体分别由间叶细胞与上皮细胞中的任一种构成；将所述多种构造体在所述支持载体内部分别进行培养；测定上述步骤中制造的牙齿在所述方向上的长度，并求出该长度与所述接触长度的相关关系；基于所述相关关系，算出为制造在一个方向上具有期望长度的牙齿所需的所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体的接触长度。制作多种接触长度不同的构造体的步骤与随后的培养步骤，可按照上述配置步骤、培养步骤、接触长度的调节方法等的说明来进行。接触长度与牙齿在一个方向上的长度的相关关系，如上所述，可由关系式、图表等表示，还可确定提供预定的牙齿长度的接触长度的范围。然后，基于所述相关关系，可求出所需的所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体的接触长度，以制得在一个方向上具有期望长度的牙齿。在本发明中，“近似柱状”是指在一个方向上延伸的细长形状，例如近似圆柱状、近似角柱状等。当细胞集合体为组织时，可将组织形成近似柱状后配置在支持载体内。此外， 当细胞集合体为细胞凝集块时，可通过将例如微量注射器的针尖配置在支持载体内，一边移动针尖一边挤压出细胞，在支持载体内配置大体为圆柱状的细胞凝集块。这样，确定所需的接触长度后，在与关于上述多个构造体的配置步骤大致相同的条件下，在支持载体内以所述接触长度配置近似柱状的第一细胞集合体与第二细胞集合体而使其紧密接触，在与关于上述多个构造体的培养条件大致相同的条件下进行培养，可制得在一个方向上具有期望尺寸的牙齿。本发明所述的牙齿制造方法的其他实施方式为制造在近远中方向和/或颊舌方向上具有期望长度的白齿的方法，包括下述步骤通过改变所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体在轴向和/或垂直于轴的方向上的接触长度，来制作多种构造体，其中，所述构造体是在支持载体内部以紧密接触的方式配置近似柱状的第一细胞集合体和第二细胞集合体以使各柱的轴向平行而形成，所述近似柱状的第一细胞集合体和第二细胞集合体分别由间叶细胞与上皮细胞中的任一种构成；将所述多种构造体在所述支持载体内部分别进行培养；测定上述步骤中制造的白齿在近远中方向和/或颊舌方向上的长度，并求出所述轴向上的接触长度与白齿在近远中方向上的长度的相关关系，和/或所述垂直于轴的方向上的接触长度与白齿在颊舌方向上的长度的相关关系。如上所述，一般而言，由于臼齿在近远中方向上的宽度大于颊舌方向上的宽度，因此将细胞集合体制成柱状时，可通过控制轴向上的接触长度来控制近远中方向的牙冠宽度，通过控制垂直于轴的方向上的接触长度来控制颊舌方向的牙冠宽度。轴向的接触长度和垂直于轴的方向的接触长度的变化，可采用任何方法进行，例如，可通过改变柱状细胞集合体的长度、直径、两细胞集合体的轴之间的距离等来进行。细胞集合体为组织时，可通过配置在支持载体内之前，形成期望的直径与长度，并调节在支持载体内的位置，从而改变轴向的接触长度及垂直于轴的方向的接触长度。此外，当细胞集合体为细胞凝集块时，例如使用微量注射器配置在支持载体内时，可提供改变针径来改变细胞集合体的直径，再通过改变针尖在支持载体内移动的距离，可改变细胞集合体在轴向上的长度。此外，在配置一个细胞集合体后，通过调节配置另一个细胞集合体的位置，可改变两个细胞集合体的两轴之间的距离。通过使两轴之间的距离更靠近而使两者互相挤压来配置，细胞集合体的接触面一般会变大，因此，可改变轴向的接触长度及垂直于轴的方向的接触长度。其他的配置步骤、培养步骤、求出各种长度的相关关系的步骤等可根据已经说明的方法来进行。这样，确定轴向的接触长度和/或垂直于轴的方向的接触长度后，在与关于上述多个构造体的配置步骤大致相同的条件下，在支持载体内以所述接触长度配置近似柱状的第一细胞集合体与第二细胞集合体而使其紧密接触，在与关于上述多个构造体的培养条件大致相同的条件下进行培养，可制得在近远中方向和/或颊舌方向上具有期望尺寸的臼齿。此外，本发明所述的制造在一个方向上具有期望长度的牙齿的方法的其他实施方式，在配置步骤中包括下述步骤在支持载体内部配置第一细胞集合体和第二细胞集合体而使其以近似柱状紧密接触，并使各柱的轴向平行，所述第一及第二柱状细胞集合体在轴向上的接触长度为所述期望长度的75% -125%，优选为90% -110%。如下所述，本发明的发明人等发现，在支持载体内部以紧密接触的方式配置近似圆柱状的间叶细胞凝集块与上皮细胞凝集块以使圆柱的轴向平行时，所制造的牙齿的长度取决于该圆柱在轴向上的接触长度。更进一步发现，通过将接触长度定为期望长度的约75% -125%，优选为约90% -110%，可制得近远中方向的牙冠宽度为期望长度的牙齿。 因此，例如，要制作近远中方向的牙冠宽度为约Χμπι的牙齿时，只要将第一及第二细胞集合体制成近似柱状，并将轴向的接触长度定为0. 75X μ m 1. 25X μ m,优选为0. 9X μ m 1. ΙΧμπι左右即可。控制近似柱状的第一及第二细胞集合体的接触长度的方法可按照已经说明的方法来进行。此外，不需准备轴向上具有目标长度的细胞集合体，即可制作多个构造体(所述构造体是在所述支持载体内部以紧密接触的方式配置近似柱状的第一及第二细胞集合体而形成的)，并测定两细胞集合体在轴向上的接触长度，选择所测定的接触长度为目标长度的构造体，所述构造体可用于培养步骤。接触长度的测定可通过例如采用相差显微镜观察而进行。此外，本发明所述的制造单个牙齿的方法，其特征在于包括下述步骤在支持载体内部以紧密接触的方式配置第一细胞集合体和第二细胞集合体其中，所述第一细胞集合体和第二细胞集合体分别由间叶细胞与上皮细胞中的任一种构成；以及将所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体在所述支持载体内部进行培养；并且，将所述第一细胞集合体和第二细胞集合体的最大接触长度设定在预定值以下。本发明的发明人等也发现，专利文献1的方法中，在得到不想获得的牙齿的集合体的情况下，可通过控制第一及第二细胞集合体的接触长度并控制牙齿尺寸，从而获得重现性良好的单个牙齿。可认为这是由于在预定距离内未形成一个以上第一珐琅质结节而引起的，所述第一珐琅质结节规定在牙胚上形成的牙齿数目。只要能制造单个牙齿，在移植得到的牙齿前无需进行分离即可使用。需要说明的是，在本发明所述的制造单个牙齿的方法中，“最大接触长度”是指第一细胞集合体与第二细胞集合体的接触面所包含的任意直线中最长的直线的长度。此外，将本发明所述的制造单个牙齿的方法应用于小鼠时，优选将第一及第二细胞集合体的接触长度设为3000μπι以下，更优选为1500μπι以下。需要说明的是，所述接触长度优选为100 μ m以上，更优选为200 μ m以上。接触长度的控制可按照上文所述的说明来进行。在本发明中，单个牙齿是指可作为一颗牙齿移植至活体内的构造，其特征为牙冠、 牙根、牙髓、象牙质呈连续状态，并且每个牙齿的周围均形成牙根骨或牙槽骨。只要是本领域技术人员，即可容易地检定出制造的牙齿的颗数。本发明所述的修复口腔内的牙齿缺损部分的方法包括将采用本发明所述的牙齿制造方法制得的牙齿移植至缺损部分的步骤。根据本方法，可制造并移植符合缺损部分尺寸的牙齿。本发明所述的修复口腔内的牙齿缺损部分的方法中，也可移植采用本发明方法制得的牙胚或牙齿的任一阶段。如果观察到已形成牙冠，优选使牙冠处于口腔内侧。在未观察到牙冠形成时，优选使相当于牙冠部分的上皮细胞层或重建牙胚的上皮细胞层处于口腔内侧。此外，优选使重建牙胚的上皮、间叶细胞层的开放部分处于口腔内侧的相反侧。据此， 可使牙齿前端部(牙冠)处于口腔内侧，并使其具有与周围牙齿相同的方向性。缺损部分是指因拔牙等而形成于牙龈的部分，形状上无特殊限制。只要可以埋设再生牙胚或牙齿，缺损位置或作为目标的牙齿的种类并无特殊限定。缺损部分通常位于颚骨、口腔的牙槽骨等位置。此外，随着牙齿缺失而牙槽骨含量降低时，对于缺损部分，可以通过GTR法(guided tissue regeneration 引导组织再生术) 等临床上常用于埋设植入物的公知方法，使骨再生并增加骨量。优选将牙胚或牙齿配置于孔部之后，按照一般处理进行缝合等。本发明所述的修复口腔内的牙齿缺损部分的方法中，优选移植对象为与被取出用于制造牙齿的牙胚的动物同种的动物，更优选为与被取出牙胚的个体相同的个体。作为动物，可列举包含人类、牛、马、猪、犬、猫、小鼠等在内的哺乳动物。优选为非人类的哺乳动物。此外，本发明还提供一种设计方法，该方法用于设计在预定条件下制造在一个方向上具有期望长度的牙齿的方法。预定条件下是指特别指定支持载体、培养基、培养方法等
19的条件。在所述预定条件下实施所设计的制造方法，可制得在一个方向上具有期望长度的牙齿，所述制造方法是根据设计方法设计的，所述设计方法用于设计在预定条件下制造在一个方向上具有期望长度的牙齿的方法。本发明所述的上述设计方法包含在以下情况下确定为制造具有期望尺寸的牙齿所需的第一细胞集合体和第二细胞集合体在一个预定方向上的接触长度的方法，所述情况为在支持载体内部以紧密接触的方式配置所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体，且所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体分别由间叶细胞与上皮细胞中的任一种构成。此处，确定所述接触长度的方法包括下述步骤通过改变所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体在预定方向上的接触长度，来制作多种构造体，其中，所述构造体是在支持载体内部以紧密接触的方式配置第一细胞集合体和第二细胞集合体而形成的，所述第一细胞集合体和第二细胞集合体分别由间叶细胞与上皮细胞中的任一种构成；将所述多种构造体在所述支持载体内部分别进行培养；测定上述步骤中制造的牙齿在所述方向上的长度，并求出接触长度与牙齿尺寸的相关关系；基于所述相关关系，算出为制造在一个方向上具有期望长度的牙齿所需的所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体的接触长度。此外，本发明还提供一种设计方法，该方法用于设计在预定条件下制造单个牙齿的方法。本发明的上述设计方法包含在以下情况下确定为制造单个牙齿所需的第一细胞集合体和第二细胞集合体的最大接触长度的方法，所述情况为在支持载体内部以紧密接触的方式配置所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体，且所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体分别由间叶细胞与上皮细胞中的任一种构成。并且，确定最大接触长度的方法包括下述步骤通过改变所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体的最大接触长度来制作多种构造体，其中，所述构造体是在支持载体内部以紧密接触的方式配置第一细胞集合体和第二细胞集合体而形成的，所述第一细胞集合体和第二细胞集合体分别由间叶细胞与上皮细胞中的任一种构成；将所述多种构造体在所述支持载体内部分别进行培养；测定上述步骤中制造的牙齿的个数，以求出为制造该单个牙齿所需的所述第一细胞集合体与所述第二细胞集合体的最大接触长度。需要说明的是，本说明书中所使用的术语是用于说明特定的实施方式，并非意图限定发明。此外，本说明书中所使用的术语“包含”意指除了上下文中应该具有明确不同的理解的场合之外，记载的事项(构件、步骤、要素、数字等)均存在，并且不排除除此之外的事项(构件、步骤、要素、数字等)存在。除非另有定义，此处所使用的所有术语(含技术术语及科学术语)均具有与本发明所属技术领域的技术人员所普遍理解的含义相同的含义。此处所使用的术语除非另有定义，均应被解释为具有与本说明书及相关技术领域中的含义相一致的含义，不应被解释为理想化的或过度形式上的含义。本发明的实施方式虽有参照附图来进行说明的场合，但采用附图时，为使说明明确，有夸张表达的场合。“第一”、“第二”等术语是为了表达各种要素而使用，但应理解所述要素不应受到所述术语的限定。所述术语仅仅是为了将一个要素与其他要素区分而使用，例如，将第一要素记为第二要素，同样将第二要素记为第一要素，并未脱离本发明的范围。即使在上述设计方法中，只要是由使用间叶细胞及上皮细胞所形成的重建牙胚来生成再生牙齿，所述间叶细胞及上皮细胞可来自于生物体内的任何组织。优选至少一种来源于牙胚，更优选两种均来源于牙胚。以下，将列举实施例对本发明进行更具体的说明。但是，本发明可根据各种实施方式来进一步具体实施，不应被解释为局限于此处所记载的实施例。[实施例](1)牙胚上皮细胞与牙胚间叶细胞的制备进行牙胚重建以形成牙齿。使用小鼠作为实验模型。在显微镜下根据一般方法从C57BL/6N小鼠(购自日本SLC)的胎龄为14. 5天的胎仔中取出下颚臼齿牙胚组织。将下颚臼齿牙胚组织用不含Ca2+、Mg2+的磷酸缓冲液(PBS(-)) 洗净，用PBS(-)中添加有最终浓度为50U/mL的分散酶(BD，Massachusetts, USA)的酵素液在室温下处理2分钟后，用添加有10%胎牛血清(FBS, Invitrogen, Carlsbad, CA)的 DMEM(Sigma, St. Louis,MO)洗净 3 次。接着，添加 DNase I 溶液(Takara，Shiga，日本)，使最终浓度成为70U/mL，并分散牙胚组织，使用25G注射针(Terumo，东京，日本)以外科方式来分离牙胚上皮组织与牙胚间叶组织。将牙胚上皮组织用PBS (_)洗净3次，用PBS (_)中溶有最终浓度为100U/mL的胶原酶I (Worthington，Lakewood, NJ)的酵素液于37°C处理30分钟，并重复该处理2次。 将通过离心分离沉淀回收的细胞，进一步用PBS(-)中溶有最终浓度为0. 25%的胰蛋白酶 (Sigma)的酵素液于 37°C处理 10 分钟。用添加有 10% FBS(Invitrogen)的 DMEM(Sigma) 将细胞洗净3次后，向细胞中添加最终浓度为70U/mL的DNase I (Takara)溶液，通过移液 (pipetting)得到零散分离的牙胚上皮细胞的悬浮液。另一方面，将牙胚间叶组织用PBS(-)洗净3次，用PBS(-)中溶有最终浓度为 100U/mL的胶原酶I (Worthington)的酵素液于37°C进行处理20分钟。接着，用含有0. 25% 的胰蛋白胸(Sigma)与100U/mL的胶原酶I (Worthington)的PBS(-)处理10分钟。添加 70U/mL的DNase I (Takara)，通过移液(pipetting)得到零散分离的牙胚间叶细胞的悬浮液。(2)重建牙胚的制作接下来，采用上述制备的牙胚上皮细胞及牙胚间叶细胞，进行牙胚重建。在涂布有硅脂(slicon grease)的1.5mL微离心管(Eppendorf，汉堡，德国)中，加入用添加有 10% FBS(Invitrogen)的DMEM(Sigma)混悬的牙胚上皮细胞或牙胚间叶细胞，以600Xg 离心分离3分钟，将细胞沉淀并再次回收。尽可能地除去离心后的培养液的上清液，再次以600Xg进行离心操作3分钟，并一边用实体显微镜观察，一边使用GELoader Tip 0. 5-20yL(eppendorf)来完全除去残存在细胞沉淀周围的培养液。在涂布有硅脂的培养皿(Petridisti)中滴入 30 μ L Cellmatrix type I_A(Nitta gelatin，大阪，日本)，制作作为支持载体的胶原蛋白凝胶微滴(collagen gel droplet)。 在该溶液中，使用Hamilton注射器(7105KH PT-3, HAMILTON, Reno, NV)定量配置牙胚间叶细胞离心后的沉淀，制作作为圆柱状细胞集合体的细胞凝集块。然后，将与牙胚间叶细胞等量的牙胚上皮细胞采用同样的方法配置，制成细胞凝集块，使其与先制作的牙胚间叶细胞的圆柱状细胞凝集块在轴向上平行，并且使侧面彼此紧密接触，以制作重建牙胚。其后，于37°C静置20分钟，使胶原蛋白凝胶微滴固化并使两个细胞凝集块的结合更加巩固。将固形化的重建牙胚移至培养容器中的细胞培养小室(Cell Culture Insert) 的膜上，按照细胞培养小室上的一般方法，于37°C、95% RH,5% CO2的条件下进行器官培养。该培养容器是为了使细胞培养小室(孔径为0. 4微米的PET薄膜；BD)连接至添加有 10% FBS(Invitrogen)的 DMEM(Sigma)而设置的。(3)由器官培养得到的再生牙胚尺寸的分析配置上皮细胞与间叶细胞的各个圆柱状细胞凝集块，分别以450 μ m以下、450 μ m 至900 μ m、900 μ m至1500 μ m的长度彼此紧密接触，形成3组重建牙胚，并通过器官培养来形成再生牙胚(图1)。细胞凝集块之间紧密接触的长度使用相差显微镜进行测定。为了分析再生牙胚的牙冠区域的宽度，在器官培养第7天的再生牙胚中，利用相差显微镜来测定图2箭头前端所包夹的将来形成牙冠的牙冠区域的宽度。测定部位在图1 第7天的照片中用箭头表示。测定结果示于图3。接触长度为450μπι以下的，其牙冠区域的宽度为 366 士 103. Ιμπι ;450μπι 至 900μπι 的为 584. 0 士 103. 3 μ m ;900 μ m 至 1500 μ m 的为 934. 9 士 239. 8 μ m。由此可以看出，重建牙胚形成时，上皮细胞集合体与间叶细胞集合体的接触长度越长，会形成牙冠区域的宽度越大的再生牙胚。此外，图4为接触长度与牙冠区域的宽度的测定值的分布图，图中直线通过最小二乘法进行线性模拟得到。表示直线的关系式为“y = 0. 7114X+133. 95”。(4)由肾包膜下移植得到的再生牙齿尺寸的分析在深度麻醉下，将位于8周龄C57BL/6小鼠的肾脏上方背侧的毛剃除，再切开皮肤与腹膜约1cm，使用环形针组(ring pin set) (Natsume，东京，日本)取出肾脏。使用剃刀 (!father，东京，日本)切开肾包膜约2 3mm，再将实施例⑵所示的接触长度不同的3组重建牙胚连同胶原蛋白凝胶(collagen gel)挤入于肾脏与肾包膜之间，将肾脏放回体内， 分别缝合肌肉层与皮肤。在肾包膜下移植后第21天取出再生牙齿。取出的再生牙齿示于图6。将图6中箭头前端包夹的部分作为牙冠宽度，用实体显微镜进行测定。测定结果示于表1。[表 1]
权利要求
1.制造在一个方向上具有期望长度的牙齿的方法，所述方法包括下述步骤在支持载体内部以紧密接触的方式配置第一细胞集合体和第二细胞集合体，其中，所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体分别由间叶细胞与上皮细胞中的任一种构成；以及在所述支持载体内部对所述第一细胞集合体及所述第二细胞集合体进行培养； 并且，所述方法通过调节所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体在预定方向上的接触长度来调节所述牙齿的尺寸。
2.制造在一个方向上具有期望长度的牙齿的方法，所述方法包括下述步骤 通过改变第一细胞集合体和第二细胞集合体在预定方向的接触长度来制作多种构造体，其中，所述构造体是在支持载体内部以紧密接触的方式配置所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体而形成的，所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体分别由间叶细胞与上皮细胞中的任一种构成；在所述支持载体内部分别对所述多种构造体进行培养；测定前述步骤中制造的牙齿在所述方向上的长度，并求出该长度与所述接触长度的相关关系；基于所述相关关系，算出为制造所述的在一个方向上具有期望长度的牙齿所需的所述第一细胞集合体与所述第二细胞集合体的接触长度；在支持载体内部以紧密接触的方式配置第一细胞集合体和第二细胞集合体，以使所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体具有前述步骤中算出的接触长度，其中，所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体分别由间叶细胞与上皮细胞中的任一种构成；以及在该支持载体内部对所述第一细胞集合体和第二细胞集合体进行培养。
3.制造在一个方向上具有期望长度的牙齿的方法，所述方法包括下述步骤 通过改变近似柱状的第一细胞集合体和近似柱状的第二细胞集合体在轴向上的接触长度来制作多种构造体，其中，所述构造体是在支持载体内部以紧密接触的方式配置所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体以使各柱的轴向相互平行而形成的，所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体分别由间叶细胞与上皮细胞中的任一种构成； 在所述支持载体内部分别对所述多种构造体进行培养；测定前述步骤中制造的牙齿在所述方向上的长度，并求出该长度与所述接触长度的相关关系；基于所述相关关系，算出为制造所述的在一个方向上具有期望长度的牙齿所需的所述第一细胞集合体与所述第二细胞集合体的接触长度；在支持载体内部以紧密接触的方式配置近似柱状的第一细胞集合体和近似柱状的第二细胞集合体，以使所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体在轴向上的接触长度达到前述步骤中算出的接触长度并使各柱的轴向相互平行，其中，所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体分别由间叶细胞与上皮细胞中的任一种构成；以及在所述支持载体内部对所述第一细胞集合体和第二细胞集合体进行培养。
4.制造在近远中方向和/或颊舌方向上具有期望长度的白齿的方法，所述方法包括下述步骤通过改变近似柱状的第一细胞集合体和近似柱状的第二细胞集合体在轴向和/或在垂直于轴的方向上的接触长度来制作多种构造体，其中，所述构造体是在支持载体内部以紧密接触的方式配置所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体，以使各柱的轴向互相平行而形成的，所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体分别由间叶细胞与上皮细胞中的任一种构成；在所述支持载体内部分别对所述多种构造体进行培养；测定前述步骤中制造的白齿在近远中方向和/或颊舌方向上的长度，并求出所述轴向上的接触长度与所述白齿在近远中方向上的长度的相关关系，和/或所述垂直于轴的方向上的接触长度与所述白齿在颊舌方向上的长度的相关关系；基于所述相关关系，算出为制造所述的在近远中方向和/或颊舌方向上具有期望长度的臼齿所需的所述第一细胞集合体与第二细胞集合体在轴向和/或在垂直于轴的方向上的接触长度；在支持载体内部以紧密接触的方式配置近似柱状的第一细胞集合体和近似柱状的第二细胞集合体，以使所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体在轴向和/或在垂直于轴的方向上的接触长度达到前述步骤中算出的长度并使各柱的轴向互相平行，其中，所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体分别由间叶细胞与上皮细胞中的任一种构成；以及在所述支持载体内部对所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体进行培养。
5.制造在一个方向上具有期望长度的牙齿的方法，所述方法包括下述步骤 在支持载体内部以紧密接触的方式配置近似柱状的第一细胞集合体和近似柱状的第二细胞集合体，以使各柱的轴向互相平行，所述第一细胞集合体与第二细胞集合体在轴向上的接触长度约为所述期望长度的75% -125%，其中，所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体分别由间叶细胞与上皮细胞中的任一种构成；在所述支持载体内部对所述第一细胞集合体及所述第二细胞集合体进行培养。
6.如权利要求5所述的方法，其中，在所述支持载体内部配置所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体的步骤包括下述步骤制作多个构造体，所述构造体是在所述支持载体内部配置所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体而形成的；测定所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体在轴向上的接触长度；以及选择所述测定的接触长度约为所述期望长度的75% -125%的构造体。
7.制造单个牙齿的方法，所述方法包括下述步骤在支持载体内部以紧密接触的方式配置第一细胞集合体和第二细胞集合体，其中，所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体分别由间叶细胞与上皮细胞中的任一种构成；以及在所述支持载体内部对所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体进行培养； 并且，将所述第一细胞集合体与所述第二细胞集合体的最大接触长度设定在预定值以下。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述细胞集合体均为细胞凝集块。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，所述间叶细胞和所述上皮细胞中的至少一种来源于牙胚。
10.修复口腔内的牙齿缺损部分的方法，所述方法包括将采用权利要求1-9中任一项所述的方法制得的牙齿移植至所述缺损部分。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述方法是将采用权利要求1-9中任一项所述的方法制得的牙齿在不分成2个以上部分的情况下照原样移植至所述缺损部分。
12.如权利要求10或11所述的方法，其中，所述间叶细胞和所述上皮细胞来源于具有所述缺损部分的个体。
13.如权利要求10-12中任一项所述的方法，其中，所述口腔内为非人类的哺乳动物的口腔内。
14.设计方法，该方法用于设计在预定条件下制造在一个方向上具有期望长度的牙齿的方法，所述设计方法包括在以下情况下确定为制造具有期望尺寸的牙齿所需的第一细胞集合体和第二细胞集合体在一个预定方向上的接触长度的方法，所述情况为在支持载体内部以紧密接触的方式配置所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体，且所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体分别由间叶细胞与上皮细胞中的任一种构成；并且，所述确定接触长度的方法包括下述步骤通过改变所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体在预定方向的接触长度来制作多种构造体，其中，所述构造体是在所述支持载体内部以紧密接触的方式配置所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体而形成的，所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体分别由间叶细胞与上皮细胞中的任一种构成；在所述支持载体内部分别对所述多种构造体支持载体进行培养；测定前述步骤中制造的牙齿在所述方向上的长度，并求出该长度与所述接触长度的相关关系；基于所述相关关系，算出为制造在一个方向上具有期望长度的牙齿所需的所述第一细胞集合体与所述第二细胞集合体的接触长度。
15.设计方法，该方法用于设计在预定条件下制造单个牙齿的方法，其中，所述设计方法包括在以下情况下确定为制造单个牙齿所需的第一细胞集合体和第二细胞集合体的最大接触长度的方法，所述情况为在支持载体内部以紧密接触的方式配置所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体，且所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体分别由间叶细胞与上皮细胞中的任一种构成；并且，确定所述最大接触长度的方法包括下述步骤通过改变所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体的最大接触长度来制作多种构造体，其中，所述构造体是在支持载体内部以紧密接触的方式配置所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体而形成的，所述第一细胞集合体和第二细胞集合体分别由间叶细胞与上皮细胞中的任一种构成；在所述支持载体内部分别对所述多种构造体进行培养；测定前述步骤中制造的牙齿的个数，以求出为制造该单个牙齿所需的所述第一细胞集合体与所述第二细胞集合体的最大接触长度。
16.如权利要求14或15所述的方法，其中，所述间叶细胞和所述上皮细胞中的至少一种来源于牙胚。
全文摘要
本发明的目的在于提供制造在一个方向上具有期望长度的牙齿的方法。本发明公开了制造在一个方向上具有期望长度的牙齿的方法，所述方法包括下述步骤在支持载体内部以紧密接触的方式配置第一细胞集合体和第二细胞集合体，其中，第一细胞集合体和第二细胞集合体分别由间叶细胞与上皮细胞中的任一种构成；以及在所述支持载体内部对所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体进行培养；并且，所述方法通过调节所述第一细胞集合体和所述第二细胞集合体在预定方向上的接触长度来调节牙齿的尺寸。
文档编号C12N5/077GK102300592SQ20108000594
公开日2011年12月28日 申请日期2010年1月14日 优先权日2009年1月28日
发明者中尾一久, 辻孝 申请人:株式会社器官再生工学